Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Структура пероксидазы. 9
1.2 Физико-химические свойства растительных пероксидаз . 13
1.3 Распространение и субклеточная локализация пероксидазы. 14
1.4 Биологическая и физиологическая роль пероксидазы. 17
1.4.1 Возможные механизмы участия пероксидазы в формировании ответных реакций на действие различных стресс-факторов . 26
1.5 Биосинтез пероксидазы 30
1.6 Молекулярная гетерогенность пероксидазы. 35
1.7 Механизм действия пероксидазы. 40
2 Материалы и методы исследования 45
2.1 Объекты исследования и метод культивирования ткани 45
2.2 Выделение цитоплазматической фракции пероксидазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina 45
2.3 Выделение и очистка пероксидазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina. 46
2.4 Определение концентрации белка 46
2.5 Определение активности пероксидазы 47
2.6 Электрофоретические методы 47
2.6.1 Электрофорез в пластинах полиакриламидного геля 47
2.6.2 Определение активности пероксидазы в геле 48
2.7 Иммунологические методы 49
2.7.1 Получение антисыворотки к пероксидазе 49
2.7.2 Радиальная иммунодиффузия в агаровом геле 50
2.7.3 Определение концентрации антигена 50
2.8 Радиоиммунонлогические методы 51
2.8.1 Определение параметров кругооборота пероксидазы и общего белка 51
2.9 Статистическая обработка результатов эксперимента. 52
3 Результаты исследования 52
3.1 Активность пероксидазы и концентрация белка в динамике роста Rauwolfia serpentina, штамм К-47 52
3.1.1 Подбор оптимальных условий определения активности 55
3.2 Изучение кинетики пероксидазы на разных этапах роста каллусной культуры Rauwolfia serpentina. 56
3.3 Молекулярная гетерогенность пероксидазы в процессе культивирования штамма Rauwolfia serpentina. 56
3.4 Выделение и очистка пероксидазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina. 57
3.4.1 Подбор оптимальных условий высаливания 58
3.5 Определение молекулярной массы пероксидазы, влияние температуры и рН на ее активность. 62
3.5.1 Влияние температуры и рН на активность пероксидазы. 64
3.6. Изучение параметров обмена пероксидазы и общего белка в культуре ткани Rauwolfia serpentina 64
3.7 Исследование специфичности антипероксидазной сыворотки 66
3.8 Влияние высоко- и низкотемпературного шока на активность и кинетические параметры пероксидазы в культуре ткани Rauwolfia serpentina. 67
3.8.1. Влияние температурного шока на кинетические параметры пероксидазы 70
3.9 Молекулярная гетерогенность пероксидазы при высоко- и низкотемпературном шоке. 71
3.10 Обмен внутриклеточного белка и пероксидазы в культуре ткани Rauwolfia serpentina 72
4. Обсуждение результатов 75
5. Выводы
6. Список литературы
- Физико-химические свойства растительных пероксидаз
- Возможные механизмы участия пероксидазы в формировании ответных реакций на действие различных стресс-факторов
- Выделение цитоплазматической фракции пероксидазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina
- Изучение кинетики пероксидазы на разных этапах роста каллусной культуры Rauwolfia serpentina.
Введение к работе
В последние годы внимание исследователей все в большей мере привлекают культивируемые растительные іслетки и ткани. Это связано, с одной стороны, с перспективностью их использования в качестве продуцентов ценных биологически аістивиьіх веществ, а с другой - в качестве модели для изучения молекулярных механизмов протекания тех или иных процессов в растительных клетках.
Изолированные іслетки растений находят все большее применение в качестве модельных систем для изучения не опосредованных другими тканями растения реакций на действие разнообразных внешних факторов. Кроме того, исследование механизмов клеточного метаболизма в дедифферепцировапых т.е. находящихся в стрессовых условиях клетках создает условия для более эффективного развития биотехнологии клеточных культур [65].
