Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Структурно-функциональное разнообразие мышц 11
1.2. Гладкие мышцы моллюсков 13
1.2.1. Регуляция сократительного цикла гладких мышц моллюсков... Запирательный тонус (catch) гладких мышц моллюсков 15
1.2.2. Миород и твитчин - новые белки запирательных мышц моллюсков 17
1.3. Гладкие мышцы мускульного желудка птиц 26
1.3.1. Регуляция сократительного цикла гладких мышц мускульного желудка птиц 27
Активация киназы и фосфатази легких цепей миозина 29
1.3.2. Телокин - новый регуляторный белок гладких мышц мускульного желудка птиц 30
Строение и свойства телокина 30
Глава 2. Материал и методы исследования 33
2.1. Выделение белков из гладких мышц моллюсков 33
2.2. Выделение белков из гладких мышц позвоночных 38
2.2.1. Выделение миозина 38
2.2.2. Выделение регуляторных легких цепей миозина 39
2.2.3. Выделение киназы легких цепей миозина и телокина 40
2.2.4. Выделение кальмодулина 42
2.3. ДСН-электрофорез в полиакриламидиом геле 43
2.4. Соосаждение смесей миозина и телокина в глицериновом градиенте 44
2.5. Полимеризация миорода 46
2.6. Фосфорилирование белков 51
Вспомогательные методы 53
Глава 3. Результаты исследования 56
3.1. Исследование физико-химических свойств миорода 56
3.1.1. Протеолитическое расщепление миорода папаином 56
3.1.2. Особенности полимеризации миорода и свойства его полимеров 64
3.1.3, Влияние N-этилмалеимида на полимеризацию миорода 72
3.1.4, Фосфорилирование миорода киназой легких цепей миозина 77
3.2. Локализация киназы и фосфатазы легких цепей миозина гладких мышц позвоночных 89
3.3. Влияние телокина на скорость фосфорилирования и дефо сформирования миозина 91
3.4. Взаимодействие телокина с миозином 94
3.5. Влияние телокина на ассоциацию киназы и фосфатазы с толстыми нитями 98
Глава 4. Обсуждение результатов 102
4.1. Строение молекулы миорода и его локализация 102
4.2. Полимеризация миорода и свойства его полимеров 103
4.3, Зависимость полимеризации миорода от состояния SH групп.. 105
4.4. Фосфорилирование миорода .108
4.4. Возможное участие миорода в запирательном тонусе 112
4 4.5. Телокин - регуляториый белок толстых нитей гладких мышц позвоночных 114
Выводы 117
Список литературы 119
- Регуляция сократительного цикла гладких мышц моллюсков... Запирательный тонус (catch) гладких мышц моллюсков
- Выделение киназы легких цепей миозина и телокина
- Особенности полимеризации миорода и свойства его полимеров
- Фосфорилирование миорода
Введение к работе
Актуальность проблемы. В основе сокращения мышц лежит взаимодействие миозина и актина (Huxley and Hanson, 1957), которое стимулируется повышением концентрации кальция в саркоплазме. Последующее снижение концентрации кальция в фазных мышцах приводит к их быстрому расслаблению. В гладких тонических мышцах это расслабление замедлено, что позволяет мышцам некоторое время поддерживать напряжение при незначительном расходе энергии. В случае гладких мышц позвоночных такое состояние называется latch. В гладких мышцах беспозвоночных - двустворчатых моллюсков - это явление (catch) выражено очень ярко. Запирательные мышцы моллюсков могут часами находиться в сокращенном состоянии без признаков утомления. Молекулярные механизмы catch и latch неизвестны и вызывают большой интерес, поскольку их трудно объяснить в рамках бытующих в настоящее время представлений о механизмах биологической подвижности.
В гладких мышцах взаимодействие миозиновых (толстых) и актииовых (тонких) нитей инициируется активированием толстых нитей либо прямым связыванием кальция с легкими цепями миозина (беспозвоночные), либо посредством фосфорилирования легких цепей киназой легких цепей миозина в присутствии кальция (позвоночные). Представляется вероятным, что белки, связанные с толстой нитью, могут модулировать актин-миозиновое взаимодействие, замедляя или приостанавливая расслабление, и тем самым придавать сократительному процессу ту или иную степень тоничности. Такими белками в запирательных мышцах моллюсков могут быть твитчин (Vibert et al., 1993) и миород (Shelud'ko et al., 1998a). Известно, что белок толстых нитей гладких мышц позвоночных - телокин in vitro влияет на скорость фосфорилирования миозина (Shirinsky et al., 1993) и, следовательно,
7 может быть потенциальным модулятором актив-миозинового взаимодействия.
