Введение к работе
В настоящее время появились сообщения по исследованию изоферментного состава изоцитратлиазы в различных организмах. Современные молекулярно-биологические методы позволили в некоторых растениях идентифицировать несколько генов, кодирующих этот ферментный комплекс, состоящий из двух изоферментов, которые выполняют различные функции [Delkin G., 2007].
В последнее время упоминается о разнообразии функций целого суперсемейства изоцитратлиазы (ИЦЛ)/фосфоенолпируват мутазы (ФЕПМ), в состав которого входят семь энзимов, катализирующих образование или расщепление С-С или Р-С связей, в том числе и ИЦЛ [Lu Z. et. al., 2005].
Обзор литературы показал, что в разных организмах содержатся как минимум 2 гена, кодирующих изоцитратлиазу. Так, в геноме Saccharomyces cerevisiae ген icl\, расположенный в хромосоме 5, кодирует ключевой фермент ГЦ, который отвечает за образование сукцината и глиоксилата из изоцитрата [Fernandez Е., 1992]. Продукт гена icI2, локализованного в хромосоме 16, находится в митохондриальном матриксе, и обеспечивает работу метилцитратного цикла, катализируя конверсию 2-метилизоцитрата в сукцинат и глиоксилат [Luttik А. Н. et. al., 2000]. В геномах таких растений как Pinus taeda, Arabidopsis thaliana, Glycine max. L. так же обнаружено два гена, кодирующих изоцитратлиазу, которые расположены в разных хромосомах (). Причём мРНК изоцитратлиазы накапливается как во время эмбриогенеза, так и в последующие этапы
4 развития растительного организма [Zhang J.Z. et. al., 1993, Yuko A. et. al., 2008].
Кукуруза, являющаяся типичным представителем С-4 типа растений, характеризуется сложным сочетанием энергетического и конструктивного обменов. Внутриклеточная локализация изоформ изоцитратлиазы и механизм их метаболической и генетической регуляции в Zea mays L слабо изучены, и поэтому она служит оптимальным объектом исследования роли отдельных изоферментов на разных этапах её онтогенеза.
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлось исследование физико-химических, регуляторных, кинетических характеристик изоферментов изоцитратлиазы, выделенных из разных органов Zea mays L., и установление их генетической детерминированности и функциональной значимости.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Изучить динамику активности, изоферментный состав и субклеточную локализацию изоцитратлиазы в разных органах Zea mays L в процессе онтогенеза;
Получить в гомогенном состоянии препараты изоферментов изоцитратлиазы из щитков и зелёных листьев кукурузы;
Исследовать физико-химические свойства полученных в электрофоретически гомогенном состоянии препаратов изоформ ИЦЛ из различных органов кукурузы;
Сравнить кинетические и регуляторные характеристики изоферментов изоцитратлиазы;
Разработать высокоспецифичные праймеры для идентификации генов ИЦЛ на основе сравнения аминокислотных последовательностей изоцитратлиазы из различных организмов;
Провести ОТ-ПЦР анализ мРНК из щитков и листьев кукурузы для идентификации генов, кодирующих изоферменты изоцитратлиазы;
Секвенировать участки генов изоферментов изоцитратлиазы из Zea maysL;
Провести количественный анализ уровня экспрессии генов изоцитратлиазы в кукурузе на разных этапах онтогенеза методом ПЦР в реальном времени.
Научная новизна. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о способах переключения метаболических потоков в растительной клетке, с помощью изоферментов, обеспечивая растительному организму нормальное развитие.
Изоферментный состав изоцитратлиазы в кукурузе представлен двумя
формами исследуемого фермента, имеющими различную
электрофоретическую подвижность и специфическую субклеточную локализацию. При функциональном переходе растительного метаболизма от утилизации запасных веществ к фотосинтезу выявлена индукция образования второй изоформы исследуемого фермента.
Получение гомогенных препаратов изоформ изоцитратлиазы из зелёных листьев (ИЦЛ) и из щитков - ИЦЛі (глиоксисомальной) и ИЦЛ2
5 (внеглиоксисомальной) позволило исследовать их физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики. Сравнительный анализ свойств выделенных изоформ указывает на значительное сходство по большинству характеристик (Rf, четвертичной структуре, рНопт, сродству к субстрату, активации ионами и др.) ИЦЛ2 из щитков с ИЦЛ из зелёных листьев кукурузы.
Подбор праймеров для ИЦЛ, осуществленный нами на основе сравнения аминокислотных последовательностей изоцитратлиазы из различных организмов, а так же секвенирование полученных в ходе ПЦР продуктов, показали, что выделенные после очистки изоформы изоцитратлиазы имеют различную генетическую детерминированность, т.е. являются изоферментами, обладающими различной функциональной значимостью. Нуклеотидная последовательность ампликона icl\ высокогомологична участку гена icl\ ZMU69129, кодирующего изоцитратлиазу. Вторая нуклеотидная последовательность icI2 имеет 100%-ю гомологию с участком гена LOC100277287, кодирующим целое семейство изоцитратлиаз (ИЦЛУфосфоенолпируват мутаз (ФЕПМ).
Практическая значимость. Гомогенные препараты изоцитратлиазы находят широкое применение в исследовательской практике, являясь удобным объектом для изучения структуры активных центров лиаз, регуляции ферментативной активности и решения других важных задач энзимологии и молекулярной биологии. Высокоочищенные изоферменты ИЦЛ могут быть использованы для количественного определения изоцитрата в клеточном соке растительных и животных клеток. Изоцитратлиаза может использоваться и в гомогенном иммуноферментном анализе в качестве фермента-маркера, который индуцируется в тканях при экстремальных и патологических состояниях [Попов В.Н. и др., 2000]. Известно о применении в биотехнологических целях носителя с иммобилизованной изоцитратлиазой и изоцитратдегидрогеназой для мониторинга содержания сукцината в непрерывно размешиваемых реакторах [Sohn О. J., 2005].
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по «Физиологии растений», «Биохимии», в спецкурсах «Дыхание растений», «Фотосинтез», «Метаболизм органических кислот», а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 11-ой и 12-ой международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2007, 2008), международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), 3-й международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2008); межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2007, 2008, 2009), ежегодных научных
6 сессиях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2008, 2009).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях - 7 статьях и 5 тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (181 источников). Иллюстрационный материал включает 41 рисунок и 6 таблиц.
