Введение к работе
Актуальность работы. Растения - биосистемы, в которых важную роль в регулировании и нормализации течения биохимических процессов играют различные биомолекулы, среди которых большая часть имеет белковую природу. Белки растительного происхождения изучены в меньшей степени в сравнении с животными.
Лен, одна из важнейших сельскохозяйственных культур Тверского региона, изучен недостаточно с точки зрения отдельных классов биоорганических макромолекул. В частности мало исследованы основные биоорганические молекулы льна – альбумины – и их физико-химические и биохимические свойства. Есть информация, что семена льна (Linum usitatissimum L.) содержат от 18 % до 33 % белковых молекул (Гребинский С.К., 1967; Плешков Б.П., 1968, 1977; Лапина Г.П., 1981). Важность исследования белковых макромолекул определяется тем, что именно эта группа определяет структурные характеристики биотканей, их специфические функции и биохимические особенности, характеризует связь структуры и свойств. В то же время известно (Кретович В.Л., 1986; Лапина Г.П., 1999), что альбуминовые белки играют немаловажную роль в процессах роста и развития растений льна (создают тургор ткани, определяют транспорт микроэлементов, являются депо для аминокислот), а, следовательно, способны влиять на качество льняного волокна. Стойкость и перспектива качества зависят от фракции альбуминовых белков. В связи с этим изучение на молекулярном уровне альбуминов льна позволит приблизиться к созданию условий и механизмов, обеспечивающих высокое качество льняных волокон (Черников В.Г., Панкрушина А.Н., Григорьева А.Г, 2002).
Для выполнения этой задачи необходимо исследование структурно-функционального состояния белков не только в объеме, но и на границе раздела фаз. Именно на поверхности раздела локализованы и функционируют многие биомолекулы (Амбрамзон А.А., 1988; Измайлова В.Н., Ямпольская Г.П., 1991-2005), формирующие количество, длину элементарных волоконец и др.
Получение новой информации по исследованию поведения иммобилизованных белковых макромолекул – альбуминовых белков льна – представляет очевидный интерес с фундаментальной точки зрения. Исследования на молекулярном уровне механизмов образования и стабилизации искусственных коллоидных систем имеет огромное значение для льна, а также разработки новых лекарственных форм и новых технологий для пищевой и косметической промышленности и др.
Кроме того, изучение функционирования группы альбуминовых белков и ферментов (пероксидазы, о-ДФО и др.) в объеме и на границе раздела фаз тесно связаны с изучением механизмов регуляции и обмена, а также процессов роста и развития растений (Андреева Е.А, 1993).
Однако, в настоящее время в арсенале исследователей не разработаны в достаточной мере подходы и методы, позволяющие на молекулярном уровне изучать физико-химические свойства белков, адсорбированных на поверхности раздела, т.е. в иммобилизованном состоянии. Информация, встречающаяся в литературе (Геген Ж, 1991; Николаева М.Г., 1999), носит скорее качественный и эпизодический характер.
Таким образом, разработка современных методических подходов на стыке биохимии, коллоидной химии, физической химии и т.д. для получения новой информации о физико-химических и структурно-функциональных свойствах альбуминовых белков льна открывает широкие перспективы, как в плане фундаментальных исследований, так и для создания новых технологий для сельского хозяйства, пищевой промышленности, биотехнологии и медицины.
Особо следует отметить, что актуальность исследований поведения белковых молекул и в объеме водного раствора, и на границе раздела фаз определяется возможностью на этой основе разработать биохимические и физико-химические подходы по регулированию качественных, количественных и характеристик культурных сельскохозяйственных растений (на примере альбуминов льна).
Цель и задачи исследования. Цель работы – изучить биохимические и физико-химические свойства альбуминовых белков, выделенных из семян льна, и сформировать подходы в исследовании молекулярных (в объеме водного раствора) и иммобилизованных форм (в структуре адсорбционных слоев, сформированных на границе раздела вода-воздух) альбуминов льна.