Твитчин, действительно, принимает участие в регуляции catch-состояния мышц моллюсков (Siegman et al., 1998). Его дефосфорилирование in vivo приводит мышцу в catch-состояние, а фосфорилирование вызывает расслабление мышцы. Согласно «мостиковой» гипотезе catch (Lowy et al., 1964), фосфоршгарованный твитчин взаимодействует с миозином, в результате чего миозин остается связанным с актином при понижении концентрации кальция, образуя catch-сшивки (Butler et al., 2001). Согласно альтернативной «твитчиновой» гипотезе, твитчин является одновременно и регуляторным и исполнительным белком, образуя независимые catch-сшивки между толстыми и тонкими нитями (Shelud'ko et al., 2004b). Функция миорода остается неясной. Пока не получено доказательств его прямого участия в catch (Shelud'ko et al., 2001; Yamada et al, 2001),
Ввиду очевидного функционального сходства между явлениями catch в запирательных мышцах моллюсков и latch в гладких мышцах позвоночных, не исключено, что существует и сходство молекулярных механизмов этих явлений. Если это так, то один из возможных подходов к выяснению этих механизмов является сравнительное изучение белков гладких мышц позвоночных и беспозвоночных, предположительно принимающих участие в данных явлениях.
Цели и задачи работы. Целью работы было исследование миорода из запирательных мышц мидии Грея и телокина из гладких мышц желудков индейки с тем, чтобы расширить существующие представления о свойствах этих белков и их роли в данных мышцах и, возможно, обнаружить между ними сходство во влиянии на актин-миозиновое взаимодействие. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать субструктуру и физико-химические свойства миорода.
8 2. Изучить механизм действия телокина на процессы ф о сформирования и дефосфорилирования миозина.
Положения, выносимые на защиту:
1. Установлена протеолитическая субструктура миорода, построенная по результатам ограниченного протеолиза миорода папаином.
Миород в зависимости от условий среды образует различные полимеры: короткие, длинные нитевидные и латеральные агрегаты нитевидных полимеров.
Полимеры миорода обладают высокой вязкостью и сильно выраженной тиксотропией.
4. Модификация аминокислоты Cys722 миорода N-этилмалеимидом полностью ингибирует его полимеризацию, но придает ему способность к агрегации в присутствии Mg2"h.
Обнаружено фосфорилирование миорода киназой легких цепей миозина и локализовано место фосфорилирования.
Показано влияние телокина на скорость дефосфорилирования миозина гладких мышц позвоночных.
Научная новизна работы. Определена протеолитическая субструктура миорода - нового белка запирательных мышц моллюсков. Показано, что эта субструктура аналогична субструктуре миозина. Предполагается, что уникальный N-концевой домен миорода расположен в межфиламентном пространстве и способен модулировать взаимодействие между толстыми и тонкими нитями. Выявлена сильная зависимость полимеризации миорода от условий среды. Описаны три разновидности полимеров миорода, которые, однако, не включают веретенообразные полимеры, характерные для миозина. Предполагается, что уникальный домен миорода влияет на характер его полимеризации. Установлено, что
9 модификация всего лишь одной аминокислоты (Cys722) в стержневой части миорода радикально меняет его свойства - он теряет способность к полимеризации и приобретает способность к агрегации. Предполагается, что эта аминокислота входит в состав регуляторного домена, воспринимающего конформационные изменения парамиозина, либо других поверхностных белков толстых нитей - миозина и твитчина. Выявлены высокая вязкость и ярко выраженная тиксотропия нитевидных полимеров миорода, в основе чего, как предполагается, лежит способность этих полимеров к латеральной агрегации. Обнаружено, что миород способен фосфорилироваться киназой легких цепей миозина позвоночных, которая отсутствует в мышцах моллюсков, но входит в качестве домена в состав гигантского белка твитчина, регулирующего catch-состояние в мышцах моллюсков. Показано, что киназа в составе твитчина является активной. Предполагается, что миород может быть субстратом этого киназного домена и принимать участие наряду с твитчином в регуляции запирательного тонуса мышц моллюсков.
Обнаружено, что телокин — белок толстых нитей мышц позвоночных — не только уменьшает скорость фосфорилирования миозина из этих мышц, но и увеличивает скорость дефосфорилирования миозина. Предложен механизм влияния телокина на фосфатазно-киназную активность в данных мышцах.
