Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. (Обзор литературы) Биохимические закономерности формирования адаптационных реакций к действию высоких температур. биологически активные добавки (бад) - как способ повышения естественной рези стентности организма к гипоксии стр. 12.
1.1 Биохимические основы оценки изменения функционального состояния организма при повышении внешней температуры стр. 13.
1.2 Современный подход к коррекции гипоксических состояний стр . 24.
1.3 Биологически активные добавки (БАД). Современный взгляд на проблему стр. 34.
ГЛАВА 2. Материалы и методы стр. 40.
2.1 Краткая характеристика экспериментального материала .стр. 40.
2.2 Биохимические методы исследования стр. 41.
2.2.1 Методы фракционирования эритроцитов и субклеточных структур органов стр. 41.
2.2.2 Методы определения метаболитов стр. 42.
2.2.3 Методы определения активности ферментов стр. 44.
2.2.4 Статистическая обработка материала стр. 46.
ГЛАВА 3. Метаболические изменения в эритроцитах экспериментальных животных после вскармливания бад «Ко Ою » стр. 47.
ГЛАВА 4. Состояние обменных процессов в миокарде экспериментальных животных после вскармливания бад «Ко Ою» стр. 64.
ГЛАВА 5. Метаболические изменения в печени экспериментальных животных после вскармливания бад «Ко Qio» стр. 80.
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов стр. 96.
Выводы стр. 119.
Список литературы стр.121.
- Биохимические основы оценки изменения функционального состояния организма при повышении внешней температуры
- Современный подход к коррекции гипоксических состояний стр
- Биохимические методы исследования
- Методы определения активности ферментов
Введение к работе
Кроме того, глобальное загрязнение поверхностных вод и суши, локальные радиоактивные загрязнения приводят к загрязнению продуктов питания токсическими элементами, пестицидами, антибиотиками, радионуклидами, которые также обуславливают ослабление защитных сил организма и в первую очередь снижают антитоксическую функцию печени, легких, почек, кожи (Доценко В.А., 1990).
С учётом этого целесообразно выделение самостоятельного научного направления, занимающегося решением комплекса медико-биологических проблем, связанных с экологически обусловленным снижением резистентности организма к патогенным воздействиям. Это станет базой для разработки новых перспективных профилакти-
6 ческих технологий, направленных на повышение резистентности к действию факторов малой интенсивности (Литвинов Н.Н., 2003).
На современном этапе в качестве такой технологии наиболее перспективным представляется использование биологически активных добавок (БАД) к пище (Тутельян В.А., Княжев В.А., 2000; Ецко Л.А., Зарбаилова Н.К., 2001; Олейник Л.В., Бурунсус В.Д., 2001; Они-щенко Г.Г., 2002; Соловьёва В.А., 2003; Спиричев В.Б., 2006; Самсонов М.А., 2007).
Широкое внедрение БАД как способа повышения резистентности организма ставит вопрос об адекватном выборе методов и разработке новых методических подходов для оценки состояния функциональных систем организма. В процессе диагностики здоровья необходимо четкое понимание динамики становления индивидуального здоровья, что возможно с использованием методов конституциональной и донозоло-гической диагностики. В этой связи четко обозначается проблема понимания закономерностей метаболических процессов в соответствии со структурой питания, имеющей региональные и этнические особенности, определение характера влияния на них тех или иных БАД (Ми-кашинович З.И., 2003; Тутельян В.А. и др., 2005).
При анализе влияния на организм тех или иных факторов существенный интерес представляет изучение роли системы крови в формировании компенсаторно-приспособительных реакций. Эритроциты, тесно контактируя со всеми тканями и вступая с ними в морфофунк-циональные взаимоотношения, собственной качественной и количественной перестройкой отражают происходящие в организме физиологические и патологические изменения (Микашинович З.И., 1989; Гар-кави Л.Х. и соавт., 1990; Денисюк В.И., 1991; Гаркави Л.Х. и соавт., 1998; Камышников B.C., 2000; Крыжановский Г.Н., 2001, 2002; Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., 2004; Павлюченко И.И., 2005). Полифункциональная роль эритроцитов в механизмах адаптации и компенсации
в условиях гипоксии, газотранспортных процессах и осуществлении других жизненно важных функций - объясняет высокую информативность результатов изучения функциональных изменений в этих клетках (Kilfer C.R., Snyder L.M., 2000).
