Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Свободи орадикальные процессы иих регуляция в биологических системах ...12
1.1.1 .Характеристика основных форм свободных радикалов 12
1.1.2. Перекисное окисление липидов 19
1.1.3 .Регуляция свободнорадикальных процессов 21
1.2. СКЭНАР - перспективы использования в кардиологии 28
Глава 2. Материалы и методы исследования 34
2.1. Постановка эксперимента на животных 34
2.2. Клинические исследования 35
2.2.1.Методика проведения СКЭНАР-терапии у больных с ИБС 36
2.3. Получение биологического материала 37
2.3.1. Получение плазмы крови 37
2.3.2. Приготовление суспензии эритроцитов и гемолизата 37
2.3.3. Приготовление гомогенатов тканей 38
2.4. Методы исследования 38
2.4.1. Экстракция липидов 38
2.4.2. Определение содержания диеновых конъюгатов 38
2.4.3. Определение содержания шиффовых оснований 39
2.4.4. Определение содержания малонового диальдегида 40
2.4.5. Определение активности супероксиддисмутазы 41
2.4.6. Определение активности каталазы 42
2.4.7. Определение оксидазной активности церулоплазмина 43
2.4.8.Определение содержания гемоглобина 43
2.4.9. Определение содержания общего белка 44
2.4.10. Определение суммарно пероксидазной активности 45
2.4.11. Хемилюминесцентный анализ в системе Н2СЬ -люминол 45
2.4.12. Метод активированной дрожжами хемилюминесценции цельной крови 46
2.4.13. Определение структурных параметров мембран эритроцитов...46
2.4.14. Измерение интенсивности флуоресценции белков суспензии эритроцитов 48
2.4.15. Определение содержания молекул средней массы 48
2.4.16. Определение содержания мочевины 49
2.5. Статистическая обработка результатов. 50
Глава 3. Интенсивность свободнорадикального окисления и стуктурно-функциональные свойства мембран эритроцитов при оксидативном стрессе у крыс и корригирующее действие СКЭНАР-терапии 51
3.1. Интенсивность НгОг-люминол-индуцированной хемилюминесценции в различных тканях крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе и СКЭНАР-воздействии 51
3.1.1. Интенсивность Н202-люминол-индуцированной хемилюминесценции в различных тканях крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе 51
3.1.2. Влияние СКЭНАР-терапии на интенсивность Н202-люминол-индуцированной хемилюминесценции в различных тканях крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе 52
3.2. Интенсивность активированной дрожжами ХЛ крови крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе и СКЭНАР-воздействии 54
3.2.1. Интенсивность активированной дрожжами ХЛ крови крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе 54
3.2.2. Влияние СКЭНАР-воздействия на активированную дрожжами хемилюминесценцию крови крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе 55
3.3. Интенсивность ПОЛ в различных тканях крыс при ГБО- индуцированном окислительном стрессе и СКЭНАР-воздействии 57
3.3.1. Интенсивность ПОЛ в различных тканях крыс при ГБО- индуцированном окислительном стрессе 57
3.3.2. Влияние СКЭНАР-воздействия на интенсивность ПОЛ в различных тканях крыс, подвергнутых ГБО-индуцированному оксидативному стрессу 59
3.4. Уровень внеэритроцитарного гемоглобина и суммарной пероксидазной активности в плазме крови крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе и СКЭНАР-воздействии 62
3.4.1. Уровень внеэритроцитарного гемоглобина и суммарной перокси-дазной активности в, плазме крови крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе 62
3.4.2. Влияние СКЭНАР-воздействия на уровень ВЭГ и СПА в плазме крови крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе 63
3.5. Активность антиоксиданти ой системы в плазме крови, эритроцитах и тканях крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе и СКЭНАР- воздействии 64
3.5.1. Активность антиоксидантной системы в плазме крови, эритроцитах и тканях крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе 64
3.5.2. Влияние СКЭНАР-воздействия на активность антиоксидантной системы в различных тканях крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе 67
3.6. Структурное состояние мембран эритроцитов крыс при ГБО- индуцированном оксидативном стрессе и СКЭНАР-воздействии 68
3.6.1. Структурное состояние мембран эритроцитов* крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе 68
3.6.2. Влияние СКЭНАР-воздействия на структурное состояние мембран эритроцитов крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе...69