Научно-практическое значение работы. В работе детально описаны методы выделения и очистки миорода, твитчина и телокина, модификация метода ДСН-электрофореза и метод протеолитического расщепления миорода, которые могут быть использованы в других исследованиях в области биологической подвижности. Предложенные механизмы и интерпретации экспериментальных данных могут быть полезными при изучении механизма регуляции гладких мышц.
Апробация работы и публикации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино, 2001, 2004), III
10 Биофизическом съезде (Воронеж, 2004), VIII и IX международных школах-конференциях молодых ученых (Пушино, 2004, 2005) и ежегодной научной конференции Института биологии моря ДВО РАН (Владивосток, 2005). По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав - обзор литературы (гл. 1), описания методов исследования (гл. 2), изложения результатов и их обсуждения (гл. 3 и 4), выводов и списка литературы из 152 наименований. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста. В диссертации 2 таблицы и 37 рисунков.
Данная работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 01-04-49-462 и 05-04-49895), Конкурса проектов ДВО РАН (гранты 01-04-49462 и№ 05-Ш-Г-06-078), Программы обменов Австрийской Академии Наук и Фонда содействия отечественной науке (грант конкурса «Лучшие аспиранты РАН»)
Регуляция сократительного цикла гладких мышц моллюсков... Запирательный тонус (catch) гладких мышц моллюсков
После фазы активного сокращения и снижения концентрации Са + до уровня покоя (10" М) запирательная мышца не расслабляется, как это наблюдается для обычных мышц (Twarog and Muneoka, 1973), а переходит в особое состояние - catch (Twarog, 1976; Cohen and Castellani, 1988). Данное состояние длительного напряжения может поддерживаться часами после завершения стимуляции холинэргического нерва. Мышца остается в сокращенном состоянии и характеризуется сопротивлением к растяжению в покое, поддерживая высокое напряжение при незначительных энергетических затратах, несмотря на низкий уровень Са (Twarog and Muneoka, 1973; Ishii et al., 1989), Расслабление из catch стимулируется серотонинэргическим нервом и опосредовано увеличением в саркоплазме концентрации цАМФ, активирующего цАМФ-зависимую протеинкиназу А (Cole and Twarog, 1972). Субстратом протеин киназы А (РКА) является белок твитчин (Siegman et al., 1997, 1998), ассоциированный с толстыми нитями моллюсков (Vibert et al., 1993; Shelud ko et al., 2004a), фосфорилирование которого приводит к быстрому расслаблению мышцы (Siegman et al., 1998). Таким образом, существует тесная связь между состоянием фосфорилирования твитчина в гладкой мышце и присутствием или отсутствием catch состояния в этой мышце (Siegman et al,, 1997, 1998). Фосфорилирование твитчина РКА характеризуется быстрым включением двух молекул фосфора на молекулу твитчина, а более длительная инкубация в присутствии РКА приводит к фосфорилированию еще одного участка в молекуле твитчина (Funabara et al., 2003). Дефосфорилирование твитчина происходит в активной фазе сокращения посредством Са """-активируемой фосфатазы РР2В (Castellani and Cohen, 1992; Yamada et al., 2004). Однако как исполнительная структура запирательного тонуса, так и молекулярные основы, обеспечивающие поддержание силы в течение длительного периода при незначительных энергетических затратах, до сих пор неизвестны.
Считается, что catch-состояние может быть связано с медленной скоростью открепления поперечных мостиков миозина от актиновых нитей (для обзора см. Lowy et al., 1964). Это значит, что актомиозиновые связи, являющиеся сшивками между толстыми и тонкими нитями, в зависимости от условий могут обеспечивать как сокращение, так и поддержание длительного тонуса. Согласно этой гипотезе, именуемой «мостиковой», предполагается, что твитчин взаимодействует с миозином и способ этого взаимодействия зависит от уровня фосфорилирования твитчина. Дефосфорилированный твитчин придает миозиновым мостикам catch»свойства, в то время как фосфорилированный не меняет цикл работы миозиновых мостиков (Butler et al, 1998, 2001; Funabara et al., 2001, 2003; Siegman et al., 1997, 1998; Yamada etal.,2001).
