Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Азоспириллы: характеристика рода и его экологических особенностей .. 11
1.2. Азотный метаболизм азоспирилл 18
1.3. Бактериальные глутаминсинтетазы: катализ, структура и физико-химические свойства 26
1.4. Регуляция активности и кинетические характеристики додекамерных глутаминсинтетаз 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объект исследования и условия его культивирования 55
2.2. Разрушение клеток и получение грубого экстракта 56
2.3. Хроматографические методы 57
2.4. Определение концентрации белка 58
2.5. Электрофорез в полиакриламидном геле 58
2.6. Определение активности глутаминсинтетазы 58
2.7. Определение степени аденилирования глутаминсинтетазы 60
2.8. Метод кругового дихроизма 61
2.9. Метод эмиссионной спектроскопии ядерного гамма-резонанса 61
2.10. Получение пермеабилизированных клеток 62
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Влияние различных источников азота и углерода в среде культивирования на степень аденилирования ГС A. brasilense Sp245 63
3.2. Получение электрофоретически гомогенных препаратов глутаминсинтетазы A.brasilense 65
3.3. Исследование термостабильности глутаминсинтетазы 71
3.4. Специфичность фермента к катионам двухвалентных металлов 73
3.5. Кинетическое поведение глутаминсинтетазы при активации катионами двухвалентных металлов 77
3.6. Влияние агглютинина зародышей пшеницы на активность и степень аденилирования глутаминсинтетазы 88
3.7. Исследование вторичной структуры глутаминсинтетазы 92
3.8. Изучение металлсвязывающих центров глутаминсинтетазы 100
Выводы 108
Список использованной литературы 120
- Азоспириллы: характеристика рода и его экологических особенностей
- Регуляция активности и кинетические характеристики додекамерных глутаминсинтетаз
- Получение электрофоретически гомогенных препаратов глутаминсинтетазы A.brasilense
- Кинетическое поведение глутаминсинтетазы при активации катионами двухвалентных металлов
Азоспириллы: характеристика рода и его экологических особенностей
Азоспириллы, как и некоторые другие бактерии, образуют симбиозы с высшими растениями, фиксируют молекулярный азот атмосферы и передают связанные его формы растению-хозяину. В этой связи они представляют большой интерес и изучаются в разных лабораториях мира. В отличие от хорошо известных бобово-ризобиальных симбиозов, для которых характерно образование клубеньков, азотфиксирующие бактерии, живущие в тесной ассоциации с растением, но не образующие при этом клубеньков или других морфологических структур, значительно менее исследованы. Для таких растительно-бактериальных образований ранее использовали термин "ассоциации", в последние же годы чаще употребляют термины "ассоциативные симбиозы" и "эндофитные симбиозы" (James, 2000). Ассоциативные - в случае, когда бактерии колонизируют наружные части растения, эндофитные - когда местом колонизации являются межклетники, проводящие ткани или корневые волоски.
Полученные биохимические, микробиологические и генетические сведения об азоспириллах осмысливаются в свете понимания функционирования ассоциативных и эндофитных симбиозов. В этой связи первый раздел обзора литературы посвящен накопленным к настоящему времени сведениям о ростстимулирующих свойствах азоспирилл (в первую очередь - A. brasilense) и локализации этих бактерий в условиях растительно-бактериальных ассоциаций.
Хорошо известно, что азоспириллы (представители группы альфапро-теобактерий, Kirchhof and Hartmann, 1992) колонизируют как наружную, так и внутренние части корневой системы (Dobereiner and Pedrosa, 1987; Levanony et я/., 1989; Schloter et ah, 1994; Assmus et al., 1995; Dobereiner et al, 1995). Многочисленными исследованиями убедительно доказано, что эти бактерии не проявляют специфичности к растению-хозяину и успешно колонизируют многие виды высших растений (Dobereiner and Pedrosa, 1987; Bashan and Holguin, 1997; Bashan, 1998a, Bashan and de-Bashan, 2002).
