Введение к работе
з
Актуальность темы. Бактерии рода Azospirillum способны образовывать ассоциативные и эндофитные симбиозы с растениями, улучшая питание и рост последних. Благодаря высокой азотфиксирующей активности, способности продуцировать фитогормоны и иные физиологически активные вещества, азоспириллы относятся к наиболее исследуемым представителям ростстимулирующих ризобактерий (PGPR - plant-growth-promoting rhizobacteria) (Bashaner а/.,2004).
Считается, что формирование и функционирование всех симбиозов происходит при непосредственном обмене сигналами между макро- и микропартнером симбиоза. Для ассоциативного симбиоза азоспирилла - пшеница показано, что одним из таких сигналов может служить агглютинин зародышей пшеницы (АЗП) -белок, экскретируемый в ризосферу корнями пшеницы. Данный лектин относится к группе хитин-связывающих лектинов, т.е. лектинов, которые обладают специфичностью к олигомерам ТУ-ацетил-Р-О-глюкозамина (GlcNAc). Установлено,
о Q
что АЗП (в концентрациях 10 -^ 10 М) влияет на процессы, важные для формирования и функционирования симбиоза (Антонюк, 2005). В частности, добавление АЗП к культуре A. brasilense вызывает усиление азотфиксации, стимулирует продукцию фитогормона ряда ауксинов - индолил-3 -уксусной кислоты (ПУК), положительно влияет на размножение бактерий (Антонюк и Игнатов, 2001; Садовникова с соавт., 2003). Предполагается, что не только АЗП, но и другие растительные лектины влияют на жизнедеятельность ризобактерий (Антонюк, 2005), однако экспериментальных данных по этому вопросу на сегодняшний день почти нет.
Формирование симбиозов в агробиоценозах зачастую происходит в условиях различных антропогенных загрязнений. Среди загрязнителей биосферы, представляющих серьезную угрозу для человека, тяжелые металлы (ТМ) относятся к числу опаснейших (Веницианов с соавт., 2003). Загрязнение почвы соединениями ТМ оказывает неблагоприятное влияние как на эффективность симбиоза в целом, так и на различные аспекты жизнедеятельности макро- и микропартнера в отдельности (Belimov et al, 2004). Накопление ТМ в почве снижает видовое разнообразие почвенной микрофлоры, ингибирует многие микробиологические процессы, приводит к повышению содержания этих токсичных элементов в сельскохозяйственной продукции, снижает урожайность и содержание питательных элементов в растениях. В то же время, микроорганизмы могут обладать высокой устойчивостью к ТМ и влиять на мобильность последних в почве путем изменения рН, продуцирования хелатирующих агентов и посредством других механизмов.
Необходимо отметить способность ассоциативных бактерий защищать растения от различных неблагоприятных факторов окружающей среды (Abbas & Kamel, 2004; Burd et al, 2000). A. brasilense является природным симбионтом для ряда растений, а также входит в состав бактериальных препаратов, используемых в растениеводстве, поэтому знание адаптации азоспирилл к стрессу, вызванному ТМ, важно не только для понимания стратегии выживания бактерий в природных условиях, но имеет и важное прикладное значение.
Все вышесказанное предопределило наш интерес к изучению влияния ТМ и растительных лектинов на различные аспекты жизнедеятельности азоспирилл, важные для эффективности растительно-бактериального симбиоза.
Целью данной работы являлось изучение влияния ионов тяжелых металлов и растительных лектинов на различные аспекты жизнедеятельности азоспириллы. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Изучение чувствительности A. brasilense к ряду ионов тяжелых металлов: кадмия(П), меди(П), кобальта(П) и цинка(П).
Анализ изменений, возникающих в клетках A. brasilense под воздействием тяжелых металлов, с применением методов колебательной спектроскопии.
Изучение взаимодействия ионов кобальта(П) с клетками A. brasilense методом эмиссионной спектроскопии ЯГР.
Исследование влияния кадмия(П) и меди(П) на продукцию фитогормона ИУК клетками A. brasilense в различных условиях культивирования.
Исследование влияния растительных лектинов на скорость плавания A. brasilense в жидких средах.
Изучение влияния растительных лектинов на подвижность A. brasilense в полужидких средах.
Научная новизна работы. Впервые для бактерий показано, что в условиях стресса, обусловленного присутствием ТМ (при отсутствии других видов стресса), происходит накопление поли-3-гидроксобутирата (ПГБ) клетками эпифитного штамма A. brasilense Sp7. Установлено, что штаммы одного вида, A. brasilense, различающиеся по своей локализации в ризосфере, по-разному реагируют на стресс, вызываемый ионами ТМ. Впервые методом эмиссионной спектроскопии ядерного гамма-резонанса (ЯГР, с использованием радиоактивного изотопа Со) показаны изменения химического состояния кобальта(П), происходящие в живых клетках А. brasilense Sp245. Обнаружено, что первичная быстрая сорбция кобальта(П) живыми клетками по своему механизму аналогична химическому взаимодействию катиона с поверхностью мертвых клеток. Впервые продемонстрировано влияние хитин-связывающих растительных лектинов на скорость плавания (в жидких средах) и тип социальной подвижности (в полужидких средах) A. brasilense.