Существует также альтернативная гипотеза, предполагающая наличие двух независимых систем, одна из которых ответственна за сокращение, а другая за catch-состояние (Ruegg, 1964). Данная гипотеза подтверждается наблюдениями, в которых мышцу в активном или catch-состояниях обрабатывали веществами, ингибирующими генерацию силы и АТФазу миозина. В случае сокращения данное воздействие приводит к полному расслаблению мышцы, тогда как в catch-состоянии («catch-связи») расслабления не происходит (Ruegg, 1964; Galler et al., 1999, 2005; Mukou et al., 2004), что указывает на существование независимых связей, отличных от актомиозиновых. На роль независимых catch-мостиков могут претендовать белки толстых нитей - миород (catchin) (Shelud ko et al., 1999b; Yamada et al, 2000) и твитчин (Shelud ko et al., 2004a, 2004b). Однако миород не способен взаимодействовать с актином и не влияет на актомиозиковую АТФазу (Shelud ko et al., 2001). Его функция в гладких запирательных мышцах до сих пор не ясна. С другой стороны, нами была обнаружена способность твитчина взаимодействовать с Ф-актином, причем это взаимодействие зависит от степени фосфорилирования твитчина таким же образом (Shelud ko et al., 2004b), как от фосфорилирования твитчина зависит состояние catch нативной мышцы (Siegman et al., 1998). Более того, мы показали, что твитчин может напрямую взаимодействовать с парамиозиновой основой толстой нити и обеспечивать, в присутствии Ф-актина, агрегацию парамиозинового стержня (Shelud ko et al., 2004а). Это не означает, что твитчин в составе толстой нити не взаимодействует с миозином, но открывает возможность реализации твитчином его регуляторной роли другим способом. Согласно предложенной нами «твитчиновой» гипотезы запирательного тонуса, в основе этого явления лежит образование твитчиновых сшивок между толстыми и тонкими нитями, которые регулируются фосфорилированием твитчина (Shelud ko et al., 2004b). Данное предположение о «твитчиновом» происхождении catch-мостиков согласуется с данными о существовании независимой системы поперечных связей между толстыми и тонкими нитями (Galler et al., 1999, 2005; Mukou et al, 2004; Sugi et al., 1999; Takahashi et al, 2003).
Первоначально считалось, что в составе толстых нитей запирательных мышц двустворчатых моллюсков присутствует только два компонента -парамиозин, образующий основу толстых нитей и миозин, молекулы которого располагаются на его поверхности. Однако, с помощью ДСН 18 электрофореза, многие исследователи наблюдали неизвестный компонент в миофибриллах белого аддуктора устриц (Elliott et al., 1974), обоих аддукторов Crenomytilus и ABRM (Премингер, 1977) и гладкого аддуктора гребешка (Kondo and Morita, 1981; Shelud ko and Preminger, 1989), По данным Элиота (Elliott et al., 1974) этот компонент в препаратах толстых нитей устрицы, электрофоретическая подвижность которого близка к подвижности С-белка (135 кДа), исчезает после экстракции миозина.
Впервые этот белок (ПО кДа компонент) был выделен Кастелляни с соавторами (Castellani et al., 1988) из переднего биссусного ретрактора (ABRM) Mytilus edulis и ошибочно идентифицирован как продукт протеолитического распада миозина, а именно, как стержневая часть миозина (myosin rod protein), на основании сходства аминокислотной последовательности пептидов миозина и белка 110 кДа. Этот белок (120 к Да), который оказался устойчивым к органическим растворителям, был выделен А. А. Орловой из неочищенных препаратов парамиозина запирательных мышц нескольких видов моллюсков и ошибочно идентифицирован как высокомолекулярная форма парамиозина (Орлова, 1990).
Далее, из гладкого аддуктора гребешка Ксизмадиа с соавторами посредством тепловой обработки, получили теплоустойчивый белок (100-110 кДа), который они ошибочно идентифицировали как кальдесмон-подобыый (Csizmadia et al., 1994). По их данным, белок взаимодействовал с фибриллярным актином, ингибировал АТФазную активность актомиозина и его частичная аминокислотная последовательность была гомологична последовательности кальдесмона (следует отметить, что эти свойства не были подтверждены в последующих исследованиях (Yamada et al., 2001; Shelud ko et al.; 2001)).