Растения рода Raiiwolfia известны как перспективный источник получения многих алкалоидов, применяемых в медицинской практике. В Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии в результате многолетней селекции культуры ткани Rauwofia serpentina получен высокоэффективный штамм - суперпродуцепт антиаритмических алкалоидов. В процессе селекции использованы различные мутагены и иные стрессовые факторы, что привело к существенному изменению биохимических процессов, протекающих в культивируемых клетках Rauwofia serpentina. В рамках осуществления биохимического контроля за состоянием клеточных культур анализировали пероксидазу - один из основных ферментов метаболизма кислорода. Этот фермент принимает участие в каталитическом окислении различных субстратов, таких как фенолы, ароматические амины и др. Факт, что пероксидаза присутствует в микробных, растительных и животных клетках дает основание считать его жизненно важным соединением. Что касается растительной перокеидазы, то одной из основных ее функций является защита растения от различных неблагоприятных факторов абиотической и биотической природы. Имеется много работ, посвященных биологической активности этого фермента, однако анализ синтеза и стабильности пероксидазы ранее ни кем не изучался. Мы полагаем, что такого рода исследования могут быть весьма актуальными, т.к. они дают весьма важную информацию не только об активности, но и о синтезе и распаде пероксидазы в динамике роста клеток. Задачи исследования: В работе были поставлены следующие задачи: Изучить динамику изменения активности, физико-химические свойства и молекулярную гетерогенность пероксидазы в течение роста каллусной культуры Rauvvolfia serpentina.
Выделить и очистить до гомогенного состояния пероксидазу из культуры ткани Rauvvolfia serpentina, изучить ее физико-химические свойства и получить к ней моноспецифические антитела.
Оценить скорость синтеза, распада и время функционирования в клетках ткани Rauvvolfia serpentina.
Исследовать влияние температурного шока на содержание и свойства пероксидазы, ее молекулярную гетерогенность в культивируемых растительных клетках.
Научная новизна. В работе впервые была изучена динамика изменения пероксидазиой активности растущей культуры клеток Rauvvolfia serpentina. Также впервые были изучены такие параметры, как молекулярная гетерогенность, синтез и стабильность пероксидазы. Разработан способ ее выделения и очистки до гомогенного состояния, изучены физико-химические свойства пероксидазпого белка.
В работе изучено влияние низко и высокотемпературного стресса на состояние пероксидазы и общего белка в каллусной культуре ткани Rauvvolfia serpentina. Установлено, что как при низко- так и при высокотемпературном шоке активность пероксидазы повышалась за счет увеличения ее содержания в клетках и изменения активность отдельных изоформ. Показано более выраженное повреждающее действие низкотемпературного шока.
Теоретическая и праісгическая значимость Выполненная работа является теоретическим исследованием. Полученные данные о физико-химических свойствах, скоростях синтеза и распада, времени функционирования и содержания пероксидазы в каллусной культуре ткани Rauvvolfia serpentina позволяют расширить наши представления об обмене индивидуальных белков в культуре растительных клеток.
Кроме того, результаты исследования содержат информацию о влиянии экстремальных температур на состояние растительных клеток, а также о протекторном действии пероксидазы, защищающей клетку от повреждения различными токсическими продуктами, возникающими в результате температурного воздействия.
Учитывая тот факт, что работа проводилась с промышленным штаммом Rauvvolfia serpentina, знание белкового обмена этого штамма может оказать весьма существенную помощь при дальнейших селекционных работах. Кроме того культура ткани Rauvvolfia serpentina может быть использована в качестве источника для получения пероксидазы.
Структура и объем диссертации. Работа изложена па 111 страницах машинописи, содержит 19 таблиц и 24 рисунка . Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает в себя наименований.
Физико-химические свойства растительных пероксидаз
Пероксидаза проявляет не только высокую термостабилыюсть, но и устойчивость к мочевине и додецилсульфату в повышенных концентрациях. В частности, в опытах с пероксидазой, выделенной из проростков кукурузы, было обнаружено, что часть изоформ теряла активность уже при концентрациях мочевины 2-4 М, а другая группа проявляла ее даже в присутствии 8 М мочевины. Предполагают, что последние способствуют нормальному ходу метаболических процессов в растении при низкотемпературном стрессе, так как установлено, что резкое понижение температуры окружающей среды вызывает накопление в растительных клетках мочевины, обладающей, по мнению некоторых исследователей, криопротекторным действием [36].
Широкое практическое применение пероксидазы обусловило необходимость стабилизации нативной структуры фермента, используя современные методы биотехнологии. Показано, что при химической модификации пероксидазы, в ходе которой к ферменту присоединяли инертные белки, в том числе альбумин, полученные растворимые олигомеры сохраняя 100% активности, были в 10 раз стабильнее нативного фермента (56С, рН=7,0) [20]. При дальнейшей иммобилизации олигомеров на Br-CN-Сефарозе стабильность полученного препарата в 30 раз превышала стабильность нативного фермента и в 700 раз - пероксидазы, иммобилизированной без предварительно модификации [20]. Использование специфичность взаимодействия антиген-антитело позволило получить стабильный комплекс Br-CN-Сефароза-антитело-антиген [30].
