Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 15
1.1. Бактерии рода Azospirillum: современные представления о систематике, физиологии и экологии 15
1.1.1. Систематика рода Azospirillum и наиболее изученные представители : 15
1.1.2. Азоспириллы - природные симбионты высших растений 17
1.1.3. Строение клеточной поверхности Л. brasilense 23
1.1.4. Агглютинин зародышей пшеницы и его влияние на метаболизм азоспирилл 26
1.2. Стресс у бактерий 38
1.2.1. Стрессовые факторы и стрессовые ответы бактерий . 38
1.2.2. Реакция азоспирилл на некоторые виды стресса 39
1.3. Регуляция роста у бактерий 43
1.3.1. Важность биокоммуникативных процессов в развитии бактериальных популяций 43
1.3.2. Регуляция роста бактерий молекулярными сигналами полипептидной природы 46
1.3.3. Регуляция роста бактерий низкомолекулярными метаболитами 50
1.4. Инфракрасная спектроскопия как исследовательский инструмент в современной микробиологии 54
2. Материалы и методы исследования 62
2.1. Выращивание бактериальных культур 62
2.2. Оценка ростовых параметров культуры 63
2.2.1. Оценка общего числа клеток в культуре 63
2.2.2. Определение числа жизнеспособных клеток 64
2.2.3. Оценка биомассы после завершения культивирования 64
2.2.4. Кривые роста культур Л. brasilense 64
2.3. Постановка экспериментов по длительному культивированию A. brasilense 64
2.4. Двойная радиальная иммунодиффузия 65
2.5. Приготовление образцов клеток для ИК-спектроскопии . 65
2.6. ИК-фурье-спектроскопия в режиме диффузного отражения . 66
2.7. Статистическая обработка полученных результатов 67
3. Результаты исследований и их обсуждение 68
3.1. Влияние агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) на рост A. brasilense 68
3.1.1. АЗП как возможный фактор роста для A. brasilense на полужидкой среде 68
3.1.2. АЗП как возможный фактор роста для A. brasilense на жидкой среде 75
3.2. Исследование клеточных ответов Л. brasilense на стресс и влияние лектина пшеницы с использованием ИК-фурье спектроскопии 81
3.2.1. Изменения в составе клеток A. brasilense Sp245 в ответ на комплексный стресс 81
3.2.2. Изменения в составе клеток A. brasilense Sp245, выращенных в аэробных условиях в присутствии АЗП 88
3.3. Адаптация A. brasilense к стрессам при длительном культивировании 92
3.3.1. Торможение роста A. brasilense Sp245 при различных видах стресса 92
3.3.2. Влияние стрессовых температурных условий и питательных сред (трофический фактор) на состояние культуры при длительном культивировании 98
3.4. Исследование накопления внутриклеточного полигидроксобутирата (ПГБ) A. brasilense в различных стрессовых условиях при длительном культивировании методом ИК-фурье-спектроскопии 104
3.4.1. Динамика накопления ПГБ клетками на различных стадиях развития культуры в различных стрессовых условиях 104
3.4.2. Сравнительный анализ внутриклеточного ПГБ на различных стадиях развития культуры 113
Заключение 124
Выводы 126
Список публикаций автора по теме диссертации 127
Благодарности 131
Список литературы 132
- Систематика рода Azospirillum и наиболее изученные представители :
- Выращивание бактериальных культур
- ИК-фурье-спектроскопия в режиме диффузного отражения
- Влияние агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) на рост A. brasilense
Введение к работе
Актуальность темы. Почвенные бактерии рода Azospirillum уже в течение трех десятилетий находятся под пристальным вниманием исследователей в лабораториях многих стран. Это связано с многообразием свойств данного рода бактерий, важнейшим из которых является их способность образовывать ассоциативные и эндофитные симбиозы со многими высшими растениями и стимулировать их рост и развитие, фиксируя азот атмосферы, продуцируя и выделяя в почву фитогормоны и ряд других физиологически активных соединений (Bashan et al. 2004).
Азоспириллы обладают значительным адаптивным потенциалом, что позволяет им занимать различные экологические ниши и предопределяет их встречаемость практически во всех климатических поясах. Из 12 описанных к настоящему моменту видов азоспирилл пока лишь два вида - A. brasilense и A. lipoferum - используются в качестве компонентов бактериальных препаратов и биоудобрений в агробиотехнологии; им же посвящена основная масса исследований. Тем не менее, если, к примеру, в Южной Америке Bradyrhizo-Ыит japonicum используется для инокуляции около 25 млн. гектаров сои, то площади пшеницы и маиса, занятые с использованием коммерческих препаратов на основе Azospirillum, занимают пока лишь 0.5 млн. гектаров (Castro-Sowinski et al., 2007).
Одним из факторов, способствующих формированию устойчивых ассоциаций почвенных бактерий с растениями, выживаемости микросимбионта в почве и стабильности его фито стимулирующего действия, является его устойчивость к стрессам. Это тем более важно ввиду того, что формирование растительно-микробных ассоциаций, в том числе и при использовании биопрепаратов для инокуляции культурных растений, происходит в постоянно меняющихся условиях обитания. Последние включают в себя различные неблагоприятные факторы окружающей среды, многообразие которых с учетом обширной "географии" азоспирилл очень велико. В связи с этим
8 исследование механизмов адаптации азоспирилл к стрессовым условиям, в том числе при их длительном воздействии, является актуальной задачей и представляет интерес не только для выявления фундаментальных закономерностей, способствующих пониманию стратегии выживания бактерий в неблагоприятных условиях, но имеет и важное прикладное значение.