3.7. Уровень окислительной модификации белков эритроцитов крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе и СКЭНАР-воздействии 70
3.7.1 Уровень окислительной модификации белков эритроцитов крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе 70
3.7.2 Влияние СКЭНАР-воздействия на уровень окислительной модификации белков эритроцитов крыс, подвергнутых ГБО-индуцированному ок-сидативному стрессу 72
3.8. Содержание молекул средней массы в плазме крови и мочевины в тканях крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе и СКЭНАР- воздействии 74
3.8.1. Содержание молекул средней массы в плазме крови и мочевины в различных тканях крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе.74
3.8.2. Влияние СКЭНАР-воздействия на содержание молекул средней массы в плазме крови и мочевины в различных тканях крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе 76
Глава 4. Свободнорадикальное окисление в крови и структурно-функциональные свойства мембран эритроцитов у больных ишемической болезнью сердца на фоне стандартного лечения и в сочетании со СКЭНАР-терапией 80
4.1. Интенсивность Н202-люминол-индуцированной хемилюминесцен-ции в плазме крови больных ИБС на фоне стандартного лечения и в сочетании со СКЭНАР-терапией 80
4.2. Интенсивность свободнорадикальных процессов в крови больных ИБС на фоне стандартного лечения и в сочетании со СКЭНАР-терапией 83
4.3. Активность антиоксидантной системы в плазме крови и эритроцитах больных ИБС на фоне стандартного лечения и в сочетании со СКЭНАР-терапией 87
4.4. Структурное состояние мембран эритроцитов больных с ИБС на фоне стандартного лечения и в сочетании со СКЭНАР-терапией 90
4.5. Синдром эндогенной интоксикации у больных ИБС на фоне стандартного лечения и в сочетании со СКЭНАР-терапией 95
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов 100
Выводы 135
Список литературы 136
- .Характеристика основных форм свободных радикалов
- Приготовление суспензии эритроцитов и гемолизата
- Влияние СКЭНАР-терапии на интенсивность Н202-люминол-индуцированной хемилюминесценции в различных тканях крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе
- Интенсивность Н202-люминол-индуцированной хемилюминесцен-ции в плазме крови больных ИБС на фоне стандартного лечения и в сочетании со СКЭНАР-терапией
Введение к работе
В настоящее время принято считать, что главным фактором в развитии патологических состояний является оксидативный стресс. Его проявление выражается в сдвиге динамического равновесия в системе антиоксиданты -прооксиданты в сторону свободнорадикального окисления, продукты которого обладают широким спектром повреждающего действия. Это приводит к снижению стабильности и изменению физико-химических свойств мембран: микровязкости, текучести, мембранного потенциала, полярности внутренних областей мембраны и др.
К числу «свободнорадикальных патологий» относится ишемическая болезнь сердца (ИБС). Внедрение в клиническую практику новых мощных антиангинальных средств, позволило добиться определенных успехов в лечении ИБС. Воздействовать на активность свободнорадикальных процессов и систему антиоксидантной защиты возможно как при помощи фармакологических препаратов, так и при использовании немедикаментозных методов лечения (Jackson G.1999). Однако, у большой группы больных, несмотря на современное антиангинальное лечение, наблюдается учащение и утяжеление приступов стенокардии (Хрипун А.В., 2003). В связи с этим, проблема поиска новых подходов к оценке нарушений гомеостаза и оптимизации терапии ИБС сохраняет свою актуальность.
Воздействовать на активность свободнорадикальных процессов и систему антиоксидантной защиты возможно как при помощи фармакологических препаратов, так и при использовании немедикаментозных методов лечения, в связи с чем обсуждаются вопросы применения новых методик, в том числе электронейростимуляции (Jackson G.1999).
В литературе имеются указания на успешное применение электронейростимуляции аппаратом СКЭНАР (самоконтролируемый энергонейроадап-
тивный регулятор) при лечении больных кардиологического профиля (Гринберг ЯЗ., 1999; Тараканов А.В. и др., 2003). Однако, воздействие СКЭНАР -терапии на биохимические процессы, в частности, на свободнорадикальное окисление и структурное состояние биомембран у больных ИБС, изучено недостаточно.
