Введение к работе
Актуальность проблемы. В состав всех внутренних органов и кровеносных сосудов входят гладкие мышцы, нормальное функционирование которых немаловажно для поддержания работы всех систем организма. Поэтому развитие многих патологических состояний, таких как гипертоническая болезнь, инсульт, сосудистые дистонии и др., сопряжено с функциональными нарушениями сокращения гладких мышц. Для эффективной коррекции дисфункций гладких мышц необходимо понимание молекулярных основ регуляции их активности. Исследования в области регуляции сокращения гладких мышц актуальны как с фундаментальной научной, так и прикладной биомедицинской точек зрения.
Сокращение гладких мышц осуществляется за счет относительного скольжения тонких актиновых и толстых миозиновых филаментов аналогично сокращению поперечнополосатых мышц. Однако миозин гладких мышц требует дополнительной активации фос-форилированием, осуществляемой киназой легких цепей миозина (КЛЦМ). Возрастание цитоплазматической концентрации свободного Са ([Са ],) и связывание Са с первичным акцептором кальциевого сигнала белком кальмодулином (СаМ) приводит к активации КЛЦМ и развитию сокращения. Генетический локус КЛЦМ кодирует несколько белковых продуктов: высокомолекулярную и низкомолекулярную изоформы КЛЦМ, а также миозин-связывающий белок KRP, не обладающий протеинкиназной активностью. Как показали исследования последних лет, функция KRP также тесно связана с регуляцией активности миозина, хотя механизм действия KRP все еще до конца не ясен. В дополнение к прямому участию Са /СаМ, фосфорилирование белковых продуктов генного локуса КЛЦМ обеспечивает тонкую регуляцию их внутриклеточной активности. В последнее время появились данные об активации КЛЦМ ее фосфорилированием пролин-направлен-ными МАР-киназами и о роли фосфорилирования KRP в регуляции расслабления гладких мышц. Кроме того, развитие тонического сокращения гладких мышц сосудов при пони-женой концентрации внутриклеточного Са в ответ на стимуляцию форболовым эфиром (PDBu) может быть связано с отсутствием в этой ткани KRP и увеличением степени фосфорилирования КЛЦМ, тогда как отсутствие такой реакции у фазной висцеральной мускулатуры может объясняться наличием в этой ткани KRP и/или отсутствием фосфорилирования КЛЦМ. В то же время остались неясными ни внутриклеточный механизм проведения сигнала к фосфорилированию этих белков, ни ключевые модифицируемые остатки, ни биологический смысл их фосфорилирования.
Данная работа сфокусирована на изучение значимости фосфорилирования КЛЦМ и KRP в регуляции сократительного ответа тонических гладких мышц сосудов и фазных
мышц висцеральных органов. В частности, было исследовано фосфорилирование KRP в процессе сокращения-расслабления фазной гладкомышечной ткани, вклад МАР-киназ в обеспечение тонического ответа при пониженной [Са ]„ а также фосфорилирование КЛЦМ МАР-киназами и возможные последствия такого фосфорилирования.
Цель и задачи исследований. На основании вышесказанного целью настоящей работы являлось исследование роли МАР-киназ и фосфорилирования КЛЦМ и KRP в регуляции Са -чувствительности и сократительной активности гладких мышц.
В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:
Исследовать вклад МАР-киназ в развитие тонического сокращения гладких мышц сосудов, зависимого от активации протеинкиназы С.
Определить остатки, фосфорилируемые в КЛЦМ и KRP МАР-киназами in vitro и участки фосфорилирования этих белков в гладкой мускулатуре, стимулированной PDBu.
Изучить связь между фосфорилированием индивидуальных остатков КЛЦМ и KRP и сократительной активностью гладких мышц.
Исследовать эффект МАР-киназ на каталитическую активность КЛЦМ и связывание КЛЦМ с актином и миозином in vitro.
Изучить влияние фосфорилирования КЛЦМ на ее взаимодействие с гладкомышечным сократительным аппаратом.
Научная новизна работы. Обнаружено, что ингибиторы каскадов р42/р44,ли и р38 МАР-киназ снижают развитие тонического сокращения гладких мышц сосудов при активации протеинкиназы С, что указывает на роль МАР-киназ в повышении Са ^чувствительности сократительного аппарата гладких мышц. Установлены остатки и возможные функциональные последствия фосфорилирования КЛЦМ МАР-киназами, в частности регуляция связывания КЛЦМ с актомиозином гладких мышц фосфорилированием. Исследована сайт-специфичная динамика фосфорилирования КЛЦМ и KRP при сокращении-расслаблении гладких мышц и установлена корреляция между фосфорилированием этих белков и развитием или отсутствием сократительного ответа ткани.
Практическая значимость работы. Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию механизмов регуляции гладкомышечного сокращения при фосфо-рилировании регуляторных белков. Обнаруженные функциональные эффекты фосфорилирования КЛЦМ и корреляции между фосфорилированием КЛЦМ и KRP и сократительной активностью гладких мышц дают основу новым интересным гипотезам, описывающим регуляторный аппарат гладких мышц.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международных симпозиумах "Биологическая подвижность: современные методы иссле-
дования" (Пушино, Россия, 2001), на 30-ой, 31-ой и 32-ой Европейских мышечных конференциях (Павия, Италия, 2001; Люнтерен, Нидерланды, 2002; Монпелье, Франция, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 27 рисунками. Список литературы включает 245 источников.