Выделение киназы легких цепей миозина и телокина
Источником для выделения регуляторных легких цепей (РЛЦ) был препарат миозина из гладких мышц желудков индейки. К миозину (100 мг) добавляли 200 мл буфера, содержащего 5 М мочевины, 2 М гуанидин-НС1 (GuHCl), 0.1% МЭТ, 10 мМ ЭДТА, рН 10.3 (ЭДТА буфер), затем смесь гомогенизировали, добавляли 2 мл МЭТ/100 мл и инкубировали раствор при постоянном перемешивании 1 час при температуре 35С. После инкубации к раствору добавляли один объем холодной воды, интенсивно перемешивали, а затем еще один объем холодного 96% этанола (также интенсивно перемешивая). Смесь центрифугировали при 4200 об/мин, 30 мин для удаления тяжелых цепей миозина. Супернатант ставили на диализ против воды при +4С в течение суток. Диализат концентрировали сульфатом аммония, переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали при 4000 об/мин, 30 минут. Осадок растворяли в ЭДТА буфере и диализировали против буфера, следующего состава: 60 мМ КС1, 10 мМ лимонной кислоты, 2 мМ MgCl2, 0.5 мМ ДТТ, рН 5.4. После диализа, осадок вновь растворяли в небольшом объеме ЭДТА буфера и наносили на ионообменную колонку с DEAE сефарозой CL 6В (Sigma), предварительно уравновешенную ЭДТА буфером. После нанесения колонку промывали двумя объемами буфера, содержащего 60 мМ КС1, 2 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 10 мМ имидазол-HCl, рН 7.0 и элюировали легкие цепи миозина при помощи линейного градиента NaCl (100-300 мМ). Первый пик представляет регуляторные легкие цепи, второй - существенные легкие цели миозина (Sobieszek, 1988). После идентификации фракций, содержащих регуляторные легкие цепи методом ДСН-электрофореза их объединяли, измеряли концентрацию Биуретовым методом и замораживали при -30С.
Миофибриллы, (полученные так же, как и при выделении миозина) экстрагировали в 3 литрах KES (kinase extracted solution) - 60 мМ КО, 30 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 40 мМ имидазол-НО, рН 7.6. Экстракт после центрифугирования фракционировался сульфатом аммония на две фракции -40-55% насыщения для киназы легких цепей миозина (КЛЦМ) и 55-75% насыщения для телокина.
Осадок фракции 40-55% насыщения растворяли в небольшом объеме буфера А следующего состава: 60 мМ КО, 2 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 10 мМ имидазол-НО, рН 7.0, разбавляли двумя объемами холодной воды и наносили на ионообменную колонку с DEAE сефарозой CL 6В (Sigma), предварительно уравновешенную буфером А. После нанесения фракции, колонку промывали двумя объемами этого же буфера и элюировали киыазу при помощи линейного градиента NaCl (100-400 мМ, 1 л). После идентификации киназ-содержащих фракций методом градиентного (9-18%) ДСН-электрофореза их объединяли, измеряли концентрацию КЛЦМ, используя коэффициент абсорбции при 278 нм А л%= 1.1 (Adelstein and Klee, 1981), с соответствующей молекулярной массой 107.5 кДа. КЛЦМ замораживали в присутствии 25% глицерина в жидком азоте и хранили при -70С.
После центрифугирования (10000 об/мин5 30 мин) осадок фракции 55-75% был растворен в небольшом объеме буфера 60 мМ КО, 2 мМ MgCb, 1 мМ ДТТ, 10 мМ имидазол-НО, рН 7.0 и заморожен при -30С. Обычно четыре таких осадка (из четырех выделений) использовались для получения телокина. Растворенный осадок был осветлен (10000 об/мин, 30 мин) и с помощью изоэлектрического осаждения при рН 4.8 из препарата телокина удаляли тропомиозин.
После центрифугирования (10000 об/мин, 20 мин) супернатант (в котором подводили рН с 4.8 до 7.0) диализовали против буфера 60 мМ КС1, 2 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 10 мМ имидазол-НО, рН 7.0 и наносили на ионообменную колонку (30 см х 2.5 см) с DEAE сефарозой CL 6В (Pharmacia, Uppsala, Sweden), предварительно уравновешенную диализным буфером. После нанесения белка, колонку промывали двумя объемами буфера и элюировали телокин при помощи линейного градиента NaCl (150-350 мМ, 1.5 л), в присутствии 0.5 мМ ЭГТА. Фракции, содержащие телокин, идентифицированные с помощью ДСН-электрофореза, были объединены и сконцентрированы добавлением сульфата аммония до 75% насыщения. После растворения осадка в буфере 60 мМ КО, 2 мМ MgCl2, 0.5 мМ ЭГТА, 1 мМ ДТТ, 10 мМ имидазол-HCl, рН 7.0 и диализа против этого буфера, телокин был дополнительно очищен с помощью гель-фильтрации на колонке (92 см х 3.2 см) с носителем АсА54 (LKB, France). Пик телокина был собран, концентрирован сульфатом аммония и поставлен на диализ против 60 мМ КС1, 2 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 10 мМ имидазол-HCl, рН 7.0. В конечном препарате измеряли концентрацию белка биуретовым методом и замораживали при-30 С.