В соответствии с этим несомненный теоретический и практический интерес представляет изучение влияния СКЭНАР — воздействия на свободнорадикальное окисление липидов, активность антиоксидантнои системы и структурное состояние мембран эритроцитов, как адекватной модели плазматических мембран у больных ИБС.
Целью работы явилось исследование влияния СКЭНАР - воздействия на свободнорадикальные процессы в тканях и структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов при окислительном стрессе.
Исследования проводились в две стадии:
в эксперименте - при моделировании окислительного стресса с возможностью оценки постгипероксического эффекта (6 суток);
в клинике - у пациентов с ИБС, разделенных на группы по выбранной методике лечения.
Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи:
Изучить влияние СКЭНАР - воздействия на интенсивность свобод-норадикальных процессов и ПОЛ по параметрам хемилюминесценции и по содержанию молекулярных продуктов - ДК, МДА и ШО в тканях и эритроцитах крыс при окислительном стрессе.
Определить активность антиоксидантных ферментов - супероксид-дисмутазы, каталазы, церулоплазмина в тканях и эритроцитах крыс при ок-сидативном стрессе и СКЭНАР - воздействии.
Исследовать эффективность СКЭНАР-воздействия на окислительную модификацию белков эритроцитов, а также стабильность и структурное состояние мембран эритроцитов у крыс при ГБО - индуцированном стрессе.
Исследовать эффективность СКЭНАР-воздействия на содержание МСМ в плазме крови крыс при окислительном стрессе.
Исследовать влияние СКЭНАР — воздействия на свободнорадикаль-ные процессы, сбалансированность в системе прооксиданты - антиоксидан-ты, а также на уровень МСМ и ЦИК, стабильность и структурное состояние мембран эритроцитов у больных ИБС.
.Характеристика основных форм свободных радикалов
Характеристика основных форм свободных радикалов Изменение спина одного из электронов, находящихся на % - орбиталях в молекуле кислорода, приводит к образованию возбуждённого синглетного состояния, энергия которого на 96,3 кДж/М больше энергии основного триплетного состояния.
Синглетный кислород метастабилен, переход его в триплетное состояние сопровождается инфракрасной (1270 нм), а рекомбинация - красной (635 нм) люминесценцией. Высокая реакционная способность синглетного кислорода приводит к тому, что он легко вступает в окислительные реакции с органическими соединениями, принимает участие в инициировании ПОЛ и возникновении биохемилюминесценции, в повреждении нуклеиновых кислот (преимущественно повреждается гуанин) и канцерогенезе (Eisenberg et al., 1992), ингибирует Са2+-АТФазу (Kukreja et al., 1992). 02 активно взаимодеи ствует с холестерином, нарушая стабильность биомембран. При взаимодействии 02 с аминокислотами в составе белков в первую очередь окисляются гистидин и триптофан, несколько слабее — метионин, тирозин и цистеин (Basnet al., 1991).
В живых организмах не выявлено специализированных механизмов наработки синглетного кислорода. Вместе с тем во многих ферментативных реакциях (с участием каталазы, пероксидаз), а также в реакциях с АКМ и ци-тохромами, показано возникновение О 2 как сопутствующего продукта (Kiryu etal., 1999).
Ингибиторами х02 в биологических системах являются фенольные ан-тиоксиданты: токоферолы, убихиноны, а также аскорбат, белки и гистидин (Красновский, 1994). Однако в качестве наиболее эффективных тушителей выступают полиеновые углеводороды, и в первую очередь - р -каротин, который взаимодействует с синглетным кислородом со скоростью ЗхЮ10 IVT c"1, при этом одна молекула 3 -каротина может инактивировать более 1000 молекул 02, прежде чем подвергнется окислительной деструкции (Осипов и др., 1990).
Присоединение одного электрона к молекуле кислорода в основном со-стоянии приводит к образованию супероксидного анион-радикала (02 ), который при взаимодействии с протоном переходит в гидроперекисный радикал (НОг ), представляющий собой слабую кислоту (Осипов и др., 1990). Так как анион Ог имеет заряд, он плохо мигрирует через мембраны, в отличие от гидроперекисного радикала НО 2. 02 - более реакционноспособное соединение, чем молекулярный кислород, время его жизни в биологических субстратах около 10 6 с. Будучи относительно слабым окислителем, Ог во многих биологических системах может выступать в качестве донора электронов, восстанавливая ряд соединений.