Два вида (A. brasilense и A. lipoferum) из семи описанных к настоящему времени ранее были известны как Spirillum lipoferum (их выделил и описал Бейеринк в 1925 году (Beijerink, 1925)). В 1978 году вышла работа, посвященная уточнению классификации Spirillum lipoferum (Tarrand et al, 1978). Согласно этой работе, классификация известных штаммов вида S. lipoferum изменена: часть из них отнесена к A. brasilense, другая — к A. lipoferum. Впоследствии были описаны еще три вида рода Azospirillum: A. amazonense (Magalhaes et al., 1983), A. halopraeferans (Reinhold et al., 1987) и A. irakense (Khammas et al., 1989). Род Azospirillum пополняется новыми видами как за счет уточнения классификации уже известных бактерий, так и за счет описания и классификации выделенных из природной среды изолятов. Так, бактерия, выделенная из пресной воды и первоначально идентифицированная как Conglo-meromonas largimobilis (Skerman et al., 1983), при уточнении классификации переименована в Azospirillum largimobile (Ben Dekhil et al., 1997; Sly and Stackebrandt, 1999). Недавно описан еще один новый вид - Azospirillum doebereinerae (Eskert et al., 2001) По современным представлениям, азоспи-риллы распространены в почвах (в ассоциации с корневой системой растений) повсеместно, включая районы Арктики (Nosco et al., 1994), и, кроме того, встречаются также в ризосфере и филосфере дикорастущих растений (Agarwala-Dutt et al, 1991). К 1997 году (Bashan and Holguin, 1997) уже насчитывалось 64 вида растений, корни которых колонизируются азоспириллами, причем только треть из них - культивируемые человеком растения (пшеница, хлопок, томаты, перец, горчица); остальные - дикорастущие травы. Список растений, образующих симбиозы с азоспириллами, все время пополняется. Так, например, И. Башан с коллегами (Bashan and Holguin, 2002) установили, что азоспириллы образуют симбиозы с мангровыми деревьями.
Позитивное влияние азоспирилл проявляется только при оптимальном уровне инокуляции. Так, установлено, что при уровне инокуляции 105 кл/мл корневые волоски становятся длиннее, возрастает их плотность. Зона растяжения при этом остается без изменений. При повышении числа клеток до 108 кл/мл происходит деформация корневого чехлика и уменьшение длины зоны элонгации (Kapulnik et al, 1985а и 1985b). В целом показано, что для доз азоспириллы 105-106 кл/мл характерно увеличение общей площади корней пшеницы, то есть позитивное влияние на развитие корней пшеницы, в то время как 10-10 кл/мл ингибировали развитие корней. При оптимальном уровне инокуляции возрастает общая масса корневой системы, увеличивается длина и количество боковых корней и корневых волосков, происходит изгибание, скручивание и ветвление последних (Dobereiner and Pedrosa, 1987; Kapulnik et al, 1985a и 1985b; Jain and Patriquin, 1984; Okon and Kapulnik, 1986).
Считается, что вызванные азоспириллами изменения в корневой системе влекут за собой усиление поглощения воды и минеральных веществ растениями (Levanony et al, 1989, Kapulnik et al., 1985a; Bashan et al., 1990). В свою очередь, морфологические изменения в корне индуцируются фитогор-монами, продуцируемыми азоспириллой (Tien et al, 1979), причем наибольшей активностью обладает индолилуксусная кислота (ИУК) (Umali-Garcia et al, 1980; Barbieri et al, 1986, 1988).