Накопленный фактический материал показывает, что в механизме воздействия факторов окружающей среды на живой организм и изменении условий его жизнедеятельности имеется общее патогенетическое звено - избыточная продукция свободных радикалов (Велич-ковский Б.Т., 2001), а состояние адаптационно-компенсаторного потенциала организма на клеточном уровне определяется мощностью механизмов антиоксидантной защиты (Нагорная Г.Ю., 2005).
Для понимания особенностей метаболической реакции в ответ на то, или иное воздействие необходимо также использование принципов системного подхода к изучению обменных процессов в органах с разной функциональной специфичностью, характеризующейся неодинаковой мощностью ферментных систем. Известно, что тонкое регулирование скорости синтеза макроэргических соединений (Fairbanks G., 1980) с учетом потребности в них отдельных органов зависит от взаимодействия системы энергообеспечения с другими системами: нервной, эндокринной, сердечно - сосудистой, дыханием.
Воздействие высоких температур, по существу, является «тепловым» стрессом. Основу неспецифического ответа составляет стресс-реакция, которая сопровождается выбросом катехоламинов и глю ко корти ко идо в для мобилизации энергетических ресурсов организма (Вагиш М., 1990; Андреева Л.И., 1999). Кроме того, в процессе формирования повреждения при действии высоких температур, помимо развития стресс-реакции, определенный вклад вносит тканевая гипоксия (Баркалая А.И., Верхотин М.А., 1984; Козлов Н.Б., 1990), действию которой подвержены, прежде всего, органы со сниженным кровотоком.
В связи с этим, целью работы: является выяснение характера метаболической реакции органов (печени, миокарда) и эритроцитов периферической крови крыс под влиянием БАД "Ко Q10" при различном температурном воздействии.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
Установить особенности влияния БАД "Ко Q10" на газотранспортную функцию эритроцитов периферической крови у ин-тактных крыс и находящихся в условиях изменения температурного режима окружающей среды.
Определить активность ферментов и содержание субстратов углеводно - энергетического обмена в миокарде и печени после вскармливания пищевой добавки интактным животным и крысам, подвергшимся действию повышенных температур.
Выяснить характер влияния БАД на процессы гликолиза и гликогенолиза в эритроцитах у животных исследуемых групп.
Оценить состояние ферментативной антиоксидантной защиты в тканях и клетках крови у животных, содержащихся в физиологических условиях и при повышенной температуре окружающей среды после приёма БАД.
Отобрать информативные биохимические показатели для оценки функционального состояния организма после приёма БАД.
Научная новизна:
В работе впервые показано, что период адаптации к хронической тепловой гипоксии характеризуется резким угнетением обмена глюкозы в миокарде, что может иметь решающее значение в формировании патобиохимических сдвигов.
Впервые проведен комплексный анализ влияния БАД "Ко Q10" на направленность метаболических процессов, характеризующих со-
стояние газотранспортной функции крови, особенности углеводно-энергетического обмена, антиоксидантной системы в эритроцитах и тканях в физиологических условиях, а также в условиях гипертермии.
Показано, что функционально-метаболические механизмы компенсаторных реакции в эритроцитах и органах после приёма БАД неоднозначны и характеризуются функциональной специфичностью.
Научно-практическая значимость работы.
Полученные данные будут способствовать расширению представлений о формировании биохимических механизмов адаптации к тепловой гипоксии. Фактический материал о влиянии исследуемой БАД будут использованы для разработки схем целенаправленного воздействия на отдельные звенья гомеостаза в условиях стресс-реакции, а также разработки и внедрении в практику высокоинформативных критериев для оценки функционального состояния систем организма после приёма БАД.
