Введение к работе
Актуальность тени. Денитрификация - это сложной биохимический процесс, приводящий в конечном итоге к изменению содержания азота в клетках и тканях. Различают два типа денитрифи-кации I) с образованием в качестве конечного продукта аммиака, при этом общее содержание азота растет за счет накопления белковой кассы., 2) с образованием летучих азотсодержащих соединений из нитратов и нитритов, при этом происходит общее снижение содержания азота; именно этот процесс обозначается как "истинная " денитрификация.
Денитрификация происходи? как в животных и растительных тканях, так и у микроорганизмов, В процесс денитрификации вовлекается ряд ферментних и белковых систем. Наиболее изучена денитрификация некоторых почвенных микроорганизмов, для которых показано, что она осуществляется благодаря наличию в них специальной электронтранспортной цепи, состоящей из ряда ме-таллопротеидов.
В последние годы наблюдается значительный интерес к изучению механизмов денитрификации, связанный, во-первых, с той отрицательной ролью, которую играют почвенные денитрификаторы в разрушении вносимых в почву азотных удобрений; во-вторых, с возможностью использования денитрифицирующих микроорганизмов и отдельных ферментов для очистки питьевой и сточных вод, загрязненных окислами азота; в-третьих, в связи с увеличением поступления в организм человека нитратов и нитритов с пищей, лекарственными средствами, а также в результате загрязнения окружающей среды, что остро ставит проблему защиты организма от токсического действия этих чужеродных соединений. Среди токсического действия нитратов и нитритов на организм животных можно выделить: I) нейротоксический эффект, связанный С разрушением дофаминовых рецепторов и гипоксию мозга, 2) мет-гемоглобинемию, 3) канцерогенность. Известен также токсический эффект нитритов и на растительные ткани и микроорганизмы. Однако механизмы денитрификации в животных и растениях остаются практически неизученными.
Цель и задачи исследования. Денитрифицирующая система
микроорганизма $еи<іол-иигаЛ (X-evu^durvo-j-c^, особенно биохимия иитритвосстшювливающего участка, является наиболее изученной. В состав денитрифицирующей системы 3h. агілшіпомх, как известно, входят несколько Металлсодержащих белков и ферментов. Очистка этих компонентов, изучение их свойств и взаимодействия мевду ними являются необходимыми этапами изучения механизма денитрификации. Кроме того, вовлечение металлсодержащих белков и ферментов (в частности, медьсодержащих) в процесс денитрификации у микроорганизмов и обнаружение процесса "истинной" денитрификации в растениях определили значение исследования реакции нитрита с медьсодержащими белками - переносчиками электронов из растительных объектов, В связи с вышеизложенным перед Нами были поставлены следующие задачи:
-
Очистка компонентов денитрифицирующей (нитритвосстанавлива-ющей) Цепи Sh. cte-uwjwtxw-a. и изучение их физико-химических свойств.
-
Исследование взаимодействия нитрита с компонентами денитрифицирующей (нитритвосстанавливающей) цепи -А. аюлсдСгина,.
-
Исследование взаимодействия нитрита с медьсодержащими белками - переносчиками электронов из растительных источников с целью поиска денитрифицирующих систем в растениях и выявления возможных звеньев токсического действия нитрита.
Научная новизна и Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований разработан метод одновременного получения семи металлсодержащих белковых фракций,(шесть из которых очищоїш до электрофоретически гомогенного состояния) из денитрифицирующего микроорганизма 0. ct,e/WA^C-rv>-s-cu. Изучены физико-химические свойства 1.цитохромоксидазы (нитритредук-тазы), цитохромов с-551, C-55J и аэуршга, позволившие выявить ряд особенностей их как медиаторов процесса восстановления нитрита. Обнаружена реакция восстановления нитрита цитохро-мом с-551 и азурином, показано влияние условий среды (рН, концентрации реагентов, ионной силы) на" эти окислительно-восстановительные реакции. Полученные результаты позволили предложить схему взаимодействия нитрита с терминальным участком нитритвосстанавливающей цепи. Рассмотрено также взаимодействие
- ;j -
нитрита с медьсодержащими белками растении" (плант&цианином, стеллациакином и пластоцианшюм). Показано, что в случае этих белков нитрит также способен выступать ісак окислитель, однако }з отличие от остальных изученных белков пластоцианин в присутствии ыюокпх концентрации шітріпа инактивировался. Полученные результати свидетельствуют о возможной регуляторной роли нит-рита в процессах денитрификацип в микроорганизмах и растениях.
Публикации и апробация работы. Основное содержание диссертации изложено в восьми печатних работах. Материалы диссертации докладывались на республиканской конференции "Макромоле-кули и функционирование клетки" (Ереван, 1906), на III И ІУ республиканских молодежных конференциях по физико-химической биологии (Агверш, 1985 и Ереван, 190?), били представлены на 1-ой Всесоюзной конференции "Кинетика и механизм электронного переноса в белковых системах и их моделях" (Вильнюс, 1985).
Структура и обі-ем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитированной литературы. Первая глава посвящена обзору литературы по теме диссертации. Первая часть обзора включает литературу относительно токсического действия нитратов и нитритов на животные, растительные и микроорганизмы. Во второй части рассматриваются биологическое значение и типы денитрификации. В третьей части приводятся ли-' тературные данные об участии металлопротеидов в процессе денитрификации у микроорганизмов и в последней части литературного обзора приводятся данные о свойствах белков и ферментов нитритвосстанавливающей цепи <%. сь&глъаипоъо,. Вторая глава содержит описание использованных в работе материалов и методов исследования, приборов и реактивов. В третьей Х'лаве приводятся результаты собственных исследований. В четвертой заключающей главе обсуждаются полученные результаты. В выводах сформулированы главные итоги проведенного исследования.
Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 5 таблиц. Библиография включает 146 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.
_ 4 _