В клетках супероксидный анион является промежуточным продуктом многих биохимических реакций - таких, как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, а также метаболизма ксенобиотиков, в частности диквата (Dimascio et al., 1997). Однако основные источники его образования - ферментативные системы: НАДФН-оксидаза фагоцитирующих клеток, ксантиноксидаза, митохондриальная цитохром-с-оксидаза и микро-сомальные монооксигеназы (Владимиров и др., 1991).
Генерация Ог при активации НАДФН - оксидазы фагоцитов играет важную роль в реализации их микробицидного, цитотоксического и иммуно-регуляторного действия (Матюшин и др., 1996; Меньшикова и др., 2006). Так, супероксидный анион участвует в наработке хемотаксических пептидов, индуцирует синтез интерлейкин-1-подобного фактор, усиливает митоген-стимулированную пролиферацию лимфоцитов и сам является митогеном (Burdon, 1992), способствует межлимфоцитарному распространению вируса иммунодефицита человека путём увеличения количества синцитиальных связей (Kameoka, 2004).
Будучи, нуклеофильным соединением, 02 окисляет липопротеины сыворотки и фосфолипиды мембран (Boes et al., 1989) ,что приводит к разрушению эритроцитов (Verma et al., 1993), выходу лизосомальных ферментов (Kalra et al., 1990) и образованию цитотоксинов. Повышение соотношения НО 2/ 02 в липидной фазе (Dix et al., 1993) может быть причиной высокой активности 02 в отношении окисления липидов мембран. Супероксидный анион-радикал может окислять гемоглобин (НЬ) в метгемоглобин (MetHb) и обратно восстанавливать его в гемоглобин (Kim et al., 1994):
Главной системой защиты от 02 является супероксиддисмутаза (СОД), церулоплазмин (ЦП), а также убихинон и аскорбиновая кислота.Присоединение двух электронов к молекуле кислорода или одного электрона к аниону 02 сопровождается образованием двухзарядного аниона 02" . В свободном состоянии такой анион не существует, так как энергия связывания атомов кислорода становится отрицательной. Присоединяя протоны, он переходит в гидроперекисный анион Н02 или Н202 при этом при физиологических значениях рН вследствие высокого рКа преобладает Н202. Перекись водорода относят к окислителям средней силы; в отсутствии каталазы и ионов металлов переменной валентности она относительно стабильна и, будучи неионизированной молекулой, легко проникает сквозь гидрофобные мембраны и может мигрировать в клетки и ткани (Sundqvist, 1991), при этом наличие нейтральных адуктов Н202 (например, гистидина) обеспечивает её проникновение внутрь клеток даже в присутствии каталазы (Schubert et al., 1991).
В живых организмах источниками Н2С 2 служат ферментативные реакции с оксидазами, переносящими два электрона на молекулу кислорода: ксантиноксидаза, оксидазы L-аминокислот и ряд других, а также реакция дисмутации, катализируемая СОД (Sohal et al., 1990). Около 80% Н202, генерируемой фагоцитами в очаге воспаления, образуется в реакции дисмутации 02 супероксиддисмутазой. В клетках эукариот ферменты, нарабатывающие перекись водорода, локализованы преимущественно в пероксисомах. Эти внутриклеточные структуры диаметром от 0,1 до 1,7 мкм имеют однослойную мембрану, содержат широкий спектр ферментов и выполняют самые разнообразные функции (Del Rio et al., 1992).
При действии Н202 в клетках наблюдается снижение интенсивности гликолиза в результате инактивации альдегиддегидрогеназы и уменьшения содержания лактата; индукция процессов ПОЛ приводит к изменению физических свойств цитоплазматических мембран (Blok, 1991), в результате чего ингибируется трансмембранный перенос анионов (Demiera et al., 1992), но увеличивается проницаемость для макромолекул (Wilson et al., 1990); возрастает внутриклеточная концентрация Са" , что приводит к активации фосфо-липаз и фосфоинозитидного обмена (Музыкантов и др., 1992); наблюдается истощение пула АТФ, что сопровождается гибелью клеток (Гамалей и др., 1996).