К первой отмывке гомогената добавляли ЭГТА до 5 мМ и сульфат аммония до 55% насыщения (для удаления тропомиозина и других примесей). После центрифугирования (4200 об/мин, 30 мин), аккуратно отделяли флотирующий слой и фильтровали супернатант через стеклянную вату. К профильтрованному супернатанту добавляли СаС12 до 5 мМ, сульфат аммония до 75% насыщения и центрифугировали 4200 об/мин, 60 мин. Осадок растворяли в небольшом объеме буфера А, содержащего 60 мМ КС1, 2 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 10 мМ имидазол-HCl, рН 7.0 и, перед нанесением на колонку, диализировали против этого же буфера. К супернатанту добавляли 0.5 мМ СаС12, 15% сульфата аммония и осветленный супернатант наносили на Phenyl Sepharose affinity column (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Колонку промывали двумя объемами буфера А и элюировали кальмодулиы (СаМ) этим же буфером, но в присутствии 2 мМ ЭГТА. Фракции СаМ, идентифицированные ДСН-электрофорезом, объединяли, концентрировали сульфатом аммония, диализовали против буфера А и дополнительно очищали на гель-фильтрации с носителем АсА54 (LKB, France). После идентификации фракций градиентным ДСН-электрофорезом и их объединения, СаМ повторно концентрировали сульфатом аммония и ставили на диализ против буфера А. Концентрацию СаМ измеряли, используя коэффициент абсорбции при 278 нм Аа,г- 0.18 (Klee and Krinks, 1978), с соответствующей молекулярной массой 16.7 кДа, и замораживали при —30С.
Чистоту и состав препаратов определяли методом ДСН-электрофореза (Laemmli, 1970), который был модифицирован для получения высокого разрешения в области высокомолекулярных пептидов, позволяющий в неградиентном геле анализировать полипептиды в диапазоне от 30 до 600 кДа (Шелудько, 1975; Shelud ko et al., 2004b).
Особенности полимеризации миорода и свойства его полимеров
Протеолитическая субструктура миорода, полученная по результатам ограниченного протеолиза папаином, аналогична миозиновой (рис. 9). Миород имеет «головной» домен (аналог S1 миозина) и стержневой домен (аналогичен стержневой части миозина). Стержневая часть в растворах с высокой ионной силой расщепляется на «шейный» (аналог S2 миозина) и «хвостовой» (идентичен LMM миозина) домены.
Миород локализован на поверхности парамиозиновой основы толстых нитей. Следует ожидать, что он взаимодействует с ней таким же образом, как и миозин - посредством С-стержневой части молекулы (Норре and Waterston, 2000), которая по аминокислотному составу практически идентична стержневой части миозина (Yamada et al., 2000). Сходное расположение участков аминокислотной последовательности парамиозина, стержневой части миозина (McLachlan and Kami, 1983) и, соответственно, миорода (Yamada et al., 2000), указывает на существование специфических взаимодействий между этими белками.
«Шейный» и «головной» участки предположительно находятся в межфиламентном пространстве. Головной домен полностью состоит из уникальной аминокислотной последовательности миорода, его размеры составляют 10,9 кДа или 12,5 кДа в зависимости от условий расщепления (рис. 9). Уникальная последовательность миорода формирует не только «головной» домен, но и часть (16%) «шейного» (рис, 9). Остальная часть шейной области является общей с S2 фрагментом миозина, однако включает в себя только 41% последовательности S2.
Таким образом, миород, миозин и парамиозин образуют единый белковый комплекс, в котором миозин и миород взаимодействуют посредством С-стержневых частей с поверхностным слоем парамиозина на парамиозиновой основе толстых нитей. Следует отметить, что регуляторный белок твитчин, по нашим данным, также является поверхностным белком толстых нитей (Shelud ko et al., 2004b) и способен взаимодействовать с миозином (Yamada et al., 2001), парамиозином (Shelud ko et al., 2004a) и, как показано в данной работе, с миородом (рис. 28).