О внутрикорневом обнаружении азоспирилл сообщали еще в 70-х годах (Umali-Garcia et al, 1978; Patriquin and Dobereiner, 1978; Schank et al, 1979). Факт способности азоспириллы к эндофитной колонизации был подтвержден более поздними исследованиями (Schloter et al, 1994; Assmus et al, 1995). К сожалению, данных об эндофитной колонизации корней пшеницы пока очень мало; касаются они почти исключительно A. brasilense Sp245 (Schloter et al, 1994; Assmus et al, 1995; Baldani et al, 1983; Patriquin et al, 1983; Dobereiner and Pedrosa, 1987; Schloter and Hartmann, 1998). В 90-е годы в лаборатории Хартманна (Hartmann) был выполнен цикл работ, посвященный сравнительному исследованию локализации двух штаммов A. brasilense — Sp7 и Sp245 — в корневой системе пшеницы (Schloter et al, 1994; Assmus et al, 1995; Hartmann et al, 1995). Заключительным этапом этого цикла явилась вышедшая в 1998 году статья (Schloter and Hartmann, 1998), посвященная мониторингу популяции этих штаммов в естественных условиях ассоциативного симбиоза.
Регуляция активности и кинетические характеристики додекамерных глутаминсинтетаз
Исследования додекамерных ГС показали, что сложная структурная организация этого фермента, с одной стороны, и первостепенное значение в азотном метаболизме продукта ее действия — глутамина, аминный и амидный азот которого используется для биосинтеза практически всех важнейших азотсодержащих метаболитов клетки, с другой стороны, обусловливают весьма сложную и многообразную регуляцию активности этого фермента у прокариот. Отсутствие регуляторных субъединиц у ГС всех организмов указывает на то, что регуляция ферментативной активности у живых организмов происходит на субъединичном уровне. Для бактериальных ГС известны следующие типы регуляции активности: а) регуляция по принципу обратной связи метаболитами, являющимися конечными продуктами метаболизма глутамина; б) регуляция катионами металлов и изменением соотношения концентраций катиона металла и АТФ; в) регуляция путем изменения величины энергетического заряда; г) регуляция путем химической ковалентной модификации фермента (его аденилирования и деаденилирования); д) некоторые другие механизмы (Shapiro and Stadtman, 1970; Stacey et al, 1979; Meister, 1980; Пушкин, 1990). Рассмотрим подробнее наиболее важные механизмы регуляции активности ГС у бактерий. Регуляция бактериальных ГС по принципу обратной связи метаболитами, являющимися конечными продуктами метаболизма глутамина. Хорошо изучен этот тип регуляции активности ГС у Е. coli. Регуляция конечными продуктами метаболизма глутамина ГС Е. coli происходит по принципу обратной связи (Ginsburg and Stadtman, 1973, 1974; Stadtman et ah, 1968; Woolfolk and Stadtman, 1967). Ретроингибиторами ГС являются аланин, глицин, триптофан, ЦТФ, АМФ, карбомоилфосфат, глюкозамин-6-фосфат; для их синтеза используется амидная группа глутамина. Ни одно из этих соединений даже в высоких концентрациях не ингибирует полностью ГС, т.е. действие их в смеси является независимым друг от друга. Такой тип ингибирования называется кумулятивным. Физиологический смысл такого ингибирования состоит в том, что амидный азот глутамина используется для синтеза большого числа метаболитов и поэтому накопление одного из них не "выключает" ГС полностью, и синтез глутамина, таким образом, не прекращается. В связи с этим выдвинуто предположение о наличии у фермента разных ретроинги-биторных центров, между которыми нет или практически нет взаимодействия. Данное предположение доказано для некоторых бактериальных ГС (Ginsburg and Stadtman, 1973, 1974). Однако, помимо ингибирующего действия, некоторые метаболиты могут оказывать противоположный эффект. Так, например, некоторые кетокислоты, в первую очередь 2-оксоглутаровая, стимулируют активность ГС бактерий (Ginsburg and Stadtman, 1973, 1974).
Регуляция бактериальных ГС катионами металлов и изменением соотношения концентраций катиона металла и А ТФ.