Экспериментально доказано, что в преодолении многими бактериями, включая азоспирилл, неблагоприятных и стрессовых условий важную роль играет способность синтезировать внутриклеточный резервный "запас" биополимеров, представляющих собой продукт поликонденсации (эстерифика-ции) гидроксоалкановых кислот (Kadouri et aL, 2005). У A. brasilense они представлены гомополимером Р-гидроксомасляной кислоты - поли-3-гидрок-собутиратом (ПГБ), что, по данным (Kadouri et aL, 2003), имеет значение также для колонизации бактерией корней растений. Данная способность к синтезу и накоплению1 резервного биополимера, в частности, имеет принципиальное значение для увеличения сохранности, эффективности и надежности коммерческих бактериальных препаратов (Kadouri et al., 2003, 2005). Это обусловливает важность и актуальность исследований, связанных с биосинтезом и накоплением этого биополимера, имеющего также потенциальное промышленное значение в связи с его способностью к биодеградации и наличию ряда других полезных свойств (Kim and Lenz, 2001; Khanna and Srivastava, 2005; Rehm, 2007).
Существенным фактором, который, в настоящее время признан как необходимое звено в формировании устойчивой и эффективной растительно-бактериальной ассоциации, является обмен молекулярными сигналами между макропартнером (растение-хозяин) и микросимбионтом. Как показано в исследованиях последних лет (Антонюк, 2005; Антонюк и Евсеева, 2006), для ассоциативного симбиоза A. brasilense с пшеницей в качестве одного из таких сигналов, вызывающих целый ряд клеточных ответов бактерии, может выступать агглютинин зародышей пшеницы (АЗП), который не только экспонирован на поверхности корня, в местах прикрепления бактерий, но и в
9 небольших количествах может попадать в окружающую среду. Данный лектин, обладающий специфичностью к остаткам ІУ-ацетил-О-глюкозамина (и его олигомерам), содержащимся в биополимерах клеточной поверхности азоспирилл, вызывает в клетках бактерий ряд метаболических изменений, существенных для формирования симбиоза и его функционирования.
Необходимо подчеркнуть, что все описанные для A. brasilense эффекты, вызванные лектином пшеницы, наблюдались в условиях азотфиксации - при росте бактерии в микроаэробных условиях в отсутствие источников связанного азота. В связи с этим представляло интерес выяснить наличие какого-либо клеточного ответа бактерии на лектин пшеницы в аэробных условиях, в том числе в условиях ассимиляции аммония, подавляющих азотфиксацию.
Как известно, успешность колонизации растения бактериями зависит в том числе и, от плотности популяции. Поскольку, с одной стороны, способность белков стимулировать размножение бактерий уже описана (Bermudez et aL, 1996; Мукамолова и соавт., 1999; Томова и соавт., 2005), а с другой -воздействие АЗП на метаболизм азоспириллы плейотропно (стимулируется ряд процессов, важных для- формирования растительно-бактериального симбиоза), представляло также интерес исследование возможности лектина пшеницы стимулировать размножение азоспирилл.
Все вышесказанное предопределило наш интерес к изучению особенностей клеточных ответов A. brasilense при воздействии некоторых стрессовых факторов и лектина пшеницы.
Целью данной работы являлось изучение реакции A. brasilense на некоторые виды стресса и лектин пшеницы, в том числе при длительном культивировании.
Для реализации поставленной цели в ходе исследования решали следующие задачи:
1. Исследование влияния лектина пшеницы на рост A. brasilense на жидкой и полужидкой средах.
2. Выявление клеточных ответов A. brasilense на дефицит азота в
аэробных условиях в присутствии и в отсутствие лектина пшеницы методом
ИК-фурье-спектроскопии.
3. Изучение состояния культуры A. brasilense при длительном культиви
ровании в различных, стрессовых условиях.
4. Исследование динамики накопления и свойств внутриклеточного
поли-3-гидроксобутирата в различных стрессовых условиях при длительном
культивировании A. brasilense методом ИК-фурье-спектроскопии.
Научная новизна. Впервые показано, что лектин пшеницы может служить фактором роста для азоспирилл, увеличивая число жизнеспособных клеток в стационарной фазе роста при длительном воздействии как на жидкой, так и на полужидкой средах.
С помощью ИК-фурье-спектроскопии в режиме диффузного отражения (ДО) для штамма A. brasilense Sp245 впервые обнаружено, что в аэробных условиях при дефиците азота в среде (трофический стресс), а также в присутствии лектина пшеницы происходит перераспределение компонентов вторичной структуры клеточных белков с увеличением доли Р-структурных фрагментов.
Охарактеризовано состояние культуры A. brasilense (штамм Sp245) при длительном культивировании (до 30 сут) в условиях дефицита азота как в микроаэробных, так и в аэробных условиях. Обнаружено, что аэрация вызывает более резкое снижение жизнеспособности культуры азоспирилл на поздних стадиях при незначительном снижении общего числа клеток в культуре в обоих случаях.
Охарактеризовано также влияние температурных условий и состава среды на состояние культуры при длительном культивировании азоспирилл (до 30 сут) в азотфиксирующих условиях и динамика накопления поли-3-гидроксобутирата (ПГБ) клетками. С помощью ИК-фурье-спектроскопии в режиме диффузного отражения впервые для бактерий обнаружено, что при длительном микроаэробном культивировании в условиях дефицита азота в
среде A. brasilense накапливает ПГБ меньшей степени кристалличности, чем до достижения стационарной фазы; при этом на более поздних сроках культивирования культура в первую очередь расходует именно эту более аморфную фракцию ПГБ, характеризующуюся, по литературным данным, большей скоростью ферментативного гидролиза (более легкой "усваиваемостью").