Пероксидазы растений обладают широким спектром действия в областях рН от 3 до 14 [1], зависящем как от природы объекта, из которого фермент выделен, так и от природы субстрата [24,30,43]. В частности, для пероксидазы, выделенной из плодов томатов, установлено, что при использовании в качестве субстрата пирогаллола, оптимум рН составляет 7,0, гваякола - 5,0, о-диаїшзидина - 4,5 [194]. Поэтому более точной характеристикой является оптимум рН стабильности фермента [43]. К настоящему времени данный показатель определен для пероксидаз грибов, представленных кислыми изоформами. Обнаружено, что профиль их рН стабильности сдвинут в сторону кислых значений рН [10]. Показано [24], что субстратная специфичность пероксидазы ржи к природным субстратам максимальна в щелочной и нейтральных средах, а к искусственным - при кислых значения рН. Таким образом, в нормальных условиях в качестве доноров водорода наиболее интенсивно используются природные феиольпые соединения. Реализация же высокой бензидин-, ПФД-пероксидазной активности становится возможной лишь в случае повреждения или индуцированной (патогеном, экзо- или эндогенными химическими агентами) дисфункции топопласта, что может вызвать подкисление внутриіслеточіюй среды. Эти данные подтверждают важную физиологическую роль растительных пероксидаз при неблагоприятных внешних воздействиях.
Установлено, что локализация пероксидазы в растениях изменяется в зависимости от сезона, вида растения , степени дифференцировки и вида ткани [39]. Так, для льна показано [90] отсутствие пероксидазы в ксилеме корня и преобладание ее в корневом чехлике, эпидермисе и сердцевине, а для хлопчатника - в паренхиматозных клетках [68]. В тканях животных высокое содержание пероксидазы обнаружено в различных секреторных железах [110,156], лейкоцитах [190], эозипофилах [123,146], макрофагах [161], что может указывать на ее участие в защитных реакциях организма. Сравнение животных и растительных клеток выявило большое сходство во внутриклеточном распределении фермента. Как и у растительных пероксидаз, присутствие фермента в эидоплазматическом ретикулуме, аппарате Гольджи, секреторных гранулах клеток животных организмов указывает па принадлежность фермента к экспортируемым белкам. В ряде случаев показано [166], что пероксидаза может выступать в роли интегрального мембранного протеина.
Пероксидаза растительных клеток обнаружена как в цитозоле, так и в некоторых субклеточных органеллах [23,63,102], что косвенно указывает на функциональную связь этого фермента со многими сторонами клеточного метаболизма [39,41]. В частности, присутствие пероксидазы в хлоропластах [29,31] связывают с ее участием в окислительно-восстановительных реакциях в ходе фотосинтеза, в митохондриях [22,29,163] - в энергетическом обмене клетки [1]. Кроме того предполагается участие пероксидазы в метаболизме рибопуклеопротеинов [1]. На возможность участия пероксидазы в специфической ядерной реакции указывают результаты исследования молодых клеток кончиков лука, где наибольшая пероксидазиая активность обнаружена в ядрах. Некоторые авторы высказывают предположение, что щелочные пероксидазы могут выполнять в іслетке функции, сходные с функциями гистонов [1]. Однако другие исследователи считают, что данный факт вызван взаимодействием щелочных изоформ с отрицательно заряженными ядерными компонентами после повреждения клетки [99]. Фермент обнаружен также в вакуолях [55,104,173], в межклеточном пространстве, на плазмолемме [43,100,102,116].
Возможные механизмы участия пероксидазы в формировании ответных реакций на действие различных стресс-факторов
Пероксидазам отводится роль ключевых молекул в процессах быстрой адаптации всего растения или отдельных его органов к изменениям в окружающей среде [100]. Доказано, что при действии стрессовых факторов в клетках растения формируется уникальный стрессовый набор изоформ пероксидазы, обеспечивающих нормальное протекание метаболических процессов. Причем, изменения в изоферментном спектре могут носить как качественный, так и количественный характер [39,99]. У растений же, которые неустойчивы к экстремальным воздействиям, генетического потенциала не хватает для формирования оптимального изоферментного комплекса, что может привести к гибели организма [36]. Полагают, что усложнение изофермеитного спеїора пероксидазы является результатом адаптации растения, тогда как его обеднение характерно для процессов деградации [39]. Существует несколько механизмов индукции изоформ пероксидазы, которые представлены на рис 2.