Результаты исследования будут использоваться в учебном процессе кафедры общей и клинической биохимии №1 и кафедра клинической диетологии ФПК РостГМУ.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены на II-ой, ІІІ-ей, IV-ой, Vll-ой международных конференциях «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2003, 2004, 2005, 2008 гг.); на 58-й, 59-й, 60-й Итоговых конференциях студентов, молодых учёных и специалистов (Ростов-на-Дону, 2004, 2005, 2006 гг.); на первой научно-практической конференции «Рациональное и лечебное питание» (Ростов-на-Дону, 2006 г.), на конференции кафедры общей и клинической биохимии №1 РостГМУ.
Публикации
По материалам данного исследования опубликовано 17 печатных работ, из них 4 в центральной медицинской печати, 5 работ опубликовано в моноавторстве.
Основные положения, выносимые на защиту:
В условиях физиологического течения обменных процессов БАД «Ко Q-io» способствовала увеличению концентрации 2,3-ДФГ и лактата в эритроцитах, что указывает на повышение эффективности кислородтранспортных процессов в крови.
Изменения активности ферментов углеводного обмена в миокарде у интактных животных после приёма БАД «Ко Q10» свидетельствует об увеличении мощности внутриклеточных энергосистем.
В гепатоцитах животных после приёма БАД «Ко Q10» наблюдаются изменения хода реакций антирадикальной защиты, в основе которых лежит увеличение мощности глутатион-зависимого ферментативного звена.
Характер изменения активности ферментов углеводного обмена в эритроцитах и миокарде животных с тепловым стрессом после приёма БАД «Ко Q10» свидетельствует о снижении тяжести гипоксии.
В условиях теплового стресса БАД «Ко Q10» способствовала адекватному перераспределению энергетических ресурсов в органах и активации наиболее эффективных механизмов антирадикальной защиты для поддержания жизненно важных органов в условиях стресс-реакции.
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, выводов, обсуждения результатов, библиографического указателя, содержащего 183 отечественных и 121 зарубежных источников. Объём диссертации -158 печатных страниц ф. А4, включая 12 таблиц, 1 схему и 21 рисунок.
Биохимические основы оценки изменения функционального состояния организма при повышении внешней температуры
Живой организм состоит из множества функциональных систем, координированная работа которых обеспечивает относительное постоянство внутренней среды. В каждый данный момент всегда имеется доминирующая функциональная система, которая определяет деятельность организма в удовлетворении его доминирующей потребности и подчиняет себе деятельность других функциональных систем. Это положение отчетливо проявляется тогда, когда организм попадает в новые, необычные для него условия окружающей среды. При этом формируются специфические и неспецифические реакции (Самсонов М.А., 2004).
В основе специфической реакции при действии высокой температуры лежит формирование доминирующей функциональной системы, деятельность которой направлена на поддержание постоянной температуры тела. Основу неспецифической реакции организма на действие необычных для данного организма факторов среды составляет стресс-реакция, которая сопровождается выбросом катехолами-нов и глюкокортикоидов для мобилизации энергетических ресурсов организма. Когда в условия высокой температуры попадает неадаптированный организм, первой включается поведенческая реакция -стремление уйти из неблагоприятной зоны. При невозможности осуществления этой реакции и продолжающемся действии высокой температуры формируется функциональная система, ответственная за адаптацию к высокой температуре. Система включает в себя: афферентной звено (терморецепторы кожи и верхних дыхательных путей, афферентные пути); центральное звено - гипоталамус (центр терморегуляции), в котором интегрируется периферическая и центральная афферентная информация об изменении температуры тела и формируются терморегуляторные эффекторные сигналы (Ivanov К.Р. et al.,1981; Shymusiak R., Satinoff E., 1982; Kanosue K. et al., 1991; Vasi-lenko V.Y., 1994; Boulant J.A., 1996); эфферентное звено (органы кровообращения и аппарат испарительного охлаждения). Деятельность данной системы направлена на поддержание температурного гомео-стаза в основном за счет мобилизации механизмов теплоотдачи (Me 15 ерсон Ф.З., 1986). Осуществление поведенческой реакции ухода из зоны опасности и напряженность работы доминирующей системы, способствуют развитию стресс-реакции и возникновению парадоксальной ситуации, при которой по сути своей защитная реакция становится одной из причин перегревания организма. При определенной интенсивности и длительности теплового воздействия образуется своего рода порочный круг: высокая внешняя температура — напряженная работа доминирующей функциональной системы — нарастающая тревога опасности - стресс-реакция — увеличение теплопродукции — дополнительная нагрузка на доминирующую систему — функциональная недостаточность доминирующей системы и т. д. Если интенсивность теплового воздействия выше предела, к которому данный организм может адаптироваться, то порочный круг прогрессивно расширяется за счет вовлечения других функциональных систем и, по-видимому, составляет основу патогенеза, развивающейся при этом гипертермии.