Научно-практическая значимость. Полученные в работе результаты по влиянию лектина пшеницы на рост азоспирилл позволяют лучше понять механизмы формирования и успешного функционирования растительно-бактериальных симбиозов, что важно для повышения их эффективности.
Данные об адаптации азоспирилл к различным стрессовым условиям, в том числе при* длительном культивировании, также существенны для выработки стратегии их практического применения в агробиотехнологии.
Полученные сведения о динамике накопления клетками азоспирилл и свойствах резервного вещества (поли-3-гидроксобутирата, играющего важную роль в преодолении бактериями неблагоприятных и стрессовых условий) могут быть использованы для улучшения свойств коммерческих бактериальных препаратов, а также для разработки биотехнологических приемов производства данного промышленно ценного биополимера.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на следующих научных мероприятиях: 1-я Регион, конф. мол. ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, 26-27 марта 2002 г.; 10th Eur. Conf. on the Spectroscopy of Biological Molecules, Szeged, Hungary, 30 Aug. - 4 Sept. 2003; 1st FEMS Congr. of European Microbiologists, June 29 - July 3, 2003, Ljubljana, Slovenia; 14th Internat. Congress of the Hungarian Society for Microbiology, 9-11 Oct. 2003, Balatonfured, Hungary; 2-яРегион. конф. мол. ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, 26-28 октября 2004 г.; Всеросс. научно-практ. конф., посвященная 117-летию Н.И. Вавилова, Саратов, 2004 г.; 9-я Междунар. пущинская школа-конференция мол. ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 18-22 апреля 2005 г.; Всеросс. конф.
12 "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты", Саратов,. 15-17 июня 2005 г.; 5th Int. Symp. "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems", 20-24 June 2005, St.rPetersburg, Russia; Междунар: конф. "Рецепция? и внутриклеточная? сигнализация", Пущино, 6-9 июля 2005 г.; 30th FEBS-Congress, 2-7 July, 2005,. Budapest, Hungary; Науч. конф. "Коммуникация у микроорганизмов", Москва,, 11 ноября^2005 г.; Междунар: конф: "Современная физиология растений: от молекул до экосистем", Сыктывкар; 18-24 июня 2007 г.; 10* Analytical! Russian-German-Ukrainian; Symp. (ARGUSI2007 - Nanoanalytics),, 26-30 Aug. 2007, Saratov, Russia; Internat. Conf: "Rhizosphere П" Satellite Workshop "Azospirillum VII andt Related- PGPR: Genomics, Molecular Ecology,: Plant Responses andi Agronomic Significance", Aug:. 30 - Sept. 01, 2007, Montpellier, France; Bcepocc: конф: с междунар: участием; "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических,систем", Саратов;. 10-12 сентябряі 2007 г.; 5th Internat. Conf: onJhstrumental: Methods of Analysis,. 30'Sept: - 4 Oct: 2007, Patras, Greece; Междунар. науч; конф. "Микроорганизмы, и* биосфера',', Москва; 19-20 ноября 2007 г.; 4-я Межрегион: конф: мол: уч. "Стратегия взаимодействия микроорганизмов; и растений с окружающей средой", Саратов, 14-16 октября 2008 г.
Диссертация обсуждена и одобрена на;расширенном*заседании:лаборатории биохимии ИБФРМ РАН 10 ноября 2008 г.
Публикации. По теме диссертации, опубликовано 26 работ в, зарубежт ных.и; отечественных научных изданиях,, из которых 3, статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК, 2 статьи в,сборниках научных работ и 21 тезисыдокладов в материалах научных конференций.
Основные положения; выносимые на защиту: 1. Лектин пшеницы может быть фактором роста для -A. brasilense: он;: увеличивает число жизнеспособных клеток в стационарной фазе на жидкоши полужидкой средах.
2. В аэробных условиях при дефиците азота в среде у A.brasilense Sp245
происходит возрастание доли белков, содержащих Р-структурные фрагменты
полипептидной цепи в белковой составляющей клетки. Лектин пшеницы
индуцирует такие же изменения в культуре даже в оптимальных по азоту
условиях роста бактерии.
A. brasilense Sp245 сохраняет высокую жизнеспособность при длительном культивировании в условиях дефицита азота. Сочетание трофического и окислительного стрессов приводит к значительному сокращению числа жизнеспособных клеток в культуре.
При, длительном культивировании в условиях азотфиксации А. brasilense накапливает поли-3-гидроксобутират меньшей степени кристалличности, чем в ранней стационарной фазе. При этом на более поздних сроках культивирования, при переходе на внутренний питательный, резерв-ПГБ, культура преимущественно расходует именно эту более аморфную фракцию биополимера.
Личный вклад соискателя. Личный вклад соискателя состоит в участии в постановке всех исследовательских задач, подготовке и проведении основной части экспериментальных работ, активном участии*в обработке, обсуждении и интерпретации всех полученных результатов, а также в подготовке публикаций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части с описанием материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка публикаций автора по теме диссертации, списка цитируемой литературы, содержащего 295 источника, в том числе -225 зарубежных. Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков и 10 таблиц.
