Введение к работе
Актуальность проблемы. Важная роль в осуществлении адаптивных реакций организма принадлежит малатдегидрогеназной системе. Малатдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.37), являясь полифункциональным ферментным комплексом, обеспечивает протекание как конструктивного, так и энергетического обменов. Малатдегидрогеназный ферментный комплекс обеспечивает нормальное функционирование клеточного дыхания, перенос восстановительных эквивалентов, отток С^углеродных скелетов на биосинтетические процессы и т.д. В последнее время малатдегидрогеназа (МДГ) является объектом значительного количества исследований, но, несмотря на это, важные вопросы, связанные с образованием множественных молекулярных форм молекулы МДГ и факторами, влияющими на формирование четвертичной структуры, остаются слабо изученными.
Наличие в клетке различных процессов, связанных с функционированием одного фермента, требует сложной регуляции его активности. К механизмам такой регуляции может относиться наличие в клетке нескольких изоферментов, обладающих отличными свойствами и кодирующихся разными генами. Эукариоты содержат множественные формы МДГ, вовлеченные в многочисленные метаболические пути и расположенные в различных клеточных компартментах [Епринцев А.Т., 2007]. Для бактерий же не характерен изоферментный полиморфизм, однако МДГ может существовать в виде полимерных изоформ с различным количеством субъединиц [Парфенова Н.В., 2004, Климова М.А., 2006]. Особенностью метаболизма бактерий является то, что ЦТК независимо от условий роста выполняет конструктивную функцию, которая совмещена с энергетической при использовании органических субстратов в качестве единственного источника энергии [Шлегель Г, 1987]. Цитрамалатный шунт, функционирующий у бактерий Rhodobacter sphaeroides вместо глиоксилатного, строго необходим при росте микроорганизмов на ацетате для восполнения субстратов ЦТК, расходуемых на биосинтетические цели. Наличие взаимосвязи между присутствием или отсутствием цитрамалатного цикла и функционированием той или иной формы МДГ остается слабо изученным. Для решения вопроса о том, в каких условиях индуцируется цитрамалатный шунт, и связано ли это с образованием конкретной изоформы малатдегидрогеназы, использовали в качестве модели бактерии R. sphaeroides. Ранее было показано, что у фототрофных анаэробов, таких как Rhodospirillum rubrum, Rhodomicrobium vannielii [Tayeh M.A., Madigan M.T., 1988] функционирует тетрамерная форма МДГ в конструктивном обмене. Бактерии вида R. sphaeroides характеризуются наличием недавно обнаруженного и мало изученного цитрамалатного цикла, который подобно глиоксилатному является анаплеротической последовательностью ЦТК [Филатова Л.В. и др., 2005]. При переходе от одного типа питания к другому в метаболизме бактериальных клеток происходит изменение соотношения роли ЦТК и цитрамалатного цикла. Определенный интерес представляет исследование структурной организации
малатдегидрогеназной ферментной системы из R. в различных условиях культивирования. В связи с этим, выяснение структурной организации и функциональной роли малатдегидрогеназы из R. в условиях фото- и хемотрофного роста позволит внести существенный вклад в исследование механизма регуляции бактериального метаболизма в меняющихся условиях внешней среды.
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлось очистка, исследование физико-химических, регуляторных, кинетических характеристик изоформ малатдегидрогеназы из несерных бактерий R. sphaeroides , установление их генетической детерминации и функциональной значимости, а также выявление факторов, влияющих на образование той, или иной формы фермента.
Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать активность ферментов ЦТК и цитрамалатного цикла в разных условиях роста бактерий R. sphaeroides,^ также определить изоферментный состав МДГ из исследуемых бактерий.
Получить в гомогенном состоянии препараты изоформ малатдегидрогеназы из бактерий, выращенных на ацетате, либо сукцинате, как единственном источнике углерода
Изучить физико-химические свойства полученных в электрофоретически гомогенном состоянии препаратов изоформ МДГ.
Сравнить кинетические и регуляторные характеристики разных изоформ исследуемого фермента.
Выявить зависимость четвертичной структуры МДГ от условий культивирования R. sphaeroides.
Разработать высокоспецифичные прайм еры для идентификации генов МДГ на основе сравнения нуклеотидных последовательностей малатдегидрогеназы из различных организмов.
Осуществить ПЦР анализ ДНК из исследуемых бактерий, выращенных на различных источниках углерода для идентификации генов, кодирующих изоформы малатдегидрогеназы.
Провести количественный анализ уровня экспрессии гена малатдегидрогеназы из R. sphaeroides, культивируемых в разных условиях, методом ПЦР в реальном времени.
Выяснить роль различных физико-химических факторов, вызывающих процесс ассоциации-диссоциации фермента малатдегидрогеназы.
Научная новизна. Впервые получены гомогенные препараты изоформ малатдегидрогеназы из фототрофных микроорганизмов R. sphaeroides, отличающиеся по физико-химическим, кинетическим и регуляторным свойствам, а также особенностям структурной организации. Показано, что у бактерий R. sphaeroides, метаболизирующих ацетат через недавно открытый цитрамалатный цикл, малатдегидрогеназная система принимает участие в регуляции метаболизма за счет структурно-функциональных изменений белковой молекулы. Выявлено, что у этих микроорганизмов дим ер МДГ обеспечивает работу ЦТК, а тетрамер участвует в регуляции анаболических
реакций. Также установлено, что обе формы изучаемого фермента являются ничем иным как изоформами, т.к. кодируются одним геном. Впервые изучено влияние различных факторов на процесс ассоциации-диссоциации фермента МДГ и показано, что изменение рН с 7.0 до 8.5 вызывало ассоциацию дим еров с образованием тетрамеров, тогда как снижение величины рН до значения 6.0, напротив, сопровождалось диссоциацией димерной формы фермента с появлением мономеров МДГ.
Практическая значимость. Практическая значимость настоящей работы состоит в расширении и углублении знаний о роли структурно-функциональных изменений МДГ в механизмах адаптации бактерий к изменяющимся факторам внешней среды, а также в выявлении четкой корреляции между индукцией цитрамалатного цикла и синтезом тетрамерной формы МДГ. МДГ находит широкое применение в исследовательской практике, являясь удобным объектом для изучения структуры активных центров оксидоредуктаз, регуляции ферментативной активности, четвертичной структуры фермента, термодинамических параметров реакций. Высокоочищенные изоформы МДГ могут быть использованы для количественного определения малата в клеточном соке. Получение препаратов множественных молекулярных форм исследуемого фермента открывает перспективы его применения в научно-исследовательских изысканиях, связанных с исследованием ферментативной кинетики и моделированием сопряженных ферментных систем при патологиях, а также для биохимических анализов в лабораторной практике. Прикладные аспекты изучения пурпурных несерных бактерий определяются их использованием для удаления различных токсичных соединений. В последние годы получили развитие разные направления исследований пурпурных бактерий в связи с их использованием в биотехнологических процессах. К числу таковых относится применение пурпурных бактерий для очистки сточных вод с использованием полученной биомассы в животноводстве и в других целях.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, микробиологии, в спецкурсах по энзимологии, биохимическим механизмам адаптации прокариот, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 11-ой, 12-ой и 14-ой международных Пущин ских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2007, 2008 и 2010), международной конференции «Проблемы биоэкологи и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008), третьей региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2006), международной научной конференции «Современные проблемы адаптации и биоразнообразия» (Дагестан, 2006); межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж,
2005, 2007, 2008, 2010), ежегодных научных сессиях отчетной конференции
преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета
(2007,2010).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы
изложены в 11 публикациях - 6 статьях и 5 тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 146 страницах
