Введение к работе
Актуальность темы исследования. Фотосинтез является уникальным биосферным процессом, в ходе которого происходит превращение и запасание энергии света в энергию химических связей органических соединений, необходимых для жизнедеятельности большинства организмов Земли. Первичное преобразование поглощенной фотосинтетическими пигментами световой энергии в энергию разделенных зарядов протекает в мембранных белках - реакционных центрах (РЦ) фототрофных организмов, где происходит первичный перенос электрона между кофакторами с образованием трансмембранного потенциала. Квантовая эффективность начальных этапов фотосинтеза, составляющая почти 100%, очевидно, достигается путем тонкой регулировки свойств кофакторов за счет их взаимодействий друг с другом и с окружающим белком.
Исследования РЦ пурпурных аноксигенных бактерий имеют большое значение для понимания принципов и механизмов преобразования энергии при фотосинтезе. Аминокислотная последовательность белков и кристаллографическая структура бактериальных реакционных центров известна с середины 80-х годов XX века [Deisenhofer et al., 1984; Youvan et al., 1984a; Michel et al., 1985; 1986a]. Хорошо охарактеризованные бактериальные РЦ многие годы служат структурной и функциональной моделью для исследования более сложно организованной фотосистемы 2 зеленых растений и водорослей. РЦ пурпурных бактерий обладают рядом свойств, делающих их удобным объектом исследований. Среди них можно отметить сравнительную фото- и термостабильность, относительно простую организацию, спектральное разрешение полос поглощения отдельных кофакторов, наличие разработанных методов генетической и химической модификации, позволяющих манипулировать составом и свойствами кофакторов.
Фотосинтетический РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides представляет собой трансмембранный пигмент-белковый комплекс, состоящий из трех субъединиц белка и 10 кофакторов, образующих две структурно-функциональные ветви. Каждая ветвь начинается с димера бактериохлорофиллов (БХл) P, проходит через молекулы мономерного БХл, бактериофеофитина (БФео), и убихинона. Димер БХл выполняет функцию первичного донора электрона. Перенос электрона в нативных РЦ осуществляется по одной, так называемой А-ветви.
Детальный молекулярный механизм начальной стадии разделения зарядов в бактериальных РЦ остается объектом пристального внимания. До последнего времени активно обсуждалась роль мономерного бактериохлорофилла активной ветви переноса электрона BA и факторов, определяющих направленность электронного транспорта. Ранее были предложены две гипотезы переноса электрона от первичного донора Р на бактериофеофитин НА - по механизму супер-обмена, без непосредственного участия БХл Ba [Martin et al, 1986; Bixon et al., 1989], и двустадийный последовательный перенос с образованием промежуточной радикальной пары P+Ba" [Shuvalov et al., 1978]. В процессе исследования нативных и феофитин- замещенных РЦ Rba. sphaeroides методом фемтосекундной спектроскопии была зарегистрирована полоса при 1020 нм, соответствующая поглощению анион- радикала Ba", что свидетельствует в пользу второй гипотезы [Arlt et al., 1993; Kennis et al., 1997].
Использование сайт-направленного мутагенеза, позволяющего селективно замещать отдельные аминокислотные остатки в сайтах связывания хромофоров, дает уникальные возможности для исследования начальных стадий фотопереноса электрона в РЦ и роли отдельных пигментных кофакторов и аминокислотных остатков в этом процессе.
Цели и задачи исследования
Целью работы являлось исследование влияния ближайшего белкового окружения первичного акцептора электрона бактериохлорофилла ВА на его спектральные свойства и процессы разделения зарядов в реакционных центрах пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides. Были поставлены следующие задачи:
Внесение сайт-направленных мутаций и получение штаммов Rba. sphaeroides с аминокислотными замещениями в L-субъединице реакционного центра: H(L153)C, H(L153)L, H(L153)M, H(L153)Y и Y(L128)H; в M-субъединице: H(M182)L, а также с двойным замещением H(L153)Y+H(M182)L.
Выделение стабильных генетически-модифицированных реакционных центров, исследование их спектральных свойств и функциональной активности.
Исследование нестабильных мутантных РЦ в составе фотосинтетических мембран. Изучение их пигментного состава и фотохимической активности.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получены мутантные штаммы Rhodobacter sphaeroides, содержащие реакционные центры с одиночными аминокислотными замещениями гистидина в позиции L153 на цистеин и метионин, а также с двойным замещением, гистидина L153 на тирозин и гистидина M182 на лейцин.
Впервые показано, что замещение гистидина L153 на тирозин в реакционном центре Rba. sphaeroides приводит к потере мономерного БХл активной цепи кофакторов переноса электрона, сопровождающейся уменьшением стабильности пигмент-белкового комплекса. Впервые исследован процесс переноса электрона в мембраносвязанных мутантных реакционных центрах без первичного акцептора электрона. Методом лазерной спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением установлено, что переноса электрона в РЦ H(L153)Y с восстановленным хиноном Qa не происходит, наблюдается лишь релаксация возбужденного состояния специальной пары Р* в основное состояние. Показано значительное замедление скорости электронного транспорта в мутантном РЦ и десятикратное снижение квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами P+Qa-. Выявлено, что такой квантовой эффективности недостаточно для фотосинтетического роста бактерии.
Показано, что дополнительная к H(L153)Y замена гистидина M182 на лейцин, приводящая к замещению бактериохлорофилла Bb молекулой бактериофеофитина Фв, инициирует быстрый перенос электрона с Р* на молекулу Фв за ~3,5 пс с последующей рекомбинацией в основное состояние за 180 пс. Наблюдалось полное подавление переноса электрона в А-цепь в РЦ двойного мутанта.
В исследованиях реакционных центров с замещением тирозина L128 на гистидин, которое приводит к образованию водородной связи между аминокислотным остатком и БХл Ba, методом спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением впервые наблюдался сдвиг полосы поглощения 1020 нм до 1035 нм, подтверждающий, что данная полоса принадлежит анион-радикалу первичного акцептора электрона Ba-.
Полученные данные о значимости первичного акцептора электрона и его ближайшего окружения для фотосинтетического электронного транспорта в бактериальных реакционных центрах важны с точки зрения разработки высокоэффективных искусственных систем для преобразования солнечной энергии.
Апробация работы. Основные положения работы изложены на: International Meeting "Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems" (Пущино, 2006), 5-м Съезде Российского фотобиологического сообщества и Международной конференции «Преобразование света при фотосинтезе» (Пущино, 2008), 15th European Bioenergetics Conference (Дублин, 2008), XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009), 15th International Congress of Photosynthesis (Пекин, 2010), XXII Симпозиуме
«Современная химическая физика» (п. Шепси, 2010), International Meeting "Photosynthesis Research for Sustainability" (Баку, 2011), VI Съезде Российского фотобиологического общества (п. Шепси, 2011), Школе-конференции молодых учёных «Биосистема: от теории к практике» (Пущино, 2012) и ряде других конференция молодых ученых.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 24 печатных работы, из которых четыре - в реферируемых журналах из списка ВАК РФ, в том числе одна - в иностранном.
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения; обзора литературы; описания объектов и методов исследования; четырех разделов, где изложены результаты и их обсуждение; выводов и списка литературы. Объем работы составляет 117 страниц, в ней содержится 42 рисунка и 5 таблиц. Список литературы включает 293 источника.