Как видно из представленной схемы, изменение в изофермептном спеїоре пероксидазы при действии стресс-фаісгоров могут происходить на двух уровнях: молекулярном и молекулярно-генетическом. Первоначально изменения не затрагивают систему трансляции [42]. В частности, показано влияние температуры на секрецию посттрансляциошю модифицированных гликопротеидов растений [147,148], для катионной пероксидазы арахиса установлено меньшая степень гликозилировапия при стрессе [211]. Так же показана возможность переноса отдельных изоформ пероксидазы из одного клеточного компартмеита в другой [43]. На молекулярпо-гепетической стадии ответа клетки на действие стресс-факторов запускается система индуцированного синтеза ряда стрессовых белков, в т.ч. и пероксидазы [39]. Так, в экспериментах с ипгибировапием транскрипции актипомиципом Д и трансляции циїотогексимидом и хлорамфепиколом было обнаружено снижение адаптационных свойств озимой пшеницы при низко- и высокотемпературном стрессе [36]. Необходимо подчеркнуть, что при перестройке изофермеитного спеїора пероксидазы общий уровень активности фермента может изменяться или оставаться неизменным [43].
Возможный механизм контроля пероксидазой ответных реакций растений па действие различных стресс-факторов был предложен Гаспаром [100]. Согласно этой гипотезе, действие стресс-факторов вызывает деполяризацию клеточной мембраны и деградацию ее липопротеидов под действием образующихся свободных радикалов. Это приводит к изменению в клетке соотношения К+/Са2+ и вытеканию из нее растворимых веществ, большинство из которых относится к электронодонорам пероксидазы: фенолы, аскорбиновая кислота, ИУК. Увеличение уровня внутриклеточного кальция, регулирующего процессы секреции и связывания щелочных пероксидаз с мембранами, активирует их секрецию в свободное пространство, где они, взаимодействуя с донорами электронов, утилизируют перекиси. Действуя как АЦГТК-оксидазы, щелочные пероксидазы также вызывают изменения в продукции этилена, который, в свою очередь, регулирует (через механизм запуска синтеза белков) активность кислых пероксидаз и фенилаланинаммиаклиазы, контролируя и процесс лигпификации. Таким образом, как первая стадия ответа на любой стресс происходит активация щелочных пероксидаз. Последующие изменения связанные с метаболизмом двух растительных гормонов - этилена и ауксина, вызывают усиление синтеза кислых пероксидаз как второй, более поздней стадии защиты клетки [100].
Изучение процесса биосинтеза пероксидазы как сложной белковой молекулы является очень трудной задачей. В связи с этим, до настоящего время имеются лишь разрозненные сведения о некоторых этапах биосинтеза
Опыты с клетками суспензионной культуры арахиса [188, 202, 203] показали, что синтез пероксидазы составляет 2 % от общего белкового синтеза. В листьях же арахиса он был в 10 раз меньше - 0,2% [72]. Эти результаты совпадали с результатами других авторов [207], работающих с культурами растительных клеток . Причины повышения скорости синтеза ферментов [58,209] в культурах растительных клеток по сравнению с интактным растением еще не выяснены. Возможно, это связано со значительным увеличением межклеточного пространства и пересадкой клеток раз в две недели на свежую питательную среду [210]. Согласно другой гипотезе [58], фрагменты клеточной стенки постоянно производимые культивируемыми клетками, могут выступать в качестве "элиситоров" и вызывать экспрессию ряда генов, в том числе пероксидазы.
Биосинтез и процессинг пероксидаз растений протекает по механизмам аналогичным для гликопротеидов млекопитающих [99]. Исследования на генетическом [195] и молекулярном [142,188] уровнях показали, что пероксидазы растений кодируются несколькими генами (от двух до пяти), гомология кодирующих участков которых гораздо выше гомологии аминокислотных последовательностей ферментов. Установлено, что в клеточных культурах хрена, арибидопсиса, арахиса и томата гены пероксидазы иитронироваиы в трех сайтах (за исключением генов сильно кислых пероксидаз томата - два нитрона, три экзопа) [7,188,202]. Высоко гомологичные (более 90%) гены образуют тандем на ДНК.