Приготовление суспензии эритроцитов и гемолизата
После отбора плазмы крови, осадок эритроцитов ресуспендировали в 10 мл охлажденного 150 мМ раствора NaCl в 0,01 М трис-HCl буфере рН 7,4 и центрифугировали каждый раз по 10 мин при 3000 об/мин. Процедуру повторяли трижды. Плотный осадок эритроцитов лизировали 0,001 М раствором гистидина в 0,001 М трис-HCl буфере в соотношении 1 : 100 при 4 С в течение 1 часа. Полученный 1% гемолизат использовали для дальнейших исследований. 2.3.3. Приготовление гомогенатов тканей Мозг и печень крыс промывали в ледяном физиологическом растворе и высушивали фильтровальной бумагой. Для получения 10%-ных гомогенатов тканей навески печени и мозга после предварительного размельчения гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 10-кратном объёме (вес ткани/объём) физиологического раствора на холоду. Часть полученных гомогенатов обрабатывали тритоном Х-100 (конечная концентрация 0,1%) и инкубировали в течение 10 минут при 37С на водяной бане, затем центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. Для определения активности ферментов использовали надосадочную жидкость.
Экстракция липидов Экстракцию липидов проводили по Bliqh Е., Dyer WJ. (1959). Пробы (0,25 мл) плазмы крови, гемолизата или гомогената ткани помещали.в стеклянные стаканчики с 1,35 мл дистиллированной воды. Стаканчики ставили на магнитную мешалку, добавляли 4 мл метанола, 2 мл-хлороформа и суспендировали 3 мин. Затем к пробам добавляли 2 мл хлороформа, 2 мл воды и оставляли на 24 часа для экстракции при +4С. После экстракции отбирали нижний хлороформный слой, содержащий липиды, шприцем с длинной иглой. В хлороформном липидном экстракте определяли содержание продуктов ПОЛ.
Определение содержания диеновых конъюгатов Метод основан на свойствах сопряженных двойных и тройных связей, входящих в состав гидроперекисей, интенсивно поглощать в УФ-области с характерным максимумом 232 нм.
Для определения количества ДК 2 мл хлороформного экстракта липидов выпаривали на роторном испарителе, затем растворяли сухой осадок липидов смесью метанол-гексан в объемном соотношении 5:1 (Стальная И.Д., 1977). Пробы фотометрировали на спектрофотометре ДН -7 Beckman (США) при длине волны 232 нм. Контролем,являлась смесь метанол-гексан. Содержание диеновых конъюгатов выражали в н моль/мл в плазме крови, в нмоль/мг гемоглобина (НЬ) в гемолизате и в нмоль/мг белка в тканях мозга и печени. Расчет количества ДК проводили по формуле:
Определение содержания шиффовых оснований Шиффовы основания (флуоресцирующие продукты ПОЛ) являются стабильными или «конечными» продуктами» свободнорадикального окисления. Это олигопротеидные и липопротеидные комплексы, образующиеся в результате взаимодействия бифункциональных продуктов ПОЛ - диальдеги-дов типа МДА с низко- или высокомолекулярными клеточными компонентами, содержащими свободные аминогруппы (фосфатидилэтаноламин, фос-фатидилсерин, сфингозин, аминокислоты, пептиды, белки, нуклеотиды иДР-) Метод основан на том, что флуоресцирующие продукты ПОЛ - шиффовы основания - обладают характерными спектрами возбуждения и испускания флуоресценции с максимумом в областях 360 нм и 440 нм, соответственно. Спектры флуоресценции исследуемого образца представляют собой суммы спектров различных веществ липидной природы, окисляющиеся до шиффовых оснований.
Хлороформный экстракт помещали в кювету спектрофлуориметра и измеряли интенсивность флуоресценции при 440 нм и возбуждении 360 нм (Bidlack W.R., Tappel A.L., 1973) на спектрофлуориметре Hitachi 650-60 (Япония). В качестве стандарта использовали раствор сульфата хинина, содержащего 1 мг вещества в 1 мл 0,1 М H2SO4. Результаты выражали в относительных единицах флуоресценции на 1 мл плазмы, на 1 мг гемоглобина (в гемолизате) и на 1 мг белка в тканях мозга и печени.