Известно, что полимеризация миозина обеспечивается стержневой частью его молекулы, содержащей ACD-участок (assembly competence domain) (рис. 1), изменение которого приводит к подавлению полимеризации (Sohn et al., 1997). Поскольку стержневая часть миорода идентична миозиновой следует ожидать, что особенности его полимеризации должны быть такими же, как у миозина. Однако, миород не образует биполярных нитей, типичных для миозина. Для полимеров миорода характерна сильная зависимость от условий полимеризации, позволяющая формировать полимеры различного типа: короткие полимеры, длинные нитевидные полимеры и их латеральные агрегаты (рис. 14). Тот факт, что миозин и миород образуют полимеры с разным строением и свойствами, наводит на мысль о том, что нестержневые участки этих белков также принимают участие в агрегационно-полимеризационных процессах. Следовательно, наличие ACD-участка в стержневой части белков (такой домен был также обнаружен в парамиозине (Cohen and Parry, 1998)) обеспечивает их способность к полимеризации, но не определяет всех ее особенностей.
Полимеры миорода обладают высокой вязкостью, на порядок превышающую таковую миозина. Оказалось, что вязкость миорода, измеренная при низких градиентах скорости, даже несколько превышает вязкость Ф-актина, белка, известного своей высокой вязкостью (рис. 10). Показано, что высокая вязкость миорода связана с его тиксотропными свойствами. Высокая тиксотропия миорода обусловлена структурной вязкостью его растворов, определяемой межмолекулярными взаимодействиями, в отличие, например, от тиксотропии Ф-актина, которая связана с изменением формы и размеров Ф-актина при механическом воздействии (Oosawa Р., 1993). По всей вероятности, эти межмолекулярные взаимодействия выражаются в латеральной агрегации нитей миорода (рис. 14 б), что может приводить к образованию трехмерной сети в его растворах так, как это происходит при полимеризации актина в присутствии актин-связывающих белков (Pollard and Cooper, 1982). Однако присутствие миород-связывающих белков в его растворах маловероятно (Shelud ko et al., 2001) и поэтому способность нитей миорода взаимодействовать бок-о-бок является, скорее всего, свойством самого миорода. Похоже, что этот белок способен образовывать различные миород-миородовые связи в зависимости от условий среды, что приводит к образованию различных полимеров: короткие полимеры и длинные нитевидные полимеры, которые могут латерально агрегировать. В этом отношении миород сильно отличается от миозина, молекула которого имеет такой же стержневой участок, что еще раз указывает на важную роль N-уникального домена миорода в формировании вязких, нитевидных полимеров. Это подтверждается результатами экспериментов, в которых миород подвергали ограниченному протеолизу лапаином для удаления большей части уникальной последовательности, После такой обработки миород терял способность образовывать вязкие полимеры (рис. 16). Таким образом, высокая вязкость полимеров миорода связана с наличием уникальной части в его молекуле.
Интересно отметить, что в структуре миорода, по-видимому, все же заложена способность агрегировать по «миозиновому» типу, что происходит в присутствии следовых количеств миозина (1%), который, очевидно, служит «затравкой» для соответствующей полимеризации (Shelud ko et al., 2001). Это согласуется с результатами экспериментов, в которых вязкость полимеров миорода, образованных в присутствии небольших количеств миозина, намного ниже вязкости чистого миорода (рис. 15).
Отличия в процессе полимеризации миозина и миорода проявляются также при воздействии на тиоловые (SH) группы этих белков. SH-группы являются высокореакционными и их окисление, например, N-этилмалеимидом (NEM) может приводить к полной потере АТФазной активности миозина (Silverman et al., 1972). «Существенные» SH-группы: SHI и SH2 (остатки Cys-707 и Cys-697 в скелетном миозине) входят в состав структурных элементов, соединяющих части моторного домена миозина, за счет которых, как считается, осуществляются перестройки моторного домена и поворот рычага (Левицкий, 2004). Поэтому зависимость полимеризации миорода и миозина от состояния тиоловых групп является важной характеристикой этих белков.
Полученные данные свидетельствуют о том, что миород в результате NEM-обработки теряет способность к полимеризации, но приобретает способность к агрегации в присутствии Mg+. Очевидно, что столь радикальные изменения в свойствах миорода должны определяться столь же радикальными изменениями в его структуре. Мы полагаем, что эти структурные изменения связаны с SH-доменом миорода, содержащим Cys722. Он находится в С-конневой части молекул миорода и миозина, однако, вне ACD участка (рис.1), который необходим для полимеризации миозина (Sohn et al., 1997). Это единственный общий цистеин в аминокислотной последовательности трех миородов из различных мышц двух видов моллюсков (Yamada et al, 2000; Perreault-Micale et al., 1996) (табл. 2; а, б, в).
Фосфорилирование миорода
Мы показали, что телокин влияет на структуру толстой нити. Скорость осаждения миозиновых нитей в глицериновом градиенте в присутствии телокина заметно снижается (рис. 33 и 34). Это указывает на частичную дезагрегацию миозиновых нитей, что согласуется с результатами Кудряшова и сотр., которые показали, что телокин предотвращает латеральную агрегацию миозиновых нитей (Kudryashov et al., 2002).