В работе поставлены следующие задачи:
- изучить электрофоретическое поведение альбуминов, выделенных из стеблей льна, на разных стадиях роста и развития с целью подтверждения значимости именно этой группы белковых макромолекул льна;
- выделить и очистить фракцию альбуминовых белков из семян льна. Процедура выделения включает стадии гомогенизации, экстракции, центрифугирования и высаливания.
I часть. Для исследования физико-химических характеристик альбуминов льна в объеме водной фазы:
- получить и интерпретировать УФ-спектры фракции альбуминовых белков льна;
- количественно определить альбуминовые белки семян льна и рассчитать их содержание в семенах льна;
- определить и рассчитать молекулярную массу альбуминовой фракции льна.
II часть. С целью исследования иммобилизованной формы альбуминов льна:
- провести количественную оценку поверхностной активности водного экстракта фракции альбуминовых белков при рН 7 и варьировании ионной силы водной подложки в интервале 0 – 0,3 М, включающей построение изотерм адсорбции и их анализ по рассчитанному комплексу адсорбционных параметров: максимальной адсорбции (Гmax); площади, приходящейся на молекулу (Sмол), и толщины адсорбционного слоя (). На основе полученных данных построить и проанализировать молекулярные модели структуры адсорбционного слоя альбуминовых белков льна;
- определить размеры белковых ассоциатов с использованием метода электронной микроскопии.
Научная новизна результатов исследования. Теоретическая значимость работы.
В настоящее время практически отсутствуют прямые методы, позволяющие изучать структурные свойства белков адсорбированных (или иммобилизованных) на поверхностях раздела фаз. Данных по строению белков и белоксодержащих молекулярных ансамблей на поверхности раздела фаз в литературе практически не встречается.
В представленной работе впервые предложен принципиально новый подход, позволяющий исследовать структурные свойства адсорбированных (иммобилизованных) на поверхности раздела фаз индивидуальных белков – альбуминов льна.
Суть разработанного подхода состоит в изучении альбуминов льна, как в объеме, так и на поверхности раздела вода-воздух для получения наиболее полной количественной информации о свойствах альбуминов льна (молекулярной массы, концентрации, содержании в семенах льна, степени агрегации, адсорбции и т.д.).
С применением комплексного подхода получена детальная количественная информация о содержании альбуминовых белков в семенах льна-долгунца, их молекулярной массе, а также о структурных параметрах альбуминов, адсорбированных на границе раздела вода-воздух. Впервые предложены молекулярные модели структуры иммобилизованных альбуминов льна, механизмы их формирования. Показано, что применение такого подхода открывает новые возможности для исследования на молекулярном уровне механизмов формирования иммобилизованных белковых систем и их комплексов на поверхности раздела фаз, а также способов регуляции их характеристиками, что важно для решения прикладных задач, стоящих в льноводстве и связанных с получением льноволокна высокого качества.
Практическая значимость работы.
Практическая значимость характеризуется возможностью регулировать качественные, количественные и технические характеристики культурных сельскохозяйственных растений (льна) посредством варьирования комплекса биохимических и физико-химических параметров отдельных групп биоорганических молекул на примере белков альбуминов, как в объеме, так и на границе раздела, т.е. в иммобилизованной форме.
Наряду с неоспоримой фундаментальной значимостью исследований объемных и поверхностных свойств и особенностей функционирования белков представляют особый интерес с точки зрения практического применения. Немаловажный аспект прикладного применения результатов такого рода исследований – разработка новых пищевых коллоидных систем и биологически активных добавок, а также белок– и фермент–содержащих синтетических моющих средств. В связи с широкими перспективами практического применения исследования молекулярных параметров альбуминовых белков на поверхности раздела и в объеме водной фазы привлекает все большее внимание исследователей.
В частности, многие пищевые продукты представляют собой коллоидные системы, в которых белки и их комплексы выполняют роль стабилизаторов. Адсорбционные свойства белков в них определяют условия получения, текстуру и вкусовые качества пищевых продуктов.