Влияние СКЭНАР-терапии на интенсивность Н202-люминол-индуцированной хемилюминесценции в различных тканях крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе
СКЭНАР-воздействие не оказывало влияния на значения интенсивности и светосуммы ХЛ в плазме крови и светосуммы в ткани мозга крыс. Величина быстрой вспышки в мозге после действия СКЭНАРа уменьшалась на 36%, в печени увеличивалась на 29%. Светосумма, измеренная в ткани печени была ниже контрольного значения на 25% (табл. 2).
Животные, получившие сеансы СКЭНАР-терапии после воздействия гипербарической оксигенации, отличались по показателям интенсивности НоОг-люминол-индуцированной хемилюминесценции от крыс других групп следующим образом. Таблица Влияние СКЭНАР - терапии на интенсивность Н2Ог - люминол-индуцируемой хемилюминесценции (ХЛ) в различных тканях крыс при ГБО — индуцированном оксидативном стрессе, п=8-15, - достоверность изменений показателя по сравнению с контролем; Pi - достоверность изменений показателя по сравнению с сеансом ГБО; р2 - достоверность изменений показателя по сравнению с 6-ми сутками после ГБО. По сравнению с контрольной группой достоверные изменения получены только в отношении интенсивности ХЛ в мозгу — снижение высоты быстрой вспышки на 31%. По сравнению с действием ГБО, наблюдалось четкое снижение параметров НгСЬ-люминол-индуцированной хемилюминесценции во всех тканях, за исключением светосуммы ХЛ в ткани мозга, где изменение отсутствовали. Интенсивность быстрой вспышки ХЛ снижалась в плазме на 39%, в мозге на 35%, в печени на 31%. Светосумма уменьшалась на 22% в плазме и на 33% в печени.
По сравнению с 6-ми сутками после оксидативного стресса изменение параметров ХЛ в плазме и светосуммы в ткани мозга были недостоверны. Интенсивность быстрой вспышки снижалась в ткани мозга на 26%, в ткани печени имела тенденцию к снижению на 17%. Светосумма ХЛ в ткани печени имела тенденцию к повышению на 18%. Таким образом. СКЭНАР-воздействие не оказывает существенного влияния на интактных животных и способствует нормализации свободнора-дикальных процессов в крови и тканях крыс после оксидативного стресса.
Интенсивность активированной дрожжами ХЛ крови крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе и СКЭНАР-воздействии Интенсивность активированной дрожжами ХЛ крови крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе Гипербарическая оксигенация не вызывала изменения латентного периода ХЛ активированной дрожжами сразу после оксидативного стресса. На 6-е сутки после сеанса ГБО отмечена тенденция к достоверности роста латентного периода на 25% (табл. 2). Напротив, светосумма и высота медленной вспышки в первые сутки после оксидативного стресса возросли на 32% и 28% соответственно, а на 6-е сутки статистически не отличались от контроля. В сравнении сеанса ГБО (0,5 МПа, 1 час) на 6-е сутки после действия ГБО латентный период ХЛ был выше на 30%, светосумма ниже на 25%, а изменения высоты медленной вспышки носили недостоверный характер.
Таким образом, оксидативный стресс приводил к усилению активированной дрожжами ХЛ по всем показателям, за исключением латентного периода, однако на 6-е сутки происходила нормализация скорости развития свободнорадикальных реакций, латентный период, наоборот, достоверно возрастал.Влияние СКЭНАР-воздействия на активированную дрожжами хемилюминесценцию крови крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе
В отличие от ГБО СКЭНАР-воздействие приводило к значительному увеличению латентного периода (264%) по сравнению с контролем. Та же тенденция была отмечена в группе крыс, получавших СКЭНАР после ГБО-индуцированного оксидативного стресса: по сравнению с ГБО отмечен рост латентного периода на 111%, по сравнению с 6-ми сутками после действия ГБО - на 62%, по сравнению с контрольным значением — на 103% (табл. 3).
Применение СКЭНАРа у интактных животных не изменяло величину светосуммы активированной дрожжами ХЛ. Однако, при воздействии СКЭНАРа на крыс, перенесших оксидативный стресс, наблюдалось ее снижение: по сравнению с действием ГБО на 72%, по сравнению с 6- ми сутками после действия и контролем на 62% (табл. 3).