Научно-практическая значимость. Установлено, что A. brasilense Sp7 и Sp245 обладают относительно высокой устойчивостью к ряду ТМ, что позволяет рекомендовать данные штаммы к использованию для фитостимуляции и совместной с растениями фиторемедиации при загрязнениях почв данными поллютантами. Полученные результаты по влиянию ТМ на продукцию ИУК штаммами A. brasilense могут способствовать выработке стратегии их практического использования в агробиотехнологии. Обнаруженный эффект индукции биосинтеза ПГБ штаммом A. brasilense Sp7 в присутствии ряда ТМ может быть полезен для разработки биотехнологических приемов производства данного промышленно ценного биополимера.
Полученные результаты по влиянию хитин-связывающих лектинов на скорость плавания и тип подвижности азоспирилл, в основе которого лежит специфическое взаимодействие между данными лектинами и GlcNAc-содержащими биополимерами азоспириллы, позволяет лучше понять механизмы, лежащие в
основе возникновения и успешного существования ассоциативных симбиозов, что является практически важным для увеличения эффективности последних.
Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на следующих научных совещаниях: 7 International Symposium on Metal Ions in Biology and Medicine (St.-Petersburg, Russia, 2002), 1-й региональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, 2002), 10th European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules (Szeged, Hungary, 2003), International Symposium on Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants (Saratov, Russia, 2003), 8th International Symposium on Metal Ions in Biology and Medicine (Budapest, Hungary, 2004), FESTEM (Federation of European Societies on Trace Elements and Minerals) Second International Symposium on Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology (Neuherberg-Munich, Germany, 2004), Всероссийской научной конференции "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты" (Саратов, 2005), 9-й школе-конференции молодых ученых "Биология - наука 21го века" (Пущино, 2005), международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2005), 30th FEBS Congress and 9th TUBMB Conference "The Protein World" (Budapest, Hungary, 2005), 9th International Symposium on Metal Ions in Biology and Medicine (Lisboa, Portugal, 2006), International Conference "Rhizosphere II" Satellite Workshop "Azospirillum VII and Related PGPR: Genomics, Molecular Ecology, Plant Responses and Agronomic Significance" (Montpellier, France, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 работы в зарубежных и отечественных научных изданиях, из них 8 - статьи в сборниках и рецензируемых журналах, включая две статьи в журналах, входящих в рекомендованные ВАК списки периодических изданий для публикаций основных научных результатов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Клетки штаммов Azospirillum brasilense Sp7 и Sp245 обладают высокой
9-І-
устойчивостью к Cd (по сравнению с некоторыми ранее изученными
9-І-
эубактериями), достаточно устойчивы к повреждающему действию Zn и менее устойчивы к Со и Си .
9-І- 9-І-
Культивирование A. brasilense в присутствии Cd и Си (0.2 мМ) приводит к снижению содержания фитогормона ПУК в культуральной жидкости. В аэробных условиях культивирования снижение концентрации данного фитогормона происходит лишь за счет уменьшения числа жизнеспособных клеток, тогда как в микроаэробных - за счет снижения удельной продукции ПУК клетками.
При росте эпифитного штамма A. brasilense Sp7 на МЇ4+-содержащей питательной среде в присутствии тяжелых металлов происходит накопление ПГБ клетками. Для эндофитного штамма A. brasilense Sp245 в аналогичных условиях индукции синтеза и накопления ПГБ не наблюдается.
Хитин-связывающие растительные лектины вызывают снижение скорости плавания A. brasilense в жидкой культуре и изменение типа подвижности А. brasilense от роения к распространению с образованием микроколоний в полужидких средах.
Личный вклад соискателя. Личный вклад соискателя состоит в участии в постановке всех исследовательских задач, подготовке и проведении большинства экспериментальных работ; активном участии в обработке, интерпретации и обсуждении всех полученных результатов, а также в подготовке статей к публикации.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка публикаций автора по теме диссертации, списка цитируемой литературы, содержащего 297 источников, в том числе - 251 зарубежных. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков и 10 таблиц.
Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в рамках тем "Особенности биохимии эндофитных и ассоциативных симбионтов рода Azospirillum'1'' (руководитель - д.б.н. Антонюк Л.П., № гос. регистрации 01200012855) и "Исследование молекулярных механизмов растительно-микробных взаимодействий с использованием спектроскопических подходов" (руководитель - д.х.н. Камнев А.А., № гос. регистрации 01200712166).