Наряду с общей активацией гипофиз - адреналовой системы тепловой стресс характеризуется особенностями секреции отдельных гормонов по сравнению с другими видами стресса, например, с Холодовым. Вагиш М. (1990) показал, что пребывание здоровых людей в сауне в течение 1 ч вызывает генерализованную эндокринную реакцию, в которой преобладает повышенное содержание циркулирующего пролактина и гормона роста, временное увеличение концентрации катехоламинов с быстрым снижением к концу срока нагрева, неуклонный рост содержания кортизола и незначительное повышение уровня инсулина к 30 мин нагрева. Андреева Л.И. и соавт. (1999) указывают на увеличение содержания в сыворотке крови практически здоровых добровольцев кортизола более чем в 2 раза и уровня тиреотропного гормона при повышении внешней температуры до +45 С. Одним из интегральных показателей, определяющим скорость течения обменных процессов, является потребление кислорода. Важно отметить, что при «остром» действии высокой внешней температуры происходит перераспределение кровотока - значительное увеличение периферического и уменьшение кровотока во внутренних органах (Карлыев К.М., 1985; Гурин В.Н., 1989). Это явление влечет за собой также перераспределение доставки кислорода - значительное увеличение доставки кислорода к тканям с низким уровнем обмена и уменьшение - с высоким уровнем обменных процессов. Показано, что действие высокой температуры стимулирует в печени и почках биохимические реакции с низким КПД энергообмена: разобщение процессов окисления и фосфорилирования, активация гликолиза (Шепелев А.Н., 1978). Об активации анаэробного пути энергообмена свидетельствует и увеличение концентрации молочной кислоты в крови людей, подвергшихся действию высокой температуры (Пефтиев И.Ф., 1990; Куш-ниренко Е.А., и соавт., 1991). Соболевский В.И., Елисеев В.В. (1984) в эксперименте на животных показали, что во время гипертермии при сниженном функциональном резерве миокарда и низкой тепловой устойчивости организма появляются признаки гипоксии миокарда, а также очаговые нарушения метаболизма и повреждение митохондриаль-ных мембран кардиомиоцитов. Из вышесказанного следует, что в процесс формирования повреждения при действии высоких температур, помимо развития стресс - реакции, определенный вклад вносит тканевая гипоксия (Баркалая А.И., Верхотин М.А., 1984; Козлов Н.Б., 1990), действию которой подвержены, прежде всего, органы со сниженным кровотоком.
Следствием снижения снабжения тканей и органов кислородом является дисфункция митохондрий, для которой характерна последовательность фазных изменений активности митохондриальных ферментных комплексов, приводящая к подавлению процессоа аэробного синтеза энергии, энергозависимых функций и метаболизма клетки (Лукьянова Л.Д. и соавт., 2007). Митохондриальные нарушения при гипоксии коррелируют с фазными изменениями концентрации различных компонентов адениннуклеотидного пула, изменение соотношения которых предшествует изменениям других функционально-метаболических параметров, контролирующих жизнедеятельность клетки (Lukyanova L.D., Dudchenko A.M., 1999).