Взаимодействие иона металла с белком, очевидно, проявляется двояко: во-первых, это выражается в изменении свойств самого иона (например, спинового состояния); во-вторых, в изменении свойств молекулы белка: ее конформации, сродства к различным эффекторам, степени гидратации и т. д. Ранее при исследовании металлоспецифичности других ферментов были получены некоторые общие закономерности (Эйхгорн, 1978). Так, большинство киназ и синтетаз активируются в значительной степени только под действием Mg2+, Мп2 , Со24" и, в некоторых случаях, Са2+, в то время как дегидрогеназы и лиазы в большинстве случаев проявляют более широкую специфичность. Магнием активируются практически все ферменты, переносящие фосфатную группу (Диксон и Уэбб, 1982). Активирующее действие Me на фермент заключается, с одной стороны, в том, что он принимает участие в катализе; с другой, как уже упоминалось, - принимает участие в поддержании активной конформации ГС (Евстигнеева и Пушкин, 1983; Jaenicke and Jesior, 1978; Mitchell and Magasanik, 1983; Stadtman etal, 1968; Tate and Meister, 1971).
Подробные исследования были проведены для глутаминсинтетазы Е. coli, а именно, было изучено участие Me в поддержании активной конформации фермента (Ginsburg and Stadtman, 1973, 1974; Stadtman et al, 1968). Как уже упоминалось, нативный фермент кишечной палочки содержит Me ; при удалении катионов металлов происходит переход ГС в каталитически неактивную "relaxed -форму (расслабленную), которая, в отличие от нативного фермента, может при рН больше 8,0 диссоциировать на мономеры, не обладающие каталитической активностью. При рН меньше 8,0 процесс диссоциации становится обратимым. "Relaxed -форма ГС имела меньшую константу седиментации, чем нативный фермент. При добавлении к "relaxed" ферменту Me происходит (в течение 20 мин) переход в "taut -форму (напряженную), которая практически не отличается по физико-химическим и каталитическим характеристикам от нативного фермента. Спустя некоторое время (около 2 часов) Чаш"-форма трансформируется в нативный фермент. Считается, что данная схема отражает реальный механизм регуляции ГС Е. coli.
Так как в клетке находятся катионы различных металлов, вероятно, между ними может происходить конкуренция за центры связывания фермента. Если в смеси образуются только гомоядерные комплексы, то скорость реакции не может превышать скорость в присутствии иона, максимально активирующего ГС (Stadtman et al, 1970). Увеличение скорости реакции в присутствии од А і новременно двух видов ионов по сравнению со скоростью в присутствии максимально активирующего катиона свидетельствует о том, что образуется гете-роядерный комплекс и в данных условиях он имеет большую каталитическую активность, чем гомоядерный. Аналогично, если скорость реакции в присутствии двух разных ионов меньше, чем в присутствии наименее активирующего катиона, то гетероядерный комплекс образуется и имеет меньшую активность, чем любой гомоядерный.
Получение электрофоретически гомогенных препаратов глутаминсинтетазы A.brasilense
Известно, что многие ГС являются термостабильными белками. В случае бактерий встречаются как термостабильные ГС (Е. coli, В. stearothermophilis), так и термолабильные, например, у Rhizobium ]aponicum и R. trifolii одна из двух форм ГС термолабильна (Пушкин, 1990). Таким образом, при характеристике ГС из того или иного микроорганизма вопрос о термолабильности /термостабильности фермента требует отдельной экспериментальной проверки. Первые данные о термостабильности ГС A. brasilense были получены в нашей группе в первой половине 90-х годов (Беспалова и др., 1994). Эксперименты были выполнены нами на частично очищенном препарате ГС A. brasilense Sp245 (n = 6,4). Для получения частично очищенной ГС грубый экстракт клеток азоспи-риллы с активностью ГС, полученный, как описано в разделе 2.3, высаливали сульфатом аммония до 50 % насыщения. Осадок, не обладающий активностью ГС, отбрасывали, а супернатант после обессоливания на колонке PD-10 использовали для экспериментов по оценке термостабильности ГС.