Проведение исследований. Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в рамках тем "Особенности биохимии эндофитных и ассоциативных симбионтов рода Azospirillum"
14 (руководитель - д.б.н. Л.П. Антонюк, № гос. регистрации 01200012855) и "Исследование молекулярных механизмов растительно-микробных взаимодействий с использованием спектроскопических подходов" (руководитель — д.х.н. А.А. Камнев, № гос. регистрации 01200712166).
Конкурсная поддержка работы. Исследования выполнялись при поддержке грантами Российского фонда фундаментальных исследований Ms 01-04-48755-а (2001-2003 гг.) и 03-04-06400-мас (2003 г.); грантом № 205 Комиссии РАН по работе с молодежью (6-й Конкурс-экспертиза проектов; 2002-2004 гг.); грантом Министерства науки и образования РФ, лот № 2005-РИ-112/001, проект № РИ-112/001/423 (2005 г.); грантами Президента РФ на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ №№ НШ-1529.2003.4 (2003-2005 гг.) и НШ-6177.2006.4 (2006-2008 гг.); составляли часть совместных международных проектов в рамках Соглашений между РАН и Венгерской АН на 2002-2004 гг. (Постановление Президиума РАН № 10107-173 от 05.03.2002 г., проект № 27) и на 2005-2007 гг. (Постановление Президиума РАН № 10107-120 от 18.02.2005 г., проект № 38), а также в рамках научных программ НАТО при поддержке грантами на развитие связей сотрудничества (Collaborative Linkage Grants) №№ LST.CLG.977664 (в течение 2002-2003 гг.), LST.NR.CLG.981092 (2004-2006 гг.), ESP.NR.NRCLG 982857 (в течение 2007-2008 гг.).
15 '
Систематика рода Azospirillum и наиболее изученные представители :
Среди многих свободноживущих микроорганизмов; ассоциированных с растениями;: важное место занимают бактерии? рода. Azospirillum Уже. три десятилетия- эти бактерии: изучают во многих лабораториях мира именно в связи:с их способностью колонизировать высшие растения,и; стимулировать их рост и развитие (Tammdet ah, 1978; Eucy et ah, 2004; Rodnguez-Navarro ег ah, 2007; de-Bashan et all,. 2008). Их относят к так: называемым EGPB-- бактериям (plant-growth-promoting bacteria - бактерии, стимулирующие рост растений) по предложению,, высказанному в работе (Bashan and- Holguin; 1998), хотя? в і англоязычной литературе чаще используется; аббревиатура EGPR (plant-growth-promoting rhizobacteria: - ризобактерии; стимулирующие рост растений). Способность азоспирилл к фитостимуляции основана на:ряде прямых: и косвенных механизмов (аспектов метаболизма бактерии) (Castro-Sowinski et ah, 2007), реализующихся последовательно или параллельно (Bashan et at, 2004). Наибольшее развитие, получили работы по продукции азоспирилламш фитогормонов (Steenhoudt andt Vanderleyden, 2000; Bottini et ah, 2004; Cohen et ah, 2008), в первую очередь ауксинов (Spaepen еґ ah, 2007)..
Азоспирилльї: являются: представителями; группы альфапротеобактерий, принадлежащими к; семейству Rhodospirillaceae (Kirchhof and Hartmann, 1992, Bashan et ah, 2004); Двавида из 12 известных: к настоящему времени-(A; brasilense и A. lipofenim) ранее: были: описаны; как, Spirillwm lipoferum-(Beijerinck,-1925).: Впоследствии при уточнении, классификации &. lipoferum часть штаммов была отнесена к виду A. brasilense, другая?- к A., lipoferum (Tarrand et ah, 1978). В 80-х годах прошлого столетия были описаны еще 3 вида рода Azospirillum: A. amazonense fMagalhaes et ah, 1983), A. haloprae ferens (Reinhold et al., 1987) и A. irakense (Khammas et al., 1989). Бактерия, выделенная из пресной воды и идентифицированная первоначально как Conglomeromonas largimobilis (Skerman et al, 1983), при уточнении классификации была переименована в A. largimobile (Dekhil et al, 1997; Sly and Stackebrandt, 1999), шестой вид азоспирилл. Уже в XXI веке род Azospirillum пополнился еще 6-ю новыми видами — A. doebereinerae (Eckert et al, 2001), A. oryzae (Xie and Yokota, 2005), A. melinis (Peng et al., 2006), A. canadense (Mehnaz et al, 2007a), A. zeae (Mehnaz et al., 2007b) и A. rugosum (Young etai, 2008).
Вегетативные клетки азоспирилл, растущих в оптимальных условиях, имеют форму изогнутых палочек диаметром 1.0—1.5 мкм и длиной от 2—3 мкм (Bashan et al, 2004) до 5 мкм (Xie and Yokota, 2005). Клетки высоко подвижны в жидкой среде; для них характерно "ввинчивающееся" или "вибрирующее" движение, вызванное вращением одного полярного жгутика. На полужидких питательных средах (0.2%-0.6% агара) клетки обладают "роящимся" движением (доминирующий по подвижности фенотип для данных условий). В начале XXI века был описан еще один тип коллективной подвижности азоспириллы - тянущая подвижность (Шелудько и Кацы, 2001).