Исследованиями последних лет показано, что в процессе реализации адаптивных изменений происходит активация внутриклеточных сигнальных систем (кальциевой и фосфоинозитольной регуляторных систем, глутаматэргической, аденозин- и ацетилхолинэргических сигнальных путей), которые включаются в каскадные механизмы внутриклеточной сигнальной трансдукции, ответственной за экспрессию генов и формирование геномзависимых адаптивных признаков (Da Silva et al., 2003).
Современный подход к коррекции гипоксических состояний стр
Адаптация к гипоксии является сложным и многогранным процессом, в который вовлекаются в первую очередь ЦНС, системы кровообращения и дыхания, железы внутренней секреции и иммуноком-петентные клетки (Агаджанян Н.А. и соавт., 1987; Меерсон Ф.З., 1993; Новиков B.C. и соавт., 1998).
Согласно современным представлениям, гипоксия - это явление, в основе которого лежит нарушение функций энергетического аппарата, связанное с последовательно развивающейся в условиях дефицита кислорода или в присутствии токсических веществ инактивацией митохондриальных ферментных комплексов (от 1-го к IV-му), что приводит к нарушению аэробного синтеза энергии, энегрозависимых функций, метаболизма и структуры клеток. Биоэнергетические нарушения являются главным механизмом любых форм гипоксии и их коррекция в этих условиях (восстановление процессов образования энергии в клетке и их удержание на уровне, адекватном для реализации энергозависимых функций) - ведущим звеном в антигипоксической защите (Лукьянова Л.Д., 1999).
Среди группы антигипоксических средств выделяют: антигипок-санты прямого действия (специфические), то есть вещества, обладающие способностью в условиях гипоксии корригировать электрон-транспортную функцию дыхательной цепи и активность её ферментов; а также неспецифические, которые модулируя различные функционально-метаболические процессы, тоже могут приводить к опосредованной нормализации энергетического обмена при гипоксии (например, антистрессорные и нейротропные препараты, вазоактивные вещества - регуляторы системы кровообращения при гипоксии). На ранних стадиях гипоксии используются средства, снимающие блок переноса ё в первом митохондриальном ферментном комплексе или активирующие сукцинатоксидазный путь окисления, то есть II митохондри-альный ферментный комплекс. На более поздних стадиях первоочередными становятся мероприятия, направленные на стабилизацию мембран, ограничение утечки из митохондрий убихинона и цитохрома С, подавление реакций деградации адениннуклеотидов, антиоксидантную защиту (Чернобаева Г.Н. и др., 1995; Лукьянова Л.Д., 1999; Маньковская И.Н. и др., 1999; Morin D. et al., 2001).
По мнению А.В. Стефанова и соавт. (1990) для повышения резистентности организма к гипоксии необходимо соблюдение трёх основных условий: 1) ликвидация лактат-ацидоза; 2) ингибирование процессов ПОЛ; 3) увеличение скорости диффузии кислорода через биологические барьеры.
Так, показано, что введение в кровеносное русло липосом, содержащих фосфолипиды, улучшает снабжение организма кислородом, снижает степень тканевой гипоксии за счёт улучшения условий диффузии кислорода через биологические барьеры, ингибирования свободно-радикальных реакций, снижения накопления в тканях недо-окисленных продуктов обмена и перешеного окисления липидов (Пожаров В.П. и др., 1990; Стефанов А.В. и др., 1990).
Караев А.Л. и соавт. (1991) на трёх моделях гипоксических состояний (гипоксическая, гемическая, цитотоксическая гипоксия) показали положительную динамику в течение обменных процессов в клетках мозга мышей после введения препарата D.L-карнитина. Эффект препарата авторы связывают со стабилизирующим влиянием на фосфолипиды мембран за счёт активации каскада арахидоновой кислоты.
