Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Микроорганизмы и условия стресса. 9
1.1.1. Температура как фактор стресса. 11
1.1.2. рН среды роста как фактор стресса . 14
1.1.3. Высокие концентрации солей как фактор стресса. 17
1.1.4. Изменение концентрации кислорода как фактор стресса. 19
1.1.5. Давление как фактор стресса. 19
1.1.6. Влияние химических факторов. 20
1.1.7. Влияние радиации. 21
1.2. Биотехнологическое применение организмов, выращенных в 21 условиях стресса.
1.3. Нитратредуктаза - ключевой фермент азотного метаболизма. 25
1.3.1. Ассимиляторная нитратредуктаза бактерий (Nas). 27
1.3.2. Дыхательная мембранносвязанная нитратредуктаза бактерий (Nar). 30
1.3.3. Диссимиляторная периплазматическая нитратредуктаза бактерий (Nap) 33
1.3.4. Ассимиляторная нитратредуктаза (Euk-NR) эукариот. 36
1.3.5. Дисимиляторная нитратредуктаза эукариот. 38
1.4. Строение активного центра нитратредуктазы. 39
1.5. Изменение свойств и структуры нитратредуктазы под воздействием факторов стресса. 41
2. Материалы и методы исследования
2.1. Реактивы, используемые в работе. 45
2.2. Объекты исследований и условия их выращивания. 45
2.2.1. Fusarium oxysporum штамм 11 dn 1. 45
2.2.2. Дрожжи Rhodotorula glutinis. 46
2.2.3. Бактерии Haiomonas sp. штамм AG J 1-3. 46
2.3. Получение бесклеточного экстракта. 47
2.4. Выделение и очистка нитратредуктазы дрожжей Rhodotorula glutinis, выращенных в присутствии 1 мМ вольфрамата. 47
2.5. Определение активности нитратредуктазы. 48
2.5.1. Определение активности метилвиологензависимой нитратредуктазы 48
2.5.2. Определение активности NADH- и NADPH- зависимой нитратредуктазы. 49
2.6. Определение наличия молибдокофактора. 49
2.7. Определение молекулярной массы белков методом гельхроматографии. 50
2.8. Определение молекулярной массы и субъединичного состава белков методом электрофореза. 50
2.9. Определение ферментативной активности в ПААГ. 51
2.10. Определение вольфрама кинетическим методом . 51
2.11. Аналитические методы. 53
3. Результаты исследования и их обсуждение.
3.1. Влияние парциального давления кислорода на свойства нитратредуктаз гриба Fusarium oxysporum 11 dn1. 57
3.1.1. Изменение функциональных характеристик HP-азы у микро-скопических грибов при стрессовых условиях (снижение парциального давления кислорода). 57
3.1.2. Физиолого-биохимические характеристики гриба F. oxysporum 11dn1 в аэробных и анаэробных условиях. 60
3.1.3. Сравнение свойств HP-аз мицелия гриба F. oxysporum 11dn1, инкубируемого на нитрате в аэробных и анаэробных условиях. 62
3.1.4. Влияние циклогексемида на активность HP-азы гриба F. oxysporum 11dn1, инкубируемого в аэробных и анаэробных условиях на среде, содержащей нитрат. 66
3.2. Выделение, очистка и характеристика нитратредуктазы из клеток солетолерантного штамма дрожжей Rhodotorula glutinis,выращенных в присутствии вольфрамата. 69
3.2.1. Влияние высоких (1 мМ) концентраций вольфрамата на рост дрожжей Rh. glutinis 69
3.2.2. Характеристика препарата нитратредуктазы из экстракта клеток дрожжей Rh. glutinis, выращенных на 1 мМ вольфрамате. 70
3.2.3. Выделение и очистка нитратредуктазы. 74
3.2.4. Структура и свойства выделенной нитратредуктазы. 74
3.2.5. Защитные механизмы, обеспечивающие устойчивость дрожжей Rh. glutinis к 1 мМ вольфрамату. 82
3.3. Выделение и характеристика новой, не содержащей молибден нитратредуктазы из галоалкалофильной бактерии Haiomonas sp. штамм AG J 1-3.
3.3.1. Выделение и очистка НР-азы из клеток галоалкалофильнои бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3. 84
3.3.2. Физико-химические свойства НР-азы из клеток галоалкалофильнои бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3. 86
3.3.3. Спектр ферментативной активности НР-азы бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3. 89
3.3.4. Анализ структуры НР-азы бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3. 93
4. Заключение. 100
5. Выводы. 101
Список работ, опубликованных по теме диссертации. 102
6. Список литературы. 103
- рН среды роста как фактор стресса
- Дыхательная мембранносвязанная нитратредуктаза бактерий (Nar).