Как видно из данных, представленных в таблице 4, неочищенная ГС А. brasilense проявляла довольно высокую термостабильность при мягком режиме термообработки препарата. Так, при температуре 50С и времени инкубации 30 мин сохранялось около 76 % активности фермента. Более жесткие режимы обработки, в частности, повышение температуры до 60С, а также увеличение времени инкубирования при 50С приводили к значительным потерям активности фермента (табл. 4).
Проведенные эксперименты, с одной стороны, свидетельствовали о термостабильности ГС A. brasilense (даже жесткие режимы термообработки не приводили в полной элиминации активности), с другой - не давали отчетливой картины истинной термостабильности фермента. В ГС-содержащем экстракте, подвергавшемся термообработке, могли присутствовать вещества, повышающие собственную термостабильность фермента. Кроме того, протеазы, повышающие свою активность с увеличением температуры, могли также маскировать (понижать) фактическую термостабильность самой ГС. В этой связи термостабильность ГС была исследована на электрофоретически гомогенном препарате (n = 5,3). Полученные данные также представлены в таблице 4.
Было выяснено, что при относительно мягком режиме обработки (50С, 30 мин) гомогенная ГС несколько менее термоустойчива, чем неочищенный фермент (в первом случае сохранялось около 72 % исходной активности, во втором - 76 %). При 60С, наоборот, очищенная ГС A. brasilense проявляла существенно большую термостабильность по сравнению с неочищенной: активность ГС после термообработки составляла около 30 % от исходной, в то время как в случае неочищенного фермента - лишь 7 %. Этот факт свидетельствует в пользу присутствия в частично очищенном препарате термостабильных протеаз. Интересно отметить, что в обеих сериях экспериментов двукратное увеличение времени обработки при 60С не приводило к существенному снижению активности ГС, что в целом говорит о существовании в молекуле ГС конформационно жестких участков, обеспечивающих функционирование фермента в неблагоприятных условиях. Учитывая то, что ГС является ключевым ферментом азотного обмена, логично предположить, что подобная конформационная стабильность важна для выживания бактерии в экстремальных условиях.
Как уже упоминалось, глутаминсинтетазы требуют для проявления активности присутствия катионов двухвалентных металлов, причем наиболее эффективными катионами традиционно считаются Mg2+, Мп2+ и Со2+ (Eisenberg et al, 2000; Bespalova et al, 1999). Фактически же ГС из разных микроорганизмов существенно различаются по способности активироваться этими эссенциальными катионами. Так, в случае ГС Е. coli специфичность фермента к катионам строго зависит от степени его аденилирования (Segal and Stadtman, 1972). ГС Mycobacterium smegmatis, наоборот, независимо от степени аденилирования активируется всеми этими катионами, причем с уменьшением степени аденилирования увеличивается активность фермента с каждым из них (Matsuoka and Kimura, 1985). В случае Spirulina platensis (Данг Хоанг Фыок Хьен, 1988) биосинтетическая активность ГС поддерживается только Mg и Со (Мп не активен), в то время как трансфертная активность того же фермента поддерживается только Mn2+ (Mg2+ и Со2+ не активны). В этой связи интересно было выяснить эффективность эссенциальных катионов в поддержании активности ГС A. brasilense Sp245. Кроме того, важно было понять, меняется ли специфичность ГС A. brasilense Sp245 к Mg2+, Со2+ и Мп2+ в зависимости от степени аденилирования фермента.
Эксперименты проводили с препаратами ГС A. brasilense Sp245 ГСо и ГС5,з, очищенными до электрофоретически гомогенного состояния. Оба фермента после очистки содержали связанные катионы, от которых не удавалось освободиться с помощью диализа против буфера. Этот вывод был сделан исходя из того, что обе формы ГС проявляли активность при исключении катионов из реакционной среды. Катионсодержащие препараты фермента получили название «нативной» ГС.