Мы полагаем, что изменение структуры толстой нити в присутствии телокина, способствует удалению киназы, связанной с миозиновыми нитями. Высвобождение киназы, которая переходит в раствор, приводит к последующему уменьшению скорости фосфорилирования регуляторных легких цепей.
Помимо этого, телокин влияет на структуру киназы, что также может приводить к ее удалению с миозиновых нитей. Известно, что в растворе киназа представляет собой смесь олигомеров, димеров и мономеров (Filenko et al., 1997). Именно олигомеры киназы ответственны за связывание с миозиновыми нитями (Sobieszek, 1990). Телокин влияет на степень олигомеризации киназы, сдвигая равновесие в сторону образования димеров и мономеров (Nieznanski and Sobieszek, 1997), которые не связываются с миозиновыми нитями. Действительно, согласно данным, представленным на рисунке 35, при увеличивающихся концентрациях телокина к миозиновым нитям, количество киназы в супериатанте возрастает. Таким образом, высвобождение киназы происходит вследствие ее димеризации под действием телокина, что уменьшает скорость фосфорилирования миозина.
Какой из двух механизмов ответственен за ингибирование скорости фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина в гладкой мышце, сказать трудно. Вполне вероятно, что эти процессы могут быть связаны.
Предполагается, что киназа и фосфатаза легких цепей миозина образуют функциональный комплекс (Sobieszek et al., 1997b), который, локализован на миозиновых нитях. Исследуя влияние телокина на скорость фосформирования миозиновых нитей, мы обнаружили, что, в отличие от КЛЦМ, активность ФЛЦМ напротив увеличивается (рис. 30 и 36). Это вполне согласуется с идеей Джонсона и Снайдера (Johnson and Snyder, 1995), в которой предполагается, что фосфатаза, в комплексе с киназой легких цепей миозина, неактивна. Возможно, удаление киназы с миозиновых нитей под действием телокина, активирует фосфатазу, обеспечивая увеличение скорости дефосфорилирования регуляторных легких цепей (рис. 30).
Таким образом, телокин может выступать как эффективный модулятор актин-миозинового взаимодействия, поддерживая определенный уровень фосфорилирования в гладкой мышце. Показано, что протеолитическая субструктура миорода, построенная по результатам ограниченного протеолиза папаином, аналогична миозиновой. Миород имеет уникальный N-концевой головной домен (аналог S1 миозина) и С-концевуго стержневую часть. Стержневая часть, в свою очередь, состоит из «шейного» домена (аналог S2 V миозина) и «хвостового» (идентичен LMM миозина). 2. Миород полимеризуется в растворах с физиологической ионной силой. В зависимости от условий среды он способен образовывать различные полимеры: короткие, длинные нитевидные и латеральные агрегаты нитевидных полимеров. Миород не образует миозиноподобные полимеры, несмотря на идентичность участков, ответственных за полимеризацию в молекулах миозина и миорода. Очевидно, что особенности полимеризации миорода определяет его уникальный N-концевой домен. 3. Полимеры миорода обладают высокой вязкостью и тиксотропией, значения которых превышают таковые для фибриллярного актина. Вязкость и тиксотропия миорода в сильной степени зависят от условий образования полимеров. Реологические свойства миорода обусловлены структурной вязкостью его растворов. Модификация N этилмалеимидом аминокислоты Cys722 миорода полностью ингибирует его полимеризацию, но придает ему способность к агрегации в присутствии Mg" 1 . 4. Миород фосфорилируется киназой легких цепей миозина из гладких мышц позвоночных. Участок фосфорилирования локализован в N уникальном «головном» домене. Поскольку киназа легких цепей миозина входит в качестве домена в состав регуляторного белка w твитчина, предполагается, что миород является субстратом твитчиновой киназы и наряду с твитчином принимает участие в регуляции запирательного тонуса мышц моллюсков. Телокин, белок гладких мышц позвоночных, влияет на киназно-фосфатазную активность, ассоциированных с миозином ферментов, регулируя актин-миозиновое взаимодействие. Он не только ингибирует скорость фосфорилирования миозина, но и активирует скорость дефосфорилироваиия регуляторных цепей фосфатазой легких цепей миозина. Предполагается, что влияние телокина на активность ферментов осуществляется посредством влияния на структуру толстых нитей, с которыми эти ферменты ассоциированы.