- Определение вольфрама кинетическим методом
- Изменение функциональных характеристик HP-азы у микро-скопических грибов при стрессовых условиях (снижение парциального давления кислорода).
Введение к работе
Актуальность темы. В последние десятилетия огромный интерес исследователей вызывает изучение действия факторов стресса на рост и развитие микроорганизмов. Согласно современным представлениям стрессогенными факторами считают не только экстремальные значения рН, температуры, высокие концентрации солей, но и другие факторы, не являющиеся традиционными для жизнедеятельности данного вида микроорганизмов. Особого внимания заслуживает ключевой фермент азотного обмена - нитратредуктаза (HP-аза), поскольку понимание механизмов его функционирования в "нормальных" условиях и условиях стресса (которым часто подвергаются микроорганизмы и растения), имеет не только фундаментальное, теоретическое, но и большое практическое значение. Несмотря на разнообразие форм HP-аз и различную локализацию в клетке, все до сих пор исследованные HP-азы микроорганизмов и растений, выращенных в "нормальных" условиях, содержали в активном центре молибден в виде молибденового кофактора (Мосо), Лишь в самое последнее время появились первые указания на то, что "необычные" условия жизнедеятельности микроорганизмов (высокие концентрации железа, ванадата и др.) могут приводить к структурной модификации HP-азы, связанной с перестройкой ее активного центра. Так, из диссимиляторной ванадат-восстанавливающей бактерии Pseudomonas isachenhovii, выращенной на среде с ванадатом и нитратом, в нашей лаборатории впервые были выделены две НР-азы (периплазматическая и мембранносвязанная), не содержащие молибден и молибденовый кофактор [Antipov et al., 1998]. Периплазматическая HP-аза содержала в активном центре ванадий, что могло быть связно с условиями обитания микроорганизма. Из железо-восстанавливающей бактерии Geobacter metallireducens, выращенной на среде, содержащей нитрат или железо, был выделен гем-содержащий мембранный ферментный комплекс, способный восстанавливать нитраты и не содержавший в своем составе молибден [Murillo et al., 1999]. Следовательно, изучение влияния факторов стресса на азотный обмен в целом и, в частности, на его ключевой фермент - HP-азу, является актуальной проблемой.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы стало изучение влияния факторов стресса на свойства и структуру HP-азы у прокариот (галоалкалофильные бактерии Halomonas sp. Штамм AG J 1-3) и эукариот (гриб Fusarium oxysporum от ассимиляторного аналога, солетолерантные дрожжи Rhodotorula glutinis). Спектр факторов стресса включал высокие концентрации солей, щелочные значения рН, смену условий культивирования (аэробиоз-анаэробиоз). Научная новизна.
Обнаружено, что гриб F. oxysporum штамм 11dn1 способен к денитрификации в анаэробных условиях, что выделяет его среди других эукариотических организмов. Гриб синтезирует cte novo активную диссимиляторную HP-азу, существенно отличающуюся по своим свойствам от ассимиляторного фермента.
Показано, что солетолерантные дрожжи Rhodotorula glutinis в ответ на воздействие 1 мМ вольфрамата способны синтезировать вольфрам-связывающий белок, сорбирующий до 4,6-9,9 мкг вольфрама /мг белка. Синтезируемая при этом HP-аза характеризуется необычной устойчивостью к высоким концентрациям вольфрама (сохранение 100 % -ой активности при воздействии 1 мМ вольфрамата).
Обнаружено, что HP-аза галоалкалофильной денитрифицирующей бактерии Halomonas sp. Штамм AGJ 1-3 не содержит молибден и Мосо, характеризуется высоким температурным оптимумом (70С), повышенной термостабильностью и широкой субстратной специфичностью, что дает основание предполагать существование целого класса альтернативных безмолибденовых HP-аз, обладающих сходными свойствами.
Научно-практическое значение. Полученные данные позволяют существенно расширить представление о влиянии факторов стресса на свойства ключевого фермента азотного обмена - HP-азу. Настоящая работа является фундаментальным исследованием, однако уникальные свойства исследуемых HP-аз (высокий оптимум температуры, высокая стабильность и термостабильность) создают предпосылки для их практического применения в качестве биологических компонентов для очистки различных техногенных объектов.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на XIII международной конференции молодых ученых по химии и химической технологии "МКХТ-99" (Москва, 1999), на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), на III Съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), на школе-конференции "Биология -наука XXI века" (Пущино, 2004).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в числе которых 5 статей в ведущих российских журналах. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 122 страницах. Список цитируемой литературы включает 231 наименование, в том числе 213 на иностранных языках. Иллюстративный материал содержит 29 рисунков и 7 таблиц.