Выделение цитоплазматической фракции пероксидазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina
Исследование проводили па культуре ткани Rauvvolfia serpentina Benth., штамм К-47, стеблевого происхождения, полученной путем многолетней селекции клеток штамма Rauvvolfia К-20 на агаризоваипой питательной среде при пересадке ткани в начале экспоненциальной фазы цикла выращивания. Культуру выращивали в темноте при температуре 26±2С и относительной влажности 70%. Продолжительность одного пассажа составляла 42-45 сут, после чего разрыхлённую ткань массой 5-6 г пересаживали на 100 мл свежей питательной среды. В работе использовали ткань из 3-4 пассажей. Оценку изменения пероксидазной активности и содержания белка проводили в течение 63 дней роста каллусной культуры с интервалом в 7 сут.
Цитоплазматическуто фракцию пероксидазы получали, гомогенизируя ткань на холоду в 0,2 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), в присутствии 0,1% тритона Х-100 ("Serva", Германия) при соотношении ткань-буфер 1:1. Гомогенат центрифугировали при 105000g 20 мин. Остаток ресуспепдировали в том же буфере и центрифугировали. Эту операцию повторяли несколько раз до полного извлечения растворимой пероксидазы. Полученные супериатанты объединяли и рассматривали как цитоплазматическуто фракцию. Осадок суспендировали в 0,2 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 1М NaCl, и оставляли па 1,5 ч при 4С, а затем центрифугировали при 105000g 20 мин. Остаток отмывали тем же буфером до исчезновения реакции с гваяколом на пероксидазную активность. Эту объединенную фракцию обозначали как иоппо-связапиую. Ковалептно-связапную фракцию получали при последующей инкубации промытого осадка в течение 20 ч при 12С в темноте в 0,2 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением 0,1% целлюлазы (Zheng, van Huystee, 1992).
Навеску сырой ткани Р в возрасте от 30 до 35 суток гомогенизировали в охлажденной ступке в 0,2 М цитратном буфере (рН=7,4), содержащем 0,1% тритон Х-100 и 0,001 М Р-меркаптоэтанол, в соотношении 1:1. Гомогенат выдерживали 30 минут при температуре 4С и центрифугировали при 105000 g в течение 45 минут. Из полученного супернатанта выделяли пероксидазу, используя методы фракционного высаливания сульфатом аммония, гельфильтрации на сефадексе G-100 (колонка 30x800 мм), ионообменной хроматографии па диэтиламиноэтилцеллюлозе А-50 (колонка 20x450 мм). На всех этапах выделения и очистки фермента контролировали выход активности пероксидазы [57] и белка [135]. Все операции проводили на холоду при 4С. В результате пероксидаза была выделена и очищена до гомогенного состояния.
Концентрацию белка определяли по методу Лоури [135], используя калибровочную кривую, для построения которой готовили серию проб с различной концентрацией стандартного белка - бычьего сывороточного альбумина.
Активность пероксидазы определяли спектрофотометрическим методом с использованием в качестве субстратов перекиси водорода и гваякола в 0,1 М цитратпо-фосфатпом буфере (van den Berg, van Huystee, 1984). Объем реакционной смеси составлял 2 мл. Реакцию инициировали добавлением 100 мкл раствора фермента соответствующего разведения и измеряли абсорбцию при 470 нм через 1 мин, используя в качестве контроля раствор, содержащий субстраты реакции. Активность фермента рассчитывали по показателю удельного поглощения продукта реакции тетрагваякола (Е47о~26,6 тМ^см"1) (van den Berg, van Huystee, 1984). Оптимальные условия реакции были следующие: Н2О2 - 3 мкмоль, гваякол -40 мкмоль,рН-оптимум - 6,4.
Изучение кинетики пероксидазы на разных этапах роста каллусной культуры Rauwolfia serpentina.
Молекулярная гетерогенность белков-ферментов известна уже более 30 лет. Множественные молекулярные формы возникают в силу ряда причин, которые можно разделить на две категории. К первой относятся причины генетического или первичного уровня. Эти причины связаны с множественностью генов, кодирующих ферменты. Ко второй категории относятся причины посттраисляциопиого или вторичного уровня. Они связаны с модификацией структуры ново синтезированных макромолекул.