СКЭНАР-терапия вызывала снижение высоты медленной вспышки активированной дрожжами ХЛ как у интактных животных — на 32%, так и у крыс после окислительного стресса: в сравнении с действием ГБО на 72%, в сравнении с 6-ми сутками - на 65%, в сравнении с контролем на 64% (табл. 3). Таблица З Влияние СКЭНАР-воздействия на активированную дрожжами хеми-люминесценцию крови крыс при ГБО-индуцированном оксидативном стрессе, n=8-15, М±т
Таким образом, СКЭНАР-воздействие оказывало положительное влияние на показатели активированной дрожжами ХЛ у интактных животных. После перенесенного оксидативного стресса СКЭНАР-воздействие способствовало замедлению развития свободнорадикальных реакций. 3.3. Интенсивность ПОЛ в различных тканях крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и СКЭНАР-воздействии Интенсивность ПОЛ в различных тканях крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе
Действие гипербарической оксигенации (0,5 МПа, 1 час) сопровождалось активизацией ПОЛ, приводя к достоверному накоплению первичных, вторичных и конечных продуктов окисления липидов в плазме крови, мембранах эритроцитов и тканях крыс (табл. 4,5).
Интенсивность Н202-люминол-индуцированной хемилюминесцен-ции в плазме крови больных ИБС на фоне стандартного лечения и в сочетании со СКЭНАР-терапией
Многочисленными исследованиями показано, что ишемия миокарда сопровождается усилением свободнорадикальных процессов (Биленко М.В., 1989; Зенков Н.К. и др., 2001). Развивающаяся после каждого эпизода тран-зиторной ишемии реперфузия миокарда сопряжена с еще большей активацией свободнорадикальных процессов и выбросом в кровь активированных кислородных метаболитов и липопероксидов на фоне недостаточности и дисфункции антиоксидантной системы.
В настоящей главе проведен сравнительный анализ состояния проокси-дантной, антиоксидантной систем и структурно-функциональных свойств эритроцитов в крови у пациентов с ИБС для оценки степени выраженности оксидативного стресса, а также исследовано влияние стандартного комплексного лечения и СКЭНАР-терапии на активность систем продуцирования активных форм кислорода и антиоксидантной системы. Для диагностики оксидативного стресса и мониторинга его последствий был использован высоко информативный комплекс биохимических и биофизических методов, который включал хемилюминесцентный анализ в системе Н202-люминол, определение молекулярных продуктов ПОЛ, активности антиоксидантной системы, степени выраженности эндогенной интоксикации, а также определение стабильности и структурного состояния мембран эритроцитов. 4.1. Интенсивность НгОг-люминол-индуцированной хемилюминесценции в плазме крови больных ИБС на фоне стандартного лечения и в сочетании со СКЭНАР-терапией
Исследование интенсивности ХЛ как высокочувствительного показателя наличия свободных радикалов и состояния активности про- и антиокси-дантных систем организма играет важную роль в изучении кинетики и механизмов свободнорадикальных реакций (СРР) (Журавлёв, 1991; Diaber et al.,2004). В плазме крови больных ишемической болезнью сердца интенсивность ХЛ регистрировали по амплитуде быстрой вспышки (Н) и светосумме (Sm). В ходе выполнения настоящей работы установлено, что у больных с ИБС наблюдается увеличение интенсивности и светосуммы Н202-люминол-индуцированной хемилюминесценции плазмы крови (табл. 12). В 1 группе интенсивность быстрой вспышки превышала таковую у доноров на 52%, во 2 группе на 65%. Светосумма была выше у больных, отнесенных нами в 1 группу на 55%, во 2 группу - на 75%. Известно, что величина быстрой вспышки находится в прямой зависимости от концентрации активных форм кислорода и окисляемости липидов и обратно пропорциональна содержанию природных антиоксидантов в исследуемом биосубстрате. По данным литературы светосумма Н202-люминол-индуцированной хемилюминесценции указывает на скорость расходования,липидных радикалов вследствие их взаимодействия друг с другом в реакции диспропорционирования или с эндогенными антиоксидантами (Барабой В.А. и др., 1991; Владимиров Ю.А. и др., 1991), т.е. ХЛ обусловлена, в первую очередь, уровнем прооксидантов в системе. Таким образом, у больных с ИБС в крови наблюдается повышенная генерация активных кислородных метаболитов, которые способны инициировать ПОЛ в биомембранах и липопротеидах крови. Таблица 12 Интенсивность НгОг-люминол-индуцированной хемилюминесценции в плазме крови больных ИБС на фоне стандартного лечения (1 группа) и в со четании со СКЭНАР-терапией (2 группа) п=11-25 М±т