рН среды роста как фактор стресса
Известно, что большинство биологических процессов протекает при нейтральных значениях рН, тогда как рН окружающей среды значительно варьируетея-от сильнощелочных значений рН содовых озер до экстремально низких значений некоторых сред обитания. В зависимости от рН среды обитания микроорганизмы делятся на ацидофилов (оптимум роста при рН 2) и алкалофилов (активны при рН 9) (Табл. 1).
В группу ацидофильных организмов входят различные виды эукариот и прокариот (Рис. 2). Грибы Acontium cylatium, Cephalosporium sp. и Trichosporon cerebhae способны к активной жизнедеятельности в экстремально кислых условиях (рН=0) [Schleper et al., 1995а]. Нижним пределом существования красных (Cyanidium caldarium) и зеленых (Dunaliella acidophila) водорослей является рН 0,5 [Doemel and Brock, 1971].
Архебактерии так же способны расти при экстремально низких значениях рН. Аэробные гетеротрофные археи Picrophilus oshimae и Picrophilus torridus, выделенные из почв Японии, пропитанных серной кислотой (1,2 М), образующейся в результате окисления сероводорода серо-окисляющими бактериями, способны расти при рН 0,7 и 60С [Schleper et al., 1995b]. Эти микроорганизмы поддерживают внутриклеточное значение рН около 4,6, тогда как у других экстремальных ацидофилов внутриклеточное значение рН равно 6 [Schleper et al., 1995b, Peeplesand Kelly, 1995].
Очень часто встречаются мультиэкстремофильные микроорганизмы, адаптированные к нескольким факторам стресса. Например, архебактерия Sulfolobus acidocal daris растет при рН 3 и температуре 80С. Кислые стоки рудников являются незаменимым источником термофильных ацидофилов, способных окислять (Leptospirillum ferrooxidans) и восстанавливать (Acidiphilum spp.) железо [Johnson and Hatlberg, 2003]. Из экологических ниш с высокими концентрациями солей, экстремальными значениями рН и температуры были выделены термофильные галоалкалотолерантные бактерии Anaerobranca spp. [Engleetal., 1995].
Алкалофильные микроорганизмы растут при экстремально высоких значениях среды обитания (рН-10-11) и подразделяются на две физиологические группы - собственно алкалофилов и галоалкалофилов. Алкалофилы растут при значениях рН 9 и выше, тогда как галоалкалофилам для оптимального роста необходимы не только щелочные условия {значения рН9), но и высокие концентрации NaCI (33%). Интересно, что алкалофильные микроорганизмы, как правило, выделены из экологических ниш с нейтральными значениями рН, тогда как галоалкалофилы встречаются в экстремальных местах обитания - содовых озерах Восточной Африки, США и России [Horikoshi, 1999]. Микробные сообщества, обитающие при рН 10 и степени минерализации 10% , не содержат эукариотические организмы, в основном -алкалофильные цианобактерии. Алкалофильные микроорганизмы представлены различными видами аэробных {Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Streptomyces), анаэробных (Clostridium thermohydrosulfurican), термофильных {Anaerobranca honkoshii, Clostridium paradoxum) бактерий и гипертермофильных архей (Thermococcus alcaliphilus) [Krulwich et al., 1998, Заварзин и др., 1999]. Гэлоалкалофильные микроорганизмы так же представлены различными бактериями и археями, включая цианобактерии (Synechocystis, Nostoc), метаногены {Methanosalsus zhilinaeae) и сероокисляющие микроорганизмы [Jones et al., 19 98, Сорокин и Митюшина, 1998, Сорокин, 2003].
Ацидофильные и алкалофильные микроорганизмы имеют эффективные механизмы внутриклеточного ионного гомеостаза и поддерживают близкие к нейтральным значения рН внутри клеток [Krulwich et al., 1998], за исключением описанных выше случаев. Ацидофилы обладают высоким протонным химическим градиентом (ДрН) мембран, который у Picrophilus oshimae составляет более 4 единиц рН и который является основной п ротонд вижу щей силой (proton-driven force, pdf) [van de Vossenberg et al., 2001]. Таким образом, ацидофильные микроорганизмы вынуждены компенсировать ДрН при помощи изменения заряда трансмембранного потенциала (Дш) внутри клеток с отрицательного на положительный, который формируется посредством активного поглощения положительно заряженных ионов (например, К ) внутрь клетки [van de Vossenberg et al., 1998].
Алкалофильным микроорганизмам необходимо поддерживать более низкое значение рН внутри клетки, чем значение окружающей среды. Поскольку, в этом случае генерируется ДрН обратного знака, то для поддержания pdf необходима сбалансированная работа Na+-ATP-a3bi и Na+/H+, (К7Н+) антипортеров. Известно, что в клетках алкалофилов функцию защитных барьеров от экстремальных условий окружающей среды выполняет не только цитоплазматическая мембрана, но и клеточная стенка, содержащая компоненты с большим числом карбоксильных групп, отрицательный заряд которых отталкивает гидроксильные ионы и адсорбирует протоны и ионы натрия [Horikoshi, 1999].