При изучении изофермеитиого спектра пероксидазы каллусиых клеток культуры ткани Rauwolfia serpentina было обнаружено три группы изоформ пероксидазы: медленно-, средне- и быстро мигрирующие по отношению к аноду, чьто соответствовало литературным данным [39,84]. Преобладали медленно мигрирующие изоформы. Сдвиг изофермеитиого спектра пероксидазы в сторону более щелочных множественных молекулярных форм связывают с почти полным отсутствием в культивируемых клетках растений процессов лигпификации, в которых непосредственно принимают участие кислые изоформы [9]. Изучение молекулярной гетерогенности пероксидазы сопряжено с рядом проблем. Необходимо учитывать, что количество и характер выявленных изоформ в большой степени зависит от выбранной исследователем техники выделения фермента, когда возможно неспецифическое связывание пероксидазы с мембранными структуры клетки при участии ионов кальция, результатом чего является возникновение на электрофореграммах "новых" изоформ с высокой молекулярной массой [99]. Таким образом, не исключено, что некоторые выявленные нами множественные молекулярные формы пероксидазы являются псевдоизоформами, появление которых вызвано взаимодействием истинных изоформ фермента с различными кативаторами, ингибиторами (в частности, фенолыюй природы) и клеточными органеллами. В частности, при обработке пероксидазы, выделенной из перикарпия томатов, ДТТ и ДС-Na она распадалась на две неидептичпые субъединицы с молекулярными массами 19 и 46 кДа, при этом регистрировалось некоторое снижение активности фермента [127]. В качестве одного из объяснений полученных результатов предполагается ассоциация in vivo молекулы фермента с активатором белковой природы. Изофермептпый спектр пероксидазы зависит также и от методов его анализа (природы и концентрации используемых субстратов, рН, температуры). Так, при исследовании экстратста из листьев шпината в ПААГ было обнаружено 10 изоформ пероксидазы, а при крахмальном гель-электрофорезе - 16 [99]. В настоящей работе выявление множественных молекулярных форм пероксидазы было возможным только в ПЛАТ толщиной 2 мм, - из гелей меньшей толщины происходило вымывание окрашенных полос. Только метод Лиу [13], использованный в данной работе, позволяет легко, без применения сложной аппаратуры определять относительную активность множественных молекулярных форм пероксидазы непосредственно в геле. Однако, даже этот метод не предоставляет однозначного ответа об их активности. В частности, ряд авторов считает, что задержка в появлении отдельных изоформ может быть вызвана не только их малой активностью, по и высокой специфичностью по отношению к одному из субстратов реакции - аскорбиновой кислоте [14]. Как видно из этих примеров, использование электрофоретических методов для характеристики отдельных изоформ пероксидазы не лишено некоторых недостатков, поэтому сейчас все более широкое применение в изучении молекулярной гетерогенности фермента находят иммупохимические методы анализа и методы "пептидных карт" [99]. Интересно сопоставление наших результатов с данными Л.А.Троицкой [], полученными в нашей лаборатории при изучении молекулярной гетерогенности пероксидазы в культуре ткани женьшеня. Количество изоформ в культуре ткани Rauvvolfia serpentina было в два раза меньше, чем в женьшене, однако активность их была значительны выше.
Можно полагать, что обнаруженная нами молекулярная гетерогенность обусловлена наличием истинных изоэизимов пероксидазы, кодируемых различными генами или различными локусами одного гена.
Был разработан и оптимизирован метод выделения и очистки пероксидазы из каллусной ткани Rauvvolfia serpentina. Выделение пероксидазы связано с некоторыми трудностями, обусловленными присутствием в растительной клетке соединений, способных изменять пероксидазпуіо активность, и отделенных от фермента в результате компартментализации. При гомогенизации растительной ткани происходит разрушение клеток и образование достаточно устойчивых связей между пероксидазой и этими соединениями., что очень часто приводит к ипгибировапию фермента [35,99]. С целью стабилизации пероксидазы, гомогенизацию ткани Rauwolfm serpentina проводили в цитратпо-фосфатиом буфере с добавлением (З-меркаптоэтанола и тритона Х-100. Методика получения гомогенного фермента с выходом 20% при степени очистки в 54 раза включала в себя фракционное высаливание сульфатом аммония, гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию.