Включение в состав реакционной среды Mg2+, Мп2+ или Со2+ (1 мМ) приводило к увеличению активности нативной неаденилированной ГС (табл. 5).
Как видно из представленных в таблице 5 данных, Мп был менее эффективен в увеличении активности нативной ГС по сравнению с Mg и Со . Так как оставалось неизвестным, какие катионы связаны в активных центрах нативной ГС, была предпринята попытка получения препаратов фермента, свободных от катионов, что в нашем случае оказалось также необходимым для корректной оценки специфичности фермента к Mg +, Mn + и Со +.
Для удаления связанных с белковой глобулой катионов к препарату ГС (ГС0 или ГС5,з) добавляли ЭДТА до конечной концентрации 5 мМ. После инкубации (30 мин при комнатной температуре) препарат диализовали против 0,05 М Трис-НС1-буфера (рН 7,0) для удаления комплексов ЭДТА с металлами. Оба препарата ГС A. brasilense Sp245 (ГСо и ГС5,з) после обработки были свободны от связанных катионов, так как не проявляли биосинтетической активности при использовании реакционной среды без катионов и проявляли активность при использовании катионсодержащей реакционной среды (табл. 5). Необходимо отметить, что присутствие связанных катионов оказалось важным для конформационной стабильности фермента. Так, нативные формы ГС А. brasilense хранились в течение нескольких месяцев без потери активности, в то время как свободные от катионов формы фермента не восстанавливали полностью активность в катион-содержащей реакционной среде (она падала в среднем в 1,5 раза за неделю хранения препарата при +4 С).
Кинетическое поведение глутаминсинтетазы при активации катионами двухвалентных металлов
Описанные в предыдущих разделах работы механизмы регуляции активности ГС A. brasilense Sp245 - регуляция свойств и поведения фермента адени-лированием-деаденилированием и сменой активирующего катиона — реализуются внутриклеточно. Данный раздел работы посвящен экстраклеточному типу регуляции активности ГС азоспириллы, обнаруженному в первой половине 90-х годов прошлого столетия (Antonyuk et ah, 1993).
Как уже упоминалось в обзоре литературы, характерной особенностью бактерий, живущих в условиях фитосимбиоза, является появление дополнительных факторов регуляции, исходящих от растения-хозяина. В случае азоспирилл, образующих ассоциативные и эндофитные симбиозы с пшеницей, одним из таких факторов регуляции является лектин пшеницы (АЗП). Как показали работы, выполненные в 90-е годы, этот белок принимает участие в регуляции различных сторон азотного обмена азоспириллы, в частности, в регуляции азотфиксации (Никитина и соавт., 1987, Antonyuk et ah, 1993; Karpati et al, 1999) и экскреции аммония (Antonyuk et ah, 1993; Антонюк и Игнатов, 2001). Что касается глутаминсинтетазы, то установлено, что связывание АЗП с клетками азоспириллы приводит к увеличению активности фермента и к активации его биосинтеза (Antonyuk et ah, 1995; Антонюк и соавт., 1997). Было установлено также, что АЗП воздействует не только на азотный метаболизм, но и на другие аспекты жизнедеятельности бактерии (Иосипенко и соавт., 1994; Антонюк и соавт., 2001; Остахина и Антонюк 2002; Садовникова и соавт. 2003). Накопленные в 90-х годах экспериментальные данные способствовали формированию к представления об АЗП как о молекулярном сигнале для A. brasilense Sp245, изменяющем метаболизм этой бактерии в направлении, благоприятном для роста и развития растения-хозяина (Антонюк и Игнатов, 2001). При связывании АЗП с поверхностью бактерии сигнал, по-видимому, передается внутрь клетки, вызывая плейотропный клеточный ответ бактерии. Важно отметить, что концентрации АЗП, при которых наблюдали активацию метаболизма азоспириллы, во всех случаях были в диапазане 10-8 — 10-9 М; при концентрации клеток от 2 106 до 8 10 кл./мл. Учитывая тот факт, что лектин связывается с поверхностью бактерии (Karpati et ей, 1999), мы рассчитали количества (весовые) АЗП на клетку А. brasilense Sp245 для диапазона концентраций, вызывающих активацию ГС — удельное количество АЗП. Эта величина находилась в диапазоне от 12,5 10 9 до 187,5 10" мкг/кл. (1 мкг АЗП = 2,8 10 М). Интересно отметить, что авторы работы наблюдали увеличение активности ГС даже при 10-минутном воздействия АЗП (Antonyuk et ah, 1993).