Микроорганизмы способны к активной жизнедеятельности в широком диапазоне концентраций растворенных солей - от пресной водоемов и морских биотопов до гиперсоленых озер (концентрация NaCI превышает насыщенную) [Madern et al, 2000]. Галофильные и галотолерантные микроорганизмы представлены различными видами бактерий, архей, цианобактерий и зелеными водорослями Dunaliella salina. Поскольку высокие концентрации солей приводят к потерям воды в процессе осмоса, микроорганизмам для выживания в условиях солевого стресса необходимо поддерживать высокое осмотическое давление [Огеп, 1999]. Известны две стратегии, посредством которых микроорганизмы противостоят воздействия высоких концентраций солей -"соль в цитоплазме", то есть накопление неорганических ионов внутри клеток в концентрациях, сравнимых с внешними, и накопление высоких концентраций осмол итов, когда тургор ное давление создается засчет накопления органических молекул [Pfluger and Muller, 2004]. Галофильные архей Halobactehales, анаэробные галофильные бактерии Haloanaerobiales используют стратегию "соль в цитоплазме", характеризуются высокими (молярными) концентрациями KCI внутри клеток и, как следствие, обладают солетолерантными ферментами и клеточными компонентами. [Ventosa et al., 1998, Orenet al., 2002]. Белки таких осмоадаптированных микроорганизмов содержат много остатков кислых аминокислот, практически не содержат гидрофобные аминокислоты, заменяя их на серин и треонин [Dennis and Shimmin, 1997].
Стратегия накопления высоких концентраций осмолитов не предполагает синтеза специальных адаптированных белков и большинство галофильных и галотолерантных микроорганизмов поддерживают осмотический баланс с помощью синтеза высокомолекулярных спиртов (глицерин, арабит), Сахаров и их производных (сахароза, трегалоза, гликозилглицерин), аминокислот и их производных и четырехзамещенных аминов (глицинбетаин). Эти низкомолекулярные компоненты в высоких концентрациях хорошо растворимы в воде и, как правило, либо не заряжены, либо являются цвитерионами при физиологических значениях рН [Galinski, 1993, 1995]. Количество синтезируемых молекул зависит от концентрации солей в окружающей среде, что предопределяет высокую скорость адаптации данных микроорганизмов к изменяющимся условиям. Следует отметить, что на синтез одной молекулы осмолита гидролизуется 20-90 молекул АТФ, тогда как на запасание 3-х молекул NaCI в случае стратегии "соль в цитоплазме" затрачивается 2 молекулы АТФ.
Дыхательная мембранносвязанная нитратредуктаза бактерий (Nar).
Основная мембранносвязанная HP-аза (NarGHI) широко распространена среди энтеробактерий и хорошо изучена для В. coli [Zumft, 1997]. Этот фермент осуществляет восстановление нитрата с формированием трансмембранного градиента протонов и состоит из трех субъединиц - а, р, у и нескольких кофакторов. Показано, что а- и р-субъединицы находятся в цитоплазме, тогда как у-субъединица заякорена в мембране и осуществляет их присоединение с цитоплазматической стороны внутренней мембраны {Рис. 6).
Кодируемая narl геном, у-субъединица (19 - 28 кДа) представляет собой гидрофобный белок, обладающий пятью трансмембранными а-спиральными участками с N-концом, находящимся в периплазме и С-концом в цитоплазме и содержащий два гема b-типа [Berks et al., 1995с; Philippot and Hojberg, 1999]. Локализация высокопотенциапьного гема около цитоплазматической стороны мембраны, а низкопотенциального гема около пер и плазм этической стороны, позволила высказать, а затем и доказать, предположение о соответствующем оптимальном с энергетической точки зрения положении гистидиновых лигандов [Magalon et al., 1997]. Таким образом, у-субъединица получает электроны от хинона и переносит их посредством гемов типа b через соответствующие цепочки гистидиновых лигандов на fJ-субъединицу. Это окисление пула хинонов на пери плазм этической стороне мембраны с выходом двух протонов приводит к формированию трансмембранного электрохимического градиента протонов, который обуславливает образование АТР при участии АТР-синтазы типа [Jormakka et al., 2003].
Кодируемая пагН геном, большая В-субъединица (43-63 кДа) является глобулярным белком, содержащим железосерные кластеры. В аВ комплексе, выделенном из Е. coli, методом ЭПР были обнаружены один [3Fe-4S] и три [4Fe-4S] кластера с различными окислительно-восстановительными потенциалами. Высокопотенциальные центры [3Fe-4S] и [4Fe-4S] имеют окислительно-восстановительный потенциал +60 и +80 mV, соответственно, тогда как два низкопотенциальных [4Fe-4S] центра имеют окислительно-восстановительный потенциал -200 mV и -400 mV, соответственно [Jepson et al., 2004]. В последних исследованиях высказывается точка зрения о том, что только высокопотенциальные кластеры способны, по термодинамическим соображениям, осуществлять перенос электронов, тогда как роль двух оставшихся кластеров до сих пор не известна.