В природных условиях азоспириллы колонизируют наружную и внутренние части корня растений (Dobereiner and Pedrosa, 1987; Levanony et ah, 1989; Schloter et al, 1994; Assrnus et aL, 1995; Dobereiner et al., 1995). Многочисленные исследования показали, что эти бактерии не проявляют специфичности к растению и успешно колонизируют многие виды высших растений (Dobereiner and1 Pedrosa, 1987; Bashan and Holguin, 1997; Bashan, 1998a). Довольно большой геном этих бактерий (от 4800 у A. irakense до 9700 т.п.н. у A. lipoferum) обеспечивает им значительный адаптивный потенциал (Bashan et ah, 2004), позволяя занимать различные экологические ниши и предопределяя их встречаемость практически во всех климатических поясах. Азоспириллы распространены в почвах (в ассоциации с корневой системой растений) повсеместно, включая районы Арктики (Nosco et al., 1994), и, кроме того, встречаются также в филлосфере полевых растений (Agarwala-Dutt et al., 1991). Отметим, что основная часть публикаций по азоспириллам посвящена видам A. brasilense и A. lipoferum; существенно меньшее количество работ связано с изучением A. amazonense, A. halopraeferens и A. irakense. Для описанных позднее видов имеются лишь единичные публикации. Азоспириллы — природные симбионты высших растений
В настоящее время считается, что воздействие азоспирилл и других PGPB на рост, развитие и урожайность растений многофакторно, т.е. в ассоциации азоспирилл и растений реализуется не один, а скорее всего, множество механизмов (Bashan et al., 2004). Кроме фиксации атмосферного азота, позитивное влияние на растения заключается в продукции бактериями ряда фитогормонов, которые изменяют метаболизм растений, приводя к улучшению поглощения минеральных веществ и воды.
Среди фитогормонов, продуцируемых азоспириллами, наиболее важную роль играет индолил-3-уксусная кислота (ИУК; ауксин), улучшающая рост корней растения-хозяина, способствующая поглощению корневой системой воды и минералов, что в итоге и обеспечивает стимуляцию роста растения (Spaepen et ah, 2007; de-Bashan et al., 2008; Malhotra and Srivastava, 2008). Азоспириллы синтезируют и выделяют также ряд витаминов - рибофлавин, тиамин, пантотеновую кислоту (Bashan et al, 2004).
Фитогормоны, продуцируемые азоспириллой, вызывают морфологические изменения корней, растений. При инокуляции растений пшеницы клетками A. brasilense можно наблюдать как позитивное влияние на рост корневой системы растения при оптимальном уровне инокуляции, так и ингибирующее при значительном превышении оптимальной концентрации! бактерий. При уровне инокуляции 10 кл./мл корневые волоски удлиняются, увеличивается из количество. В целом возрастает общая масса корней, увеличивается длина и количество боковых корней и корневых волосков, происходит их изгибание и скручивание. Применение более высокой плотности инокулята (10 кл./мл) приводило к сильному уменьшению длины корней (Kapulnik et al., 1985a; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Bashan et ai, 2004). Эффект изменения морфологии корней может быть достигнут заменой клеток Azospirillum sp. на не содержащий клеток супернатант (Dobbelaere et al, 1999). При добавлении содержащей ИУК культуральной жидкости A. brasilense к растениям риса наблюдалось увеличение поверхности корней и их удлинение; происходило также скручивание и ветвление корневых волосков, возрастала общая масса корней по сравнению с необработанными растениями (El-Khawas and Adachi, 1999).
Более высокие количества ИУК могут вызывать обратный эффект. Так, высокие концентрации супернатанта ингибировали элонгацию и развитие латеральных корней (El-Khawas and Adachi, 1999). Аналогичные изменения корневой морфологии наблюдали и при инокуляции клетками азоспириллы. Отмечено, что влияние инокуляции на корневые волоски определяется числом клеток в инокуляте (Kapulnik et ai, 1985а). Так, позитивное влияние азоспирилл на развитие растения-хозяина, проявляющееся при оптимальном уровне инокуляции (105-10б кл/мл), может превращаться в ингибирующее. Ингибирование роста чаще всего объясняют "конфликтным" взаимодействием с естественной микрофлорой растения при значительном превышении оптимальной концентрации азоспирилл в инокуляте (ВасПіо-Jimenez et al., 2001). Накоплен большой экспериментальный материал по угнетению роста корней при использовании суспензий высокой плотности (108-1010 кл./мл) (Dobereiner and Pedrosa, 1987; Kapulnik et al, 1985a,b; Jain and Patriquin, 1985; Okon and Kapulnik, 1986). Предполагается (Bottini et al., 2004), что эффект от инокуляции азоспириллами может быть частично вызван продукцией гиббе-релинов, поскольку они вызывают возрастание плотности корневых волосков, схожий с эффектом инокуляции азоспириллой (Cassan et al., 2001).
Выращивание бактериальных культур
Бактерии A. brasilense, штаммы Sp245 и Sp7 (коллекция культур Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов), если не указано иное, выращивали при 32С в жидкой культуре на синтетической малатно-солевой среде следующего состава (г/л): К2НР04 3.0; КН2Р04 2.0; NaCl 0.1; MgS04-7H20 0.2; СаС12-2Н20 0.02; FeS04-7H20 0.02; MnS04-5H20 0.1; Na2Mo04-2H20 0.002; яблочная кислота 3.76; NaOH 2.24 (эти количества яблочной кислоты и NaOH соответствуют 5.0 г/л малата натрия); дрожжевой экстракт 0.1. Значение рН доводили до 6.8-7.0 перед автоклавированием, используя ЮМ NaOH. Прекультуру выращивали при 31-=-32С в аэробных (на качалке, 160 об./мин) или микроаэробных (в термостате) условиях в колбах Эрленмейера в течение 24 ч на той же среде с добавлением NH4C1 (1 г/л).