Платоновой Р.Д., Медведевым О.С. (1992) показано улучшение состояния системной гемодинамики в условиях «фармакологической тренировки» к гипоксии препаратом «Мексамин», являющегося аналогом серотонина. По мнению авторов, реакция сердечно-сосудистой системы на гипоксию осуществляется по двум направлениям: 1) с превалированием сосудистого компонента (уменьшение сердечного индекса, уменьшение мышечного и кожного кровотока, повышение периферического сопротивления); с превалированием сердечного компонента (увеличение сердечного индекса, уменьшение общего сосудистого тонуса). В случае применения мексамина эти пути прослеживаются достаточно чётко: при однократном применении адаптация к гипоксии осуществляется с преобладанием сосудистого компонента, а в случае тренировки - с преобладанием сердечного компонента. Высокой эффективностью в условиях гипоксии обладают препараты, содержащие янтарную кислоту (Лукьянова Л.Д. и др., 1990; Коваленко А. и др., 2001). По мнению авторов, в условиях кислородной недостаточности, когда наблюдается ограничение NAD-зависимого окисления в дыхательной цепи, антигипоксический эффект достигается за счёт усиления компенсаторного для энергетики сукцинатокси-дазного пути окисления.
Савченкова Л.В. (1996) сообщает о высокой эффективности комбинации биофлавоноида кверцетина с аскорбиновой кислотой в условиях экспериментальной гипоксической гипоксии в сочетании с гипотермией. По мнению автора, такая комбинация предупреждает нарушение окислительного гомеостаза, лежащего в основе патогенеза ги-поксического синдрома.
Ряд авторов указывает на высокую эффективность в условиях гипоксии препарата «Триметазидин», предупреждающего нарушение энергетического обмена и активацию перекисного окисления липидов (Смирнов А.В., 1998). В данном аспекте особый интерес представляют убихиноны, в частности, коэнзим Q10 - компонент дыхательной цепи митохондрий, участвующий в синтезе аденозинтрифосфата и обладающий антиок-сидантным действием (Gvozdikov К. et al., 2001). Биохимии убихинонов, биомедицинским аспектам и перспективам их применения посвящены работы Федурова В. В. (1974; 1977; 1980), Когана Л.М. и соавт. (1983), Донченко Г.В. и соавт. (1991), Обольникова Е.А., Кожухова А.И. (1993).
Биохимические методы исследования
Для определения активности ферментов углеводного обмена и антирадикальной защиты в тканях готовили гомогенат в соотношении 1г ткани : 9мл охлаждённого физиологического раствора (Саркисян О.Г., 2000). Для определения активности ферментов в миокарде кар-диомиоциты отделяли от соединительной ткани по методу, предложенному Messina Е. et al (2004). Для этого, отмытое от крови физиологическим раствором сердце, разделяли на фрагменты размером 2-3 мм3, помещали в трис-НСІ буфер (рН=7,5), содержащий 2 мг/мл трип сина и 1 мг/мл коллагеназы и инкубировали 30 мин при t = 37 С. Реакцию останавливали на холоду, инкубационную смесь подвергали центрифугированию при 1500 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбирали.
Митохондрии клеток выделяли дифференциальным центрифугированием после гомогенизации на холоду в солевом растворе (0,15 М KCI и 10 мМ трис-НСІ). Для удаления ядерной фракции гомогенаты центрифугировали 15 мин при 640 д. Фракцию митохондрий выделяли в течение 25 мин при 20 000 g с двукратным промыванием средой выделения (Черникова Л.М., 1985).
Эритроциты получали из крови, стабилизированной гепарином (10 ед/мл), отделяли от лейкоцитов и тромбоцитов в 3% желатиновом растворе с последующим центрифугированием (320 д, 15 минут). После отделения плазмы и верхнего слоя клеток эритроциты отмывали охлаждённым физиологическим раствором (2-3 раза). Для получения плотного осадка при определении субстратов отмытые эритроциты центрифугировали при 640д в течение 30 минут.