Кодируемая геном narG, а-субъединица (104-150 кДа) содержит [4Fe-4S] кластер и молибденовый кофактор, на котором и осуществляется восстановление нитрата [Gregory et al., 2000; 2003]. Молибден может существовать, как Мо (VI), Мо (V) and Mo(IV), причем имеет место рН-зависимое равновесие между формами Мо при низком и высоком значениях рН. Методом Х-лучевой абсорбционной спектроскопии обнаружено, что в NarGHI белке у Е. coli присутствует только одна Мо=0 группа. Эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными при изучении кристаллической структуры DMSO редуктазы из Rhodobacter sphaeroides [Schindelin et al., 1996]. Ha основании изучения структуры молибденового центра, NarGHI может быть отнесена к тому же семейству мононуклеарных молибденовых ферментов, что и DMSO редуктаза [Hille et al., 1999]. Сравнение аминокислотной последовательности NarGHI с базой данных (BLOCK) выявило четыре консервативных участка, характерных для всех прокариотических молибдоптерин-содержащих оксидоредуктаз. Таким образом, на N-конце а-субъединицы NarGHI находится три из четырех консервативных цистеиновых остатка, найденных у молибдоптерин-гуаниндинуклеотид-связывающих белков.
У Е. coli (и только у этого организма) обнаружена вторая мембранносвязанная HP-аза [lobbi-Nivol et al., 1990]. Методом денатурирующего электрофореза в ПААГ было показано, что Nar- ZYV состоит из двух субъединиц с молекулярными массами 150 кДа и 60 кДа, кодируемых narZ и пагУ генами и содержит Мосо. Несмотря на то, что у - субъединица NarZYV, кодируемая narV, терялась в процессе очистки, ее присутствие было доказано спектральными методами. По своим характеристикам, железосерные кластеры NarZYV сходны с таковыми NarGHI, за исключением величины потенциала высокопотенциальных центров а - субъединицы. Оба фермента катализируют восстановление нитрата и хлората и ингибируются азидом.
Несмотря на общие свойства, NarGHI и NarZYV имеют различную подвижность при электрофорезе (Rf =0,23 и 0,38 для NarGHI и NarZYV, соответственно). NarZYV присутствует в клетках Е coli на минимальном уровне вне зависимости от парциального давления кислорода.
Известно, что восстановление нитрата контролируется кислородом на нескольких уровнях: на уровне экспрессии генов и на уровне транспорта оксоанионов азота. У Е. coli, P. fluorescens и P. stutzeri экспрессия narGHJI оперона индуцируется анаэробиозом и присутствием нитрата или нитрита [Khoroshilova et al., 1997;Hartig et al., 1999; Philippot ef al, 2001]. Регуляторный фактор транскрипции Fnr (регулятор фумарат- и HP-азы), выделенный из Е. coli, является анаэробным активатором narGHJI и представляет собой димер, содержащий Fe-S кластеры. Белок инактивируется молекулярным кислородом в результате разрушения [4Fe-4S] кластеров и переходит в мономерную форму. Мономер Fnr белка может быть разделен на три функциональных домена: N-концевой сенсорный участок, содержащий [4Fe-4S] кластер (остатки 1-50), центральный аллостерический домен, контактирующий с РНК-полимеразой, и С-концевой регуляторный домен, содержащий Н-Т-Н участок [Bates et al., 1995]. У P. aeruginosa и некоторых других видов Pseudomonas белок Апг (анаэробная регуляция анаэробной деиминазы и HP-азы) был идентифицирован, как структурный и функциональный гомолог Fnr [Galimand et a I., 1991; Sawers, 1991].Этот регулятор необходим для индукции каскада денитрификации при росте на оксидах азота [Galimand et al., 1991, Sawers, 1991; Ye etal., 1995].
Несмотря на значительный интерес исследователей к механизму поглощения нитрата денитрифицирующими бактериями, этот вопрос до сих пор остается плохо изученным. В ряде статей были высказаны предположения о различных механизмах проникновения нитрата, таких как пассивный унипорт, АТР-зависимый унипорт, зависимый от трансмембранного потенциала NO3 /Н+ симпорт и N03 /N02- антипорт [Berks et al., 1995b].