Для экспериментов по влиянию АЗП на рост A. brasilense Sp7 и Sp245 в жидкой среде бактерии растили в условиях азотфиксации: среда не содержала источников связанного азота, культуры не подвергали аэрации (т.е. условия роста азоспирилл были микроаэробными). АЗП ("Лектинотест", Украина) вносили до конечной концентрации 0.2 мкг/мл вместе с инокулятом; начальная плотность культуры была равна 2x10 кл./мл.
Для экспериментов по влиянию АЗП на рост A. brasilense в полужидкой среде использовали суточную прекультуру, выращенную на малатно-солевой среде с добавлением 1 г/л хлорида аммония.
Для экспериментов по выяснению влияния стрессовых температурных условий и питательных сред (трофический фактор) на рост клеток при длительном г культивировании культуру выращивали в нижеперечисленных условиях. Контрольный вариант: культура росла на синтетической малатно-солевой среде в условиях азотфиксации (без добавления NH4C1, микроаэробно) при 31С. Вариант с охлаждением: культура росла на синтетической малатно-солевой среде в условиях азотфиксации (без добавления NH4C1, микроаэробно) при пониженной температуре (14С).
Вариант с предварительным замораживанием: в отличие от контрольного варианта, инокулят перед внесением в среду выдерживали 30 мин в морозильной камере (при минус 12С), после чего культура росла так же, как в контроле - на синтетической малатно-солевой среде в условиях азотфиксации (без добавления NH4C1, микроаэробно) при 31С.
Вариант "глюкоза + триптофан": культура росла микроаэробно, без богатых источников связанного азота, подавляющих фиксацию N2, на минерально-солевой среде, в которой благоприятные источники азота г углерода (NH4+, малат) были заменены на неблагоприятные - триптофан и глюкозу (Tarrand et al., 1978; Westby et aL, 1983), взятые в концентрациях 0.14 и 2.5 г/л соответственно. Состав среды для варианта «Г» включал также (г/л): К2НР04 0.1; КН2Р04 0.4; NaCl 0.1; MgS04-7H20 0.3; СаС12-2Н20 0.01; FeS04-7H20 0.017; Na2Mo04-2H20 0.002; витамин В12 0.0001; рН = 9.0; 38С (Никитина, 200Г, с. 130).
Общее число клеток в культуре оценивали путем подсчета бактериальных клеток с помощью камеры Горяева с некоторыми модификациями. Перед заполнением камеры для обездвиживания бактериальных клеток культуру подвергали термической обработке на водяной бане, доводя до температуры 100С. Для фазово-контрастной световой микроскопии использовали микроскоп Olympus (Япония) с увеличением х400. Световую микроскопию в рамках данной работы использовали также для оценки чистоты культур Л. brasilen.se.
Анализ числа жизнеспособных клеток (колониеобразующих единиц, КОЕ) проводили по общепринятой методике: после окончания культивирования готовили последовательные десятикратные разведения суспензии бактерий, которые высевали на чашки с плотной агаризованной малатной синтетической средой, и после двухсуточной инкубации при 32С проводили подсчет числа образовавшихся колоний.
Биомассу готовили следующим образом: бактериальные клетки из среды культивирования осаждали центрифугированием (50 мин., 3000g, при 4С), трижды промывали физраствором. Затем биомассу высушивали в сушильном шкафу до постоянной массы при 105С. Кривые роста культур А. brasilen.se Плотность культуры контролировали двумя способами: измеряя оптическую плотность при длине волны 595 нм на спектрофотометре Specol 221 (Carl Zeiss, Германия) и с использованием сравнения со стандартом мутности. 2.3. Постановка экспериментов по длительному культивированию A. brasilense При проведении эксперимента бактерии A. brasilense Sp245 выращивали при 32С в жидкой культуре на синтетической малатно-солевой среде приведенного выше состава. Были использованы два типа условий: в первом случае бактерии росли в термостате (без принудительной аэрации) на среде, не содержащей источников связанного азота, во втором случае культура выращивалась на той же среде на качалке при частоте 160 об./мин, т.е. дополнительно аэрировалась. Стартовая плотность культуры составляла 2x107 кл./мл. В процессе роста культуры проводился мониторинг общего химического состава клеток с применением ИК-фурье-спектроскопии в режиме диффузного отражения (ДО; см. ниже) и оценка параметров роста культуры A. brasilense Sp245. При этом учитывали общее число клеток в культуре и количество жизнеспособных клеток (КОЕ). На 36-й день роста культуры, культивировавшейся микроаэробно при 31С, оценивали поверхностные свойства бактериальных клеток в тесте иммунодиффузии.