Учитывая высокую лабильность содержания субстратов энергетического обмена в крови и тканях, все операции, связанные с фиксацией и последующей гомогенизацией проводили на холоду при 4 С, используя охлаждённые растворы необходимых реактивов. 2,3-дисЬосфоглицерат (2,3-ДФГ) определяли неэнзиматическим методом Dyse, Bessman в модификации Лугановой И.С, Блиновым М.Н. (1975), основанным на колориметрическом измерении содержания фосфатов в хлорнокислом экстракте после удаления кислоторас-творимых нуклеотидов абсорбцией на активированном угле «Норит». Содержание 2,3-ДФГ расчитывали по разнице величины общего и неорганического фосфата. Результаты выражали в мкмоль/мл плотного осадка эритроцитов. Пировиноградную кислоту (ПВК) определяли по Фридеману и Хаугену в модификации П.М. Бабаскина (А.С. СССР №877436, 1981). Безбелковый экстракт получали воздействием 10% раствора трихло-руксусной кислоты с последующей обработкой его дифенилгидрози-ном (ДНФГ) и фотометрией смеси. Для повышения точности способа и ускорения его в реакционную смесь, содержащую ДНФГ, вносили водный раствор щёлочи. Результаты выражали в мкмоль/мл плотного осадка эритроцитов или мг белка.
Содержание молочной кислоты определяли по реакции с пара-оксидифенилом, описанной В.В. Меньшиковым (1987), результат выражали в мкмоль/мл плотного осадка эритроцитов или мг белка.
Содержание гемоглобина (Нв) определяли в гемолизате по методу, описанному Лугановой И.С, Блиновой М.Н. (1975), спектрофо-тометрически при длине волны 540 нм в присутствии аммиачного раствора. Концентрацию гемоглобина выражали в г/мл гемолизата.
Определение концентрации восстановленного глутатиона (GSH) проводили методом Ellman G.L.(1959). В основе метода лежит реакция 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты (5,5-ДТНБК) с восстановленным глутатионом, в ходе которой образуется окрашенное соединение с максимумом поглощения при длине волны =412 нм. Концентрацию восстановленного глутатиона выражали в мкмоль/ г НЬ или мг белка.
Водорастворимый белок определяли методом Лоури (Lowry С. et al., 1953). Метод основан на образовании комплекса, имеющего характерную синюю окраску, интенсивность которой прямо пропорциональна содержанию белка. Интенсивность окрашивания измеряли при длине волны 680 нм. Результаты выражали в мг/мл гомогената.
Методы определения активности ферментов
Для определения активности СДГ и ЦХО использовали суспензию митохондрий (400-500 мг белка в 0,2 мл суспензии). Активность ферментов гликолиза и гексозомонофосфатного шунта, а также анти-оксидантной защиты определяли в надосадочной жидкости. Для определения активности ферментов в эритроцитах использовали 20% ге-молизат, приготовленный на бидистиллированной воде.
Активность иитохромоксидазы (ЦХО) (КФ 1.9.3.1) определяли спектрофотометрически в реакции с диметил-п-фениленом по принципу метода Р.С. Кривченковой (1977) в описании З.И. Микашинович (1989). Результаты выражали в нмоль/мг белка в мин. Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) (КФ 1.9.3.1) определяли спектрофотометрически по принципу метода, предложенного Nordmann et al. (1951) в описании З.И. Микашинович (1989). Метод основан на использовании тетразолиевого синего C40H32O2CI2 (мол. вес 727,63) и феназинметасульфата для создания системы переноса электронов от субстрата дегидрогеназной реакции к соли тетразолия с образованием формазана. Активность фермента выражали в нмоль/мг белка в мин.