Предполагается, что восстановление нитрата в периплазме играет ключевую роль в аэробной денитрификации у Pseudomonas sp. [Bedzyk et al., 1999], Paracoccus pantotrophus [Butler et al.,1999; Ellington et al., 2003], Rb. sphaeroides f. sp. denitrificans; [Reyes et al., 1998; Gavira et al., 2002], в процессах адаптации к анаэробным условиям роста у Ralstonia eutropha; [Siddiqui et al., 1993], в поддержание окислительно-восстановительного равновесия при использовании нитрата в качестве акцептора электронов для удаления избытка восстановительной энергии у Rb. capsulatus, Rb. sphaeroides, Thiosphaera pantotropha; [Bell et al., 1990; Dobao et al., 1994], или для усвоения следовых количеств нитрата при росте на дефицитной по нитрату среде у Е. coli [Brondijk et al, 2002; Potter et al., 2000; 2001]. Гены пар так же были идентифицированы у Р$. putida [Carter et al., 1995], Ps. aeruginosa [Vollack et al., 1998], Ps. stutzeri, Shewaneila putrefaciens, H. influenzae и совсем недавно у ряда патогенных бактерий, таких как Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Yersinia pestis и Campylobacter jejuni. По-видимому, при поступлении новой информации о геноме еще неисследованных бактерий, мы можем ожидать существенного увеличения числа видов, содержащих пар гены.
Локализованные в периплазме HP-азы не принимают участия в образовании трансмембранного потенциала и представляют собой гетеродимеры, состоящие из каталитической (90 кДа) субъединицы, содержащей молибденовый кофактор и один [4Fe-4S] центр, и субъединицы (13-19 кДа), содержащей двугемовый цитохром С [Berks et al., 1995а; Philippot et al., 1997; Stewart et al., 2002) (Рис. 7).
Определение вольфрама кинетическим методом
В последние годы наши знания о биологической роли вольфрама существенно расширились. В начале 90-ых годов из клеток гипертермофильных архебактерий был выделен ряд вольфрам-содержащих ферментов. Кроме того, ряд организмов оказался способным при росте на среде с вольфрамом синтезировать активные вольфрамовые аналоги Mo-содержащих ферментов. Таким образом, растущий интерес к W-содержащим ферментам предопределил необходимость поиска селективного, высокочувствительного экспресс-метода определения этого микроэлемента в белках. Колориметрический и атомно-абсорбционный методы определения металлов характеризуются достаточно низкой чувствительностью, а использование масс-спектрометрического и атомно-эмиссионного методов с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS и ІСР-AES) затруднено из-за (длительности процедуры и дороговизны). Впервые метод определения W и Мо, основанный на способности этих металлов катализировать реакцию окисления рубеановодородной кислоты, был описан и применен Р.П. Панталером для анализа содержания данных микроэлементов в сталях [Панталер, 1963]. В своей работе автор отметил, что W обладает значительно более выраженными каталитическими свойствами, чем Мо и его влияние могло быть устранено добавлением лимонной кислоты. Позже Бурсаков и соавторы показали, что данный метод пригоден для определения Мо в биологических образцах [Бурсаков и др., 1987].
Нами была предложена модификация данного метода, которая может быть использована для количественного определения W в W-содержащих ферментах [Носиков и др., 2001].
Определение вольфрама в неорганических растворах: В кювету с длинной оптического пути 1 см последовательно вводили компоненты реакционной смеси (мл; конечный объем - 3 мл): образец - 0,5; 1,2 М HCI - 0,5; 6 мМ Na-ЭДТА- 0,5; дистиллированная вода -1,3; 12 мМ рубеановодородная кислота в 96%-ном этиловом спирте - 0,1; 60 мМ перекись водорода - 0,1 (старт реакции). Содержимое кюветы быстро перемешивали и в течение 3-5 минут регистрировали изменение оптической плотности при 390 нм, используя в качестве контроля дистиллированную воду. При работе необходимо соблюдать стабильный температурный режим (20-25С). Объем вводимого в реакционную смесь образца, можно изменять путем варьирования объема воды, однако необходимо учитывать, что максимальный каталитический эффект наблюдается при 0,1 - 0,2 М HCI.
Определение вольфрама в биологических объектах: Стандартной процедурой подготовки белков к металлоанализу является мокрое озоление. В работе [Бурсакова и др., 1997] определяли содержание Мо во фракциях после гель-хроматографии, используя процедуру озоления смесью концентрированных HNO3 и H2S04 (в соотношении 1:1). Данный процесс, как правило, сопровождается большими погрешностями и требует много времени.
По аналогии с методом определения Мосо, в котором для диссоциации последнего применялось прогревание, нами было исследовано влияние температуры и времени прогревания на количественное определение W. Таким образом перед процедурой определения образец необходимо прогреть при температуре 80С в течение 10 минут для полной диссоциации W и подвергнуть центрифугированию при 15 000 g в течение 15 минут для удаления денатурированного белка.