ИК-фурье-спектроскопия в режиме диффузного отражения
При получении спектров использовали специальные микрочашечки для измерения ИК фурье-спектров ДО (Micro sampling cup; "Spectraech Inc.", США). Небольшое количество образца (0.2-Ю.5 мг) помещали в выемку микрочашечки,, слегка уплотняли с помощью стеклянной пластинки для формирования плоской поверхности и помещали в держатель спектрометра (Nicolet, модель Magna IR 750, или Nicolet 6700, Thermo Electron Corporation, США). Спектры образцов получены суммированием 100 разверток (разрешение 4 см-1) относительно фона (порошок KBr, "Merck"); обработку спектров проводили с помощью стандартной программы OMNIC 3.1 или 7.3 (Nicolet), предоставленной производителем спектрометра. Все спектры были сглажены для снижения шума с использованием функции "автоматического сглаживания" программы OMNIC 3.1 или 7.3, которая использует алгоритм Savitsky-Golay (95-точечный движущийся полином второй степени), а затем в ряде случаев (кроме раздела 3.4) для минимизации спектральных искажений полученный основной суммарный спектр был скорректирован функцией "автоматического корректирования базовой линии". Некоторые другие методологические детали ИК-фурье-спектроскопии в режиме ДО описаны в работах (Nichols et ai, 1985; Schmitt & Flemming, 1998, Naumann 2000, Kamnev et ai, 2005, 2006). 2.7. Статистическая обработка полученных результатов Все эксперименты были проведены по крайней мере в 3-х повторностях. Результаты представлены как усредненные величины с рассчитанными значениями стандартного отклонения. Математическую обработку данных проводили при помощи персонального компьютера с использованием статистического пакета анализа данных программы Microsoft Excel 2003. Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение АЗП как возможный фактор роста для A. brasilense на полужидкой среде
Еще в 80-х годах XX века было установлено, что клетки азоспириллы отвечают на АЗП изменением метаболизма, в частности - усилением азотфиксации. При добавлении незначительных количеств АЗП к планктонной культуре A. brasilense Sp7 (0.1-1 мкг на 1 мл культуры при ее плотности в диапазоне от 2x10б до 8x10б кл./мл) происходит довольно значительное, в максимуме более чем 4-кратное, возрастание интенсивности азотфиксации (Никитина и соавт., 1987). В вышедшей впоследствии публикации (Karpati et ai, 1999) сообщалось о повторении вышеупомянутого результата для A. brasilense Sp7, и были приведены доказательства того, что A. lipoferum SpBrl7 также отвечает на АЗП индукцией азотфиксации.
Позднее было установлено, что индукция азотфиксации - не единственный процесс, изменяемый под воздействием лектина пшеницы. Добавление к культуре азоспириллы Ю-8 -т- 10 9 М АЗП двукратно усиливало продукцию ИУК в бактериальных клетках и почти 13-кратно увеличивало экскрецию аммония (Antonyuk et. ah, 1993; Антонюк и Игнатов, 2001). Хорошо известно, что есть и другие аспекты жизнедеятельности и процессы, от которых зависит формирование растительно-бактериального симбиоза. Это, в первую очередь, свойства бактериальной поверхности, важные для колонизации (Rodrfguez-Navarro et ah, 2007). Кроме того, для успешной колонизации растений бактерии должны достичь в ризосфере определенной плотности. Ввиду этого представляется актуальной проверка АЗП на его способность стимулировать рост азоспирилл.
Интерес к последнему вопросу диктовался также следующими обстоятельствами. Исследования прошлого десятилетия показали, что белки организма-хозяина способны (в очень низких концентрациях) стимулировать рост бактерии-спутника. В частности, это явление было описано для двух видов микобактерий — Mycobacterium tuberculosis и М. avium (Bermudez et al, 1996) (белок-эффектор - эпидермальный фактор роста, ЭФР). Вирулентные штаммы кишечной палочки компетентны к интелейкинам: IL-1 и IL-2 стимулируют рост Е. coli (Denis et al, 1991; Porat et al, 1991). Лектин гороха (локализованный в корнях и семенах и экскретируемый при прорастании семян) способен стимулировать рост Rhizobium leguminosarum — бактерии, образующей клубеньки на корнях этого растения. Для лектинов бобовых также описана способность к стимуляции роста не только клубеньковых, но и некоторых других бактерий (Lau and Chan, 1984; Pusztai et al, 1993).
Ввиду того, что полужидкие среды позволяют моделировать условия существования азоспирилл, близкие к природным, нам представлялось целесообразным использовать полужидкую среду в экспериментах по исследованию влияния АЗП на рост азоспириллы. Для, экспериментов использовали суточную прекулыуру, выращенную на малатно-солевой среде с добавлением 0.5 г/л хлорида аммония. Клетки A. brasilense Sp245 стерильно отделяли от культуральной жидкости центрифугированием и дважды промывали раствором NaCl (0.85%). Из осадка по стандарту мутности готовили суспензию с плотностью 109 кл./мл. После серии разведений бактериальную суспензию плотностью 104 кл./мл смешивали с расплавленной полужидкой средой (t = 65 С). Для приготовления полужидкой среды использовали ту же среду, что и для приготовления прекультуры, и фитогель (Phytagel, "Sigma-Aldrich"), конечная концентрация которого составила 0.095%. В опытных вариантах перед смешиванием в чашке Петри с бактериями в нее добавляли БСА ("Serva") или один из растительных лектинов фирмы "Лектинотест" (Львов, Украина): АЗП, КонА или агглютинин клубней картофеля (Solarium tuberosum agglutinin, STA). Последний, как и АЗП, является хитин-связывающим лектином и специфичен к олигомерам и полимерам М-ацетил-Р-О-глюкозамина. Число колоний и их морфологию оценивали невооруженным глазом, начиная с третьих суток. Наблюдение за подвижностью и размером колоний завершалось по истечении 7 суток. Эксперименты были проведены последовательно друг за другом в течение полутора месяцев.
Проведенные эксперименты показали, что АЗП в концентрации 0.5 мкг/мл достоверно увеличивает количество жизнеспособных клеток. По данным 3-х последовательных экспериментов, проведенных не менее чем в 5-ти повторностях, среднее значение КОЕ в опыте составило 213% от контроля, т.е. увеличение в среднем было двукратным (211, 276 и 151% от контроля, табл. 3.1).