Активность гексокиназы (ГК) (КФ 2.7 Л Л) определяли спектрофотометрически по прописи И.С. Лугановой (1971) в описании О.Г. Саркисяна (2000). Результаты выражали в мкмоль НАДФН+Н/ г НЬ или мг белка в мин. Активность фосфогексоизомеразы (ФГИ) (КФ 5.3.1.9) определяли по методу Р.Ф. Езерского (1960) в описании З.И. Микашинович (1989), основанном на измерении образовавшегося фруктозофосфата в ферментативной реакции и последующем его окрашивании в реакции Селиванова. По количеству фруктозофосфата судят об активности ФГИ. Результаты выражали в мкмоль/г НЬ или мг белка за час инкубации. Активность Фосфорилазы (КФ 2.4.1.1) определяли по принципу метода Фердмана Д.Л. и Сонина Е.Ф. (1957), описанного З.И. Микаши-нович (1989). Метод основан на определении уменьшения количества фосфорной кислоты в смеси под влиянием фосфорилазы. Активность фермента выражали в мкмоль связанного фосфора/ г НЬ или мг белка за час инкубации.
Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (гл-6-фДГ) (КФ 1.1.1.49) определяли по методу Корнберга Л. в модификации Захарьина Ю.Л.(1967) спектрофотометрически по степени восстановления НАДФ в ферментативной реакции с глюкозо-6-фосфатом в присутствии ионов магния. Активность выражали в мкмоль НАДФН+Н/г Нв или мг белка в мин.
Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) (КФ 1.15.1.1) проводили по методу Misra Н.Р. и Fridovich J. (1972), в модификации Саркисяна- О.Г. (2000). Метод основан на способности СОД тормозить автоокисление адреналина в щелочной среде при рН -10,2. За единицу активности СОД принимали такое количество фермента, которое при добавлении к реакционной смеси изменяет на 50% скорость автоокисления адреналина в стандартных условиях. Результат выражали в условных единицах на 1 г Нв или мг белка в мин.
Определение активности каталазы (КФ 1.11.1.6) основано на том, что неразложившаяся перекись водорода образует с молибдатом аммония (NH4)6Mo7024 комплексное соединение, окрашенное в желтый цвет, интенсивность которого определяли колориметрически на ФЭК КФК 2-МП при длине волны А,=400 нм (Королюк и др., 1988). Активность каталазы рассчитывали, исходя из коэффициента миллимолярной экстинкции =22,2 103 ммоль"1 см"1 и выражали в мКат/г НЬ или мг белка в мин.
Активность глутатионпероксидазы (ГПО) (КФ 1.11.1.9) определяли по методу, предложенному (Карпищенко А.И. и др., 1999). Метод основывается на способности ГПО катализировать реакцию взаимодействия восстановленного глутатиона с гидроперекисью третичного бутила. Активность фермента при этом может быть оценена по изменению содержания восстановленного глутатиона в пробах до и после инкубации с модельным субстратом с помощью цветной реакции с ди-тиобис-нитробензойной кислотой (ДТНБК). Активность данного фермента выражали в мкмоль израсходованного в реакции субстрата на г Нв или мг белка в мин.
Активность глутатионредуктазы (ГР) (КФ 1.6.5.2)определяли спектрофотометрически по скорости окисления НАДФН+Н методом Юсуповой Л.Б. (1989) при длине волны 340 нм на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Ленинград). Активность фермента выражали в мкмоль превращения НАДФН+Н на г НЬ или мг белка в мин.
Определение активности миелопероксидазы (МПО) (КФ 1.11.1.7) в плазме крови проводили по методу Klebanoff (1971), описанному Шафран М.Г. и Лызловой С.Н.(1975), результаты выражали в мкмоль/мг белка в минуту.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили согласно общепринятым методам с определением средней арифметической, ошибки средней с использованием программы STATISICA версия 6.0. О достоверности отличий учитываемых показателей сравниваемых групп судили по величине t-критерия Стьюдента после проверки распределения на нормальность. Статистически достоверными считали отличия, соответствующие оценке ошибки вероятности р 0,05
