Введение к работе
Актуальность проблемы. Малатдегидрогеназный комплекс можно с уверенностью отнести к одной из систем, обеспечивающих жизнедеятельность многих организмов. НАД -зависимая оксид оредуктазная малатдегидрогеназа (МДГ) (К. Ф. 1.1.1.37) имеет универсальное распространение в клетках всех живых организмов - архей, эубактерий, грибов, растений и животных (Gietl, 1992; Епринцев, Игамбердиев, 1995; Musrati et al., 1998; Волвенкин и др., 1999; Minarik et al., 2002; Iannetta et al., 2004) и катализирует взаимопревращение малата в оксалоацетат, используя НАД+ или НАДН в качестве кофермента.
Обычно МДГ представлена в клетках различных организмов в виде множественных молекулярных форм, число которых изменяется в зависимости от групповой принадлежности живых существ, их образа жизни и сложности метаболизма. Помимо участия в процессах клеточного дыхания, в цикле трикарбоновых кислот и глиоксилатном цикле, малатдегидрогеназа способна играть важную роль в адаптации эукариот к различным стрессовым воздействиям.
Важное место в понимании механизма каталитического действия ферментов занимает исследование структуры активного центра белка. Для каждого фермента характерна определенная конформация активного центра, обеспечивающего специфическое взаимодействие с молекулами субстратов и осуществляющего каталитический акт. Причем для эффективного образования фермент-субстратного комплекса большое значение имеет не только геометрическое соответствие (комплементарность) молекул фермента и субстрата, но и образование водородных связей, электростатические и гидрофобные взаимодействия между атомами активного центра фермента и молекулами субстрата.
Структура активного центра изоферментов МДГ из различных источников может отличаться по типу аминокислотных остатков,
4 образующих микроокружение (дополнительные аминокислоты) и каркас
(вспомогательные аминокислоты) данного участка белковой молекулы. В то
же время структура активного центра МДГ обладает высокой степенью
консервативности (Steffan, McAlister-Henn, 1991; Bell et al., 2001; Lehnindger
et al, 2004).
Малатдегидрогеназа играет важную роль в компенсации различных метаболических стрессов, возникающих в экстремальных условиях жизнедеятельности организма. В литературе встречается много данных о влиянии высоких концентраций соли, высоких и низких температур, недостатка воды, связей, определяющих компактность упаковки белковой молекулы, на состояние малатдегидрогеназной системы (Minarik et al., 2002; Irimia et al., 2004; Madern, Zaccai, 2004). Структурные перестройки молекулы МДГ являются важнейшим регуляторным механизмом, обеспечивающим адаптивную реакцию к факторам различной природы (Eisenberg, 1995; Elcock, McCammon, 1998).
В связи с этим исследование аминокислотного состава активных центров малатдегидрогеназы, а также комплексное изучение свойств фермента из бактериальных объектов различной экологической природы представляет особый интерес.
Необходимость исследования продиктована широким
распространением бактерий в природе, их способностью адаптироваться к разнообразным условиям существования.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование физико-химических, кинетических и регуляторных характеристик малатдегидрогеназы бактериального происхождения, определение функциональных групп аминокислотных остатков, которые могут принимать участие в катализируемой малатдегидрогеназой ферментативной реакции, изучение строения активного центра МДГ из бактерий различных экологических групп.
5 Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:
Выделить и получить в электрофоретически гомогенном состоянии препараты малатдегидрогеназы из исследуемых бактерий;
Изучить субъединичное строение малатдегидрогеназы из бактерий Rhodovulum steppense A-20s;
Исследовать на высокоочищенных ферментных препаратах физико-химические, каталитические и регуляторные характеристики МДГ из Rhodovulum steppense A-20s;
Изучить влияние температуры на скорость ферментативной реакции и термостабильность МДГ из бактерий рода Rhodovulum;
Определелить с помощью метода химической модификации аминокислотный состав активного центра малатдегидрогеназы из бактерий Rhodovulum steppense A-20s и Sphaerotilus natans Д-507;
Выявить функциональные группы аминокислотных остатков, участвующие в ферментативной реакции, катализируемой МДГ;
Произвести расчет количества идентифицированных аминокислотных остатков в активных центрах МДГ из исследуемых бактериальных объектов.
Научная новизна. Впервые проведено изучение аминокислотного состава активных центров малатдегидрогеназы из бактериальных объектов различных экологических групп {Sphaerotilus natans Д-507 и Rhodovulum steppense A-20s). Получение гомогенных препаратов МДГ из исследуемых микроорганизмов позволило изучить кинетические и регуляторные свойства фермента. Выявлена важная структурная особенность димерной формы малатдегидрогеназы из галофильных бактерий Rhodovulum steppense штамм A-20s - большая по сравнению с МДГ из других объектов молекулярная масса субъединиц (48 кДа), обеспечивающая, по-видимому, повышенную жесткость структуры фермента, необходимую для его функционирования в экстремальных условиях.
6 Практическая значимость. Практическая значимость настоящей
работы состоит в расширении и углублении знаний о структуре активных
центров малатдегидрогеназы, о роли МДГ в механизмах адаптации бактерий
к факторам внешней среды. Полученные гомогенные препараты
малатдегидрогеназы могут быть использованы в научно-исследовательских
работах, связанных с изучением ферментативной кинетики, четвертичной
структуры фермента, термодинамических параметров реакций,
катализируемых МДГ.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, микробиологии, в спецкурсах по энзимологии, биохимическим механизмам адаптации прокариот, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 11-ой и 14-ой международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2007, 2010), международной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008), четвертом Всероссийском международном конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз, Россия» (Воронеж, 2011), межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2008, 2009, 2010, 2011), ежегодных научных сессиях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2010).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 14 публикациях - 10 статьях и 4 тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,