Показатели Доноры Клинические группы группа 2 группа исх. Фон после лечения исх. фон после лечения Н, мм % измененийР % измененийPi 43,8+4,1 66,7+4,4+52 0,001 52,6+7,08 0,1 0,1 72,2+7,6+65 0,01 53,9+3,07+230,05 р 0,1-25 0,05 SmxlO4 имп. За 500 с % измененийР % измененийPi 84,1+2,1 130,2+9,1+55 0,001 110,32+12,8+31 0,05 р 0,1 од 147,0+24,1+75 0,05 98,6+9,2 0,1-330,05 р 0,1 Примечание: здесь, и в таблицах 13-19: р — достоверность изменений показателя по сравнению с группой доноров; Pi — достоверность изменений показателя относительно начала лечения. После проведенного лечения по стандартной схеме достоверных изменений интенсивности и светосуммы хемилюминесценции относительно исходного фона не зарегистрировано. Светосумма имела тенденцию к повышению относительно здоровых лиц на 31%. На основании этих данных можно предположить, что стандартное медикаментозное лечение больных ИБС не вызывает угнетение генерации АФК и снижение интенсивности СРО. Включение СКЭНАР-терапии в комплексное лечение ИБС привело к снижению интенсивности хемилюминесценции на 25% относительно исходного уровня, однако нормализации данного показателя не произошло: отмечалась тенденция к его повышению относительно доноров на 23%. Что же касается светосуммы, то она напротив, имела тенденцию к снижению на 33% относительно исходного значения и достоверно не отличалась от таковой величины в плазме крови доноров. Это указывает на уменьшение уровня СРП в обследуемой клинической группе и может быть связано с состоянием «напряжения» организма (фаза относительно устойчивой адаптации) (Милютина и др., 2005) в процессе проводимых лечебных мероприятий больных ИБС.
Таким образом, хемилюминесцентный анализ показал, что после применения СКЭНАР-терапии наблюдалось угнетение генерации АФК, которое, по-видимому, приводило к позитивным сдвигам в системе свободнора-дикальные процессы - антиоксидантная система и способствовало ослаблению признаков оксидативного стресса. Интенсивность свободиорадикальных процессов в крови больных ИБС на фоне стандартного лечения и в сочетании со СКЭНАР-терапиёй Исследование СРП, в частности ПОЛ у пациентов с ИБС необходимо для углубления сведений о механизмах развития метаболических нарушений при данном виде патологии, а также для коррекции возможных осложнений этого заболевания. В результате проведенных исследований установлено, что при ИБС наблюдается значительная активация свободнорадикального окисления в плазме крови и эритроцитах, выражающаяся в увеличении концентрации первичных, вторичных и конечных продуктов окисления липидов (табл. 13, 14). В сравнении с группой доноров в плазме крови пациентов 1 группы содержание диеновых конъюгатов было на 86% выше. Значения, полученные при определении вторичных и конечных продуктов окисления, превышали таковые у доноров на 52% и 31% соответственно. В крови больных, отнесенных нами во 2 группу, прослеживалась аналогичные изменения, однако они были более выраженными. Содержание ДК в плазме превышало контрольные значения на 106%, МДА - на 63%, ШО -на 40%. В эритроцитах пациентов 1 группы содержание ДК на 73% превышало контрольный уровень, концентрация МДА и ШО была соответственно на 27% и 37% выше аналогичных показателей донорской группы. Сходные данные получены нами и при обследовании пациентов 2 группы. Содержание продуктов ПОЛ в эритроцитах превышало норму по уровню ДК на 126%, по концентрации МДА на 43%, по содержанию ШО на 33%. Таким образом, при коронарном синдроме наблюдается повышение интенсивности свободнорадикальных процессов в крови, которое сопровождается достоверным накоплением молекулярных продуктов ПОЛ и напрямую зависит от развития патологического процесса и выраженности ишемическо-го повреждения миокарда.
Похожие диссертации на Влияние СКЭНАР-воздействия на свободнорадикальные процессы в тканях и мембранах эритроцитов при окислительном стрессе