Зависимость скорости каталитической реакции от концентрации металла (в диапазоне 0,05 - 0,4 мкг/мл) сохраняется линейной в течение 3 - 5 мин (Рис. ). Поскольку реакция окисления рубеановодородной кислоты W является нулевого порядка, о ее скорости можно судить по тангенсу угла наклона кинетической кривой. Скорость реакции, полученную опытным путем, рассчитывали по уравнению: (tg а)"1 = (Д0/(Дг)) 10"3, где ДО - изменение оптической плотности реакционной смеси в присутствии катализатора за соответствующий интервал времени - At, мин. Истинную скорость реакции, соответствующую данной концентрации металла, определяли вычитанием скорости некаталитической реакции из приведенного ниже выражения: (tg о)"1 -(tg а0)"1 (AD/At - ADjAt0) И О"3, где AD0 - изменение оптической плотности реакционной смеси в отсутствие катализатора за соответствующий интервал времени At0, мин.
Чувствительность каталитического метода определения W примерно в три раза выше, чем Мо, при этом присутствие последнего в пробах в концентрации, не превышающей половину концентрации W, не влияет на результаты определения. Известно, что активный центр W-содержащих ферментов содержит птерин, железо-серные кластеры и в ряде случаев селен. Проведенные нами исследования показали, что данные вещества в концентрациях, в 2,5 раза превышающих концентрацию W в пробе, не влияли на чувствительность метода.
При анализе стандартных проб среднее отклонение между независимыми определениями не превышало 0,1%. Содержание металлов в гомогенных препаратах HP-аз определяли методами плазменной атомно-эмиссионной спектрометрии и плазменной масс-спектрометрии на приборах Optima 2000 DV (PerkinEImer, США) и ELAN 9000 (PerkinElmer, США). В качестве калибровочных стандартов использовались многоэлементные стандартные растворы фирмы PerkinEImer. Обработку гелей, гидролиз трипсином и экстракцию пептидов для идентификации белков с помощью масс-спектрометрии проводили согласно протоколам [Говорун и др., 2003] с некоторыми модификациями [Shevchenko et a!., 1996]. Масс-спектры получали на MALDIOF-масе-спектрометре Reflex III ("Bruker", США) с УФ-лазером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне масс 500-8000 Да и калибровали их, используя известные внутренние стандарты. Идентификацию белков проводили с помощью программы Mascot, опция Peptide Fingerprint ("Matrix Science", США), с точностью определения массы МН+ равной 0,01% (допуская возможность модификации цистеинов акриламидом и окисления метионинов), и по базам данных Национального центра биотехнологической информации США (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Определение аминокислотного состава проводили согласно протоколу [Tsugita and Scheffler, 1982]. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Helios а Thermal Spectronic в интервале длин волн 200-650 нм. Белок определяли по методу Брэдфорд [Bradford, 1976], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин. Влияние цикл ore ксимида изучали добавлением его к нитрат-со держа щей среде в концентрации 0,00025% с последующей инкубацией мицелия гриба Fusahum oxysporum 11dn1 в аэробных и анаэробных условиях в течение 10 часов. Для определения рН оптимума фермента использовали следующие буферные системы: 0,2 М CH3COONa - СН3СООН (рН 4 - 5); 0,2 М КН2Р04 -КОН (рН 6 - 8); 0,2 М Н3В03 - KCI - КОН (рН 9 - 10); 0,2 М К2НР04 - КОН (рН 11 -12). Данные, приведенные в таблицах и на рисунках - средние арифметические значения из трех и более повтор ноете й; стандартное отклонение которых не превышало 5%
Изменение функциональных характеристик HP-азы у микро-скопических грибов при стрессовых условиях (снижение парциального давления кислорода).
При анаэробном выращивании клеток Halomonas sp. штамм AGJ 1-3 в присутствии 1 мМ вольфрамата не наблюдалось ингибирования процесса денитрификации. Это указывало на то, что клетки устойчивы к воздействию данного фактора стресса, как это было описано в случае с Rh. glutinis и Pyrobaculum aerophilum [Afshar et al., 1998]. Поскольку вольфрам способен проникать внутрь клетки, подобная устойчивость микроорганизмов к воздействию факторов стресса может быть обусловлена синтезом новой НР-азы, отличающейся по своим свойствам (повышенная устойчивость фермента к вольфраму) и/или структуре (перестройка активного центра) от ферментов, синтезирующихся в нормальных условиях.