Детальное исследование обнаруженного явления (способности лектина пшеницы служить молекулярным сигналом для азоспириллы) привело к накоплению фактов, позволяющих думать, что сигнальные свойства лектина реализуются только в условиях, характерных для симбиоза азоспириллы и пшеницы, то есть в микроаэробных азотфиксирующих условиях (Антонюк, 2002). В частности, показано, что в клетках азоспириллы, растущих аэробно, во-первых, лектин не индуцирует синтез новых белков; во-вторых, не усиливается гемагглютинация клеток в ответ на добавление лектина пшеницы в среду культивирования; в-третьих, не происходит индукции гемолитического фактора под влиянием лектина (Остахина и Антонюк, 2002). Вероятнее всего, при аэробном росте азоспириллы и наличии источников связанного азота в среде, клетки штамма Sp245 становятся некомпетентными, то есть теряют способность отвечать на лектин пшеницы как на молекулярный сигнал.
В связи с этим одной из задач нашей работы была проверка предположения, что при росте A. brasilense Sp245 в условиях аэрации на азотсодержащей среде клетки теряют способность увеличивать активность ГС в ответ на воздействие АЗП. Были проведены две серии экспериментов. В обоих случаях культуру растили аэробно в колбах Эрленмейера с использованием качалки на стандартной аммонийсодержащей синтетической малатной среде при температуре 32С. Так как в проведенных ранее исследованиях (Antonyuk et ah, 1993) было установлено, что активация лектином пшеницы максимально выражена в логарифмической фазе роста культуры, то и в нашем случае воздействие АЗП на клетки азоспириллы оценивали также в логарифмической фазе роста.
В первой серии экспериментов клетки после культивирования подвергали воздействию АЗП аналогично тому, как обрабатывали их ранее в аммоний-ассимилирующих условиях: осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 0,85 % NaCl (концентрацию клеток определяли по стандарту мутности; она составляла 5 109 кл./мл). АЗП добавляли из расчета 62,5 10 9 мкг/кл. (удельное количество АЗП, вызывавшее максимальную активацию ГС в условиях азотфиксации, Antonyuk et al, 1993) и инкубировали без дополнительной аэрации при комнатной температуре в течение 30 мин. Активность и степень аденилирования фермента определяли в пермеабилизированных клетках. В суспензию контрольных клеток АЗП не добавлялся. Измерение активности фермента показало, что клетки азоспириллы, подвергавшиеся воздействию лектина, и контрольные клетки имеют практически одинаковую активность (табл. 6). Степень аденилирования также была одинаковой в опыте и контроле (п = 3,6 ± 0,5).
В описанном эксперименте воздействие АЗП на клетки азоспириллы осуществлялось в достаточно жестких условиях — клетки подвергались сильному стрессу (центрифугирование и смена богатой среды культивирования на физиологический раствор). Поэтому во второй серии схема эксперимента была немного изменена: культуру растили на той же среде и в тех же условиях, что и в первом случае. Далее стерильно отбирали аликвоту суспензии клеток для оценки их количества по стандарту мутности. Концентрация клеток в культуре составляла 109 кл/мл.