Влияние агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) на рост A. brasilense
Описанная для лектинов бобовых способность к стимуляции роста ризобий (Косенко и соавт., 1993, Косенко и Мандровская, 1998) была установлена при изучении роста R. leguminosarum как на твердых агаризованных, так и на жидких средах. В нашем случае также представлялось целесообразным проверить, влияет ли лектин пшеницы на жизнеспособность A. brasilense Sp245 при росте бактерии в жидкой культуре.
Для выявления возможного ростстимулирующего действия АЗП на азоспириллу культуру выращивали в микроаэробных условиях, поскольку все ранее обнаруженные клеточные ответы бактерии на АЗП проявлялись именно в этих условиях (Antonyuk et al., 1993; Антонюк и Игнатов, 2001; Антонюк, 2005). В опытные варианты вместе с инокулятом вносили АЗП до конечной концентрации 0.2 мкг/мл.
Для оценки роста бактерий использовали прямые методы: определяли число жизнеспособных, клеток в культуре (колониеобразующих единиц, КОЕ) традиционным чашечным методом, оценивали биомассу клеток, отмытых от культуральной жидкости и высушенных до постоянной массы, а также общее количество клеток подсчетом в камере Горяева, что дополняет данные о количестве жизнеспособных клеток в культуре.
При выборе времени воздействия АЗП на клетки бактерии руководствовались следующей информацией. Более ранние эксперименты по влиянию лектина пшеницы на рост азоспирилл (Антонюк и соавт., 1997) показали, что присутствие АЗП в среде культивирования A. brasilense Sp245, когда бактерии подвергались действию этого стимула в течение 4 часов, не приводило к увеличению числа бактериальных клеток. Рост A. brasilense Sp245 в течение 18 часов в присутствии АЗП приводил к небольшому (на 37%) статистически достоверному увеличению биомассы бактерий, однако этот эффект не всегда воспроизводился при повторении эксперимента. Исходя из этого результата, а также из известных данных о том, что пролиферативное (ростстимулирующее) действие растительных лектинов на эукариотические клетки проявляется спустя 3-5 суток с момента начала действия стимула (Brown and Hunt, 1978; Kilpatrick and McCurrach, 1987), при проведении экспериментов по влиянию лектина пшеницы на рост А. brasilense Sp245 в жидкой среде время воздействия лектина было увеличено до 66 часов.
Увеличение времени культивирования A. brasilense Sp245 и, вместе с тем, времени действия стимула до 66 часов приводило к тому, что стимулирующее влияние АЗП на число жизнеспособных клеток (КОЕ) бактерий становилось более выраженным (табл. 3.5) и выражалось в приросте в среднем на 60%. Аналогичные данные были получены нами и для другого штамма Abrasilense Sp7, где прирост составил 58%.
Важно отметить, что в случае A. brasilense Sp245 замена АЗП на БСА (белок, не являющийся лектином) или КонА (лектин из Canavalia ensiformis, специфичный к cc-D-маннозе и a-D-глюкозе) не приводила к ростстимули-рующему эффекту: число жизнеспособных клеток в контроле и опыте было одинаковым (данные не представлены).
Параллельно с определением числа жизнеспособных клеток A.brasilense Sp245 мы измеряли высушенную биомассу клеток и проводили прямой подсчет общего количества клеток в камере Горяева (табл. 3.5). Эксперименты не выявили достоверных отличий между контрольной и опытной культурами по обоим параметрам, т.е. в культуре, растущей в микроаэробных условиях в присутствии АЗП (в концентрации 0.2 мкг/мл) в течение 66 часов, общее число клеток и биомасса не изменяются.
Таким образом, присутствие АЗП в среде культивирования не вызывало "количественных" изменений в культуре A.brasilense Sp245 - не происходило увеличения общего числа клеток, не увеличивалась по сравнению с контролем биомасса. Тем не менее, обобщая результаты, полученные при использовании жидких и полужидких сред культивирования, можно сказать, что "качественно" под влиянием данного эффектора культура менялась происходило увеличение числа клеток, способных к образованию колоний, т.е. числа жизнеспособных клеток. Более выраженно данный эффект проявлялся при культивировании Л. brasilense Sp245 на полужидкой среде.
Одной из возможных причин несколько более выраженного влияния АЗП на рост бактерии в полужидкой среде (по сравнению с жидкой) может быть более высокая концентрация лектина - 0.5 мкг/мл. Полученные нами результаты хорошо согласуются с данными; полученными в нашей лаборатории ранее. (Antonyuk et al, 1993). В соответствии с результатами, приведенными в цитируемой работе, присутствие 0:5 мкг/мл АЗП в среде роста вызывало максимальное повышение активности глутаминсинтетазы, азотфиксации. и экскреции аммония, в то время как при меньшей концентрации АЗП (0.2 мкг/мл) стимуляция, так же, как. и в наших экспериментах, была менее выраженной (Antonyuk et al., 1993).
Как уже упоминалось, использование полужидких сред позволило выявить влияние АЗП на размер колоний- азоспириллы, что, вероятно, связано со стимуляцией не только5 роста, но и коллективной подвижности. Данный факт хорошо согласуется с уже опубликованными результатами о влиянии АЗП на коллективную подвижность A. brasilense Sp245 (Sheludko et a/., 2007). Полученные экспериментальные данные, таким образом, свидетельствуют о том, что лектин пшеницы может служить фактором роста для бактерии A. brasilense.