Клеточный экстракт, полученный при разрушении анаэробно -выращенных клеток Halomonas, подвергали двухстадийной очистке по разработанному нами протоколу. Первой стадией являлся препаративный электрофорез в неденатурирующих условиях (материалы и методы исследования, пункт 2.8). Фракции, содержащие НР-азную активность, концентрировали на ячейке для ультрафильтрации "Amicon" (мембрана ХМ-50) для удаления низкомолекулярных примесей. Вторая стадия включала препаративный электрофорез полуочищенного препарата. В результате такой двукратной очистки был получен гомогенный препарат HP-азы, что показано методом аналитического электрофореза в ПААГе (Рис. 24), Удельная активность гомогенного препарата HP-азы достигала 250 мкмоль N02-/MHH на мг белка, что позволило оценивать ее как высокую для данного класса диссимиляторных ферментов. Для сравнения, удельные активности гомогенных препаратов HP-аз из Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas stutzeri, Paracoccus denitrificans составляли 2,8; 27 и 50 мкмоль N02-/MHH на мг белка [Zumft, 1997]. Активность выделенного нами фермента уступала только активности HP-азы из гипертермофильной археи Pyrobaculum aerophilum - 326 при 70С, и 526 мкмоль N027MHH на мг белка при 95С [Afshar et al., 2001].
Несмотря на высокую щелочность среды роста клеток (рН 10,5), зависимость активности HP-азы от рН среды инкубации имела четко выраженный оптимум при рН 7,0 (рис. 25), что позволило предположить наличие в клетках исследуемой галоалкалофильной бактерии эффективных механизмов поддержания внутриклеточного ионного гомеостаза. Известно [Horikoshi, 1999], что в клетках алкалофилов функцию защитных барьеров от экстремальных условий окружающей среды выполняет не только цитоплазматическая мембрана, имеющая системы антипортеров (Na+/H+, К7Н+), обеспечивающие нейтральное и слабощелочное значение рН (7,0-8,5) внутри клетки, но и клеточная стенка, содержащая компоненты с большим числом карбоксильных групп, отрицательный заряд которых отталкивает гидроксильные ионы и адсорбирует протоны и ионы натрия.
Говоря о необычных свойствах данного фермента, нельзя не упомянуть о достаточно высоком температурном оптимуме, составляющем 70 - 80С, и высокой термостабильности (Рис. 26). При инкубации при 50С НР-азная активность фермента оставалась постоянной в течение 120 минут, при 70С период полуинактивации фермента составлял 30 минут. Известно, что галоалкалоф ильные бактерии, выделенные из содовых озер и отнесенные к роду Haiomonas, являются мезофилами, и найденное нами столь высокое значение температурного оптимума является необычным для ферментов, выделяемых из этих организмов [Duckworth et at., 2000]. Интересно, что повышенный температурный оптимум наблюдался у всех выделенных до сих пор альтернативных (безмолибденовых) HP-аз и являлся их отличительным признаком [Antipov era/., 1998; Антипов и др., 1999; Antipov et а/., 2003].
Причины высокой термостабильности и повышенного температурного оптимума HP-азы пока остаются неясными. Существует гипотеза, согласно которой содовые озера, являющиеся экологической нишей современных алкалофильных микробных сообществ, представляют собой модель жизни на континентах в докембрии (около 4 млрд. лет назад) и могут рассматриваться как центры происхождения микробного разнообразия [Заварзин, 1993; Заварзин и др., 1999; Заварзин и Жилина, 2000; Kempe and Degens, 1985]. Поскольку ЭТОТ геологический период сопровождался активной вулканической деятельностью, адаптация алкалофилов к существованию при высокой температуре окружающей среды являлась необходимым условием их выживания, обеспечивая тем самым развитие всей прокариотнои биосферы, и сохранилась в их биологической памяти.
Ингибиторный анализ показал сходство изучаемого фермента с НР-азами, синтезируемыми в "нормальных" условиях. MP-аза из штамма AGJ 1-3 ингибировалась низкими концентрациями азида (lo,5 = 36 мкМ) (рис. 27) и цианида (Ь,5 - 1 ЮмкМ) (рис. 28), являющихся металлхелатирующими агентами.
Как правило, восстановление каждого из анионов катализируется соответствующими редуктазами, обладающими ярко выраженной субстратной специфичностью. Однако выделенная HP-аза оказалась способна восстанавливать не только нитрат, но и хлорат и нитрит (Рис. 29). Активность с нитритом составляла приблизительно 5 % от НР-азной активности и проявлялась только в случае отсутствия нитрата в реакционной смеси. Таким образом, исследуемая HP-аза обладала полианионредуктазной активностью. Способность к восстановлению ряда анионов была впервые показана для гем с-содержащего мембранного ферментного комплекса железовосста-навливающей бактерии Geobacter metallireducens [Murillo et ai, 1999], обладающего нитрат - нитрит- редуктазнои активностью и не содержащего в своем составе молибден. Комплекс восстанавливал не только нитраты, и нитриты, но и хлораты, селенаты, фумараты, тиосульфаты. Поскольку редуктазная активность при использовании разных анионов по-разному ингибировалась металлхелатирующими лигандами, было высказано предположение о наличии у таких ферментов различных каталитических «карманов» для каждого из анионов.