Показано, что эффективными методами контроля процесса образования текстуры и стабильности белок-содержащих иммобилизованных систем являются варьирование физико-химических свойств среды.
Найденные закономерности и предложенный подход могу служить физико-химической основой при разработке новых продуктов в пищевой и косметической промышленности, при разработке новых лекарственных форм, путей регуляции процессами роста и развития льноволокна с целью получения наиболее качественных его параметров.
Полученные результаты перспективны в плане рассмотрения круга практического использования белков и ферментов для аналитических целей и в тонком органическом синтезе.
Полученные данные по исследованию биохимических и физико-химических свойств альбуминов семян льна используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре физико-химической экспертизы биоорганических соединений ТвГУ: в курсе лекций, семинарских занятий, при подготовке курсовых и дипломных работ студентов и аспирантов.
Научные результаты, выносимые на защиту.
-
Выявлена и подтверждена существенная доля фракции альбуминовых белков льна во фракции водорастворимых белков по данным диск-электрофореза в ПААГе.
-
Уф-спектры альбуминов льна имеют максимум поглощения, приходящийся на длину волны , равную 280 нм.
-
На основе результатов двух методов – УФ-спектроскопии и методом биуретовой реакции - рассчитано содержание альбуминов в семенах льна, составляющее (1,75+ 0,05) 10-3 г/г сырой массы семян льна.
-
Проведен расчет молекулярной массы альбуминов льна, равный 82000±5700, с применением метода электрофореза на агарозе и построением калибровочного графика по коммерческим препаратам белков: САЧ (сывороточному альбумину человека), ПОХ (пероксидазе хрена) и АДГ (алкогольдегидрогеназе печени лошади).
-
Иммобилизация альбуминов льна границе вода-воздух позволяет получить устойчивые формы адсорбционных слоев белка, структурные характеристики (максимальную адсорбцию Гm; площадь, приходящуюся на молекулу SA, и толщину адсорбционного слоя ) которых можно варьировать, меняя ионную силу водной подложки.
-
Предложены молекулярный механизм формирования структур адсорбционных слоев альбуминов льна и модели этих структур.
-
Методом электронной микроскопии получены электронномикроскопические имиджи структуры межфазных адсорбционных слоев альбуминов льна и определены размеры разрешенных элементов структуры.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Полученные результаты соответствуют пункту 4 паспорта специальности 03.01.04 «Биохимия (биологические науки)».
Апробация и реализация результатов диссертации
Основные положения и выводы диссертации апробированы в выступлениях на научных конференциях. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на III Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронежская государственная технологическая академия, Воронеж, 2005); III, V научной конференции аспирантов и студентов химического факультета (Тверской государственный университет, Тверь, 2004, 2006); XIV, XVII Региональных Каргинских чтениях. Областной научно-технической конференции молодых ученых «Физика, химия и новые технологии» (Тверской государственный университет, Тверь, 2007, 2010); Научной сессии РАН «Применение поверхностно-активных веществ в сельском хозяйстве: производство и переработка сельхозпродукции» (Белгородский государственный университет, Белгород, 2009); Всероссийской научной школе для молодежи «Приборное и научно-методическое обеспечение исследований и разработок в области каталитического превращения бифункциональных органических соединений» (Тверская государственная сельскохозяйственная академия, Тверь, 2010); III Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2010» (Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород, 2010); IV Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронежский государственный университет, Воронеж, 2011); Международном семинаре «Роль льна в улучшении среды обитания и активном долголетии человека» (ВНИИ льна, Торжок, 2012); научно-методического семинаре «О взаимосвязи структурно-динамических свойств ферментов с их функциональной активностью» (ТвГУ, Тверь, 2012), а также на научных семинарах кафедры физико-химической экспертизы биоорганических соединений ТвГУ и при выполнении курсовых и дипломных работ, в которых соискатель был научным руководителем.
Публикации. Результаты исследования отражены в 26 публикациях, 2 из которых в рецензируемых научных журналах, включенных в перечень ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 листах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 7 таблиц, 25 рисунков, 2 схемы.
