Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 9
II.1 . Гибернация млекопитающих 9
II.2. Регуляция энергетического метаболизма при гибернации 12
II.З. Регуляция экспрессии генов 15
II.4. Контроль метаболизма посредством влияния температуры на свойства ферментов 17
II.5. Регуляция функциональной активности сердца и скелетных мышц при гибернации 18
II.6. Основные белковые и липидные компоненты мембран СР 22
II.7 . Регуляция функциональной активности СР 34
II.8. Особенности функционирования СР животных-гибернаторов 49
III. Цели и задачи 55
IV. Материалы и методы 56
IV. 1. Экспериментальные животные 56
IV. 2 . Получение микросомального препарата СР 56
IV. 3. Определение концентрации белка 57
IV 4. Определение активности Са-АТРазы 57
IV 5. Определение влияния фосфорилирования белков СР на активность Са-АТРазы СР 58
IV. 6. Электрофорез в полиакриламидном геле 58
IV 7. Фосфорилирование белков СР эндогенными протеинкиназами 59
IV 8. Определение уровня фосфорилирования белков СР 60
IV.9. Авторадиография 60
IV 10. Очистка препарата Са-АТРазы аффинной хроматографией на колонке с Reactive RED-120 агарозой 61
IV 11.Анализ спектра белков, взаимодействующих с Са-АТРазой 61
IV12. Идентификация белков, взаимодействующих с Са-АТРазой. 62
IV13. Определение консервативных аминокислотных последовательностейи потенциальных участков фосфорилирования в белках, 1 взаимодействующих с Са-АТРазой 63
IV. 12. Материалы 64
V. Результаты и обсуждение 65
V.l. Характеристика мембранных препаратов СР скелетных мышц , используемых в работе 65
1.1 Выход белка СР и активность Са-АТРазы 65
1.2 Белковый состав исследуемых препаратов СР 66
V.2. Определение оптимальных условий фосфорилирования белков в препаратах СР эндогенными протеинкиназами 67
V.3. Анализ включения фосфата в белки препаратов СР скелетных мышц суслика 70
3.1 Белки-мишени эндогенных протеинкиназ в мембранах СР 70
3.2 Фосфорилирование белков СР в присутствии активаторов эндогенных протеинкиназ 72
3.3 Анализ локализации протеинкиназ в препаратах СР 76
3.4 Анализ спектра протеинкиназ, присутствующих в препаратах СР 77
V.4. Влияние фосфорилирования белков СР эндогенными протеиникназами на активнось Са-АТРазы 79
V.5. Определение роли казеинкиназы//в фосфорилировании белков СР скелетных мышц сусликов. ~~ 80
V.6. Выявление белков, взаимодействующих с Са-АТРазой 83
V.7. Идентификация белков - мишеней казеинкиназы II, связывающихся с Са-АТРазой. 85
VI. Заключение ^
VII. Выводы *&
VIII. Список литературы 8SP
- . Гибернация млекопитающих
- . Регуляция функциональной активности СР
- . Получение микросомального препарата СР
- Характеристика мембранных препаратов СР скелетных мышц , используемых в работе
Введение к работе
Известно, что понижение температуры тела большинства млекопитающих, и человека в том числе, всего на несколько градусов Цельсия приводит к тяжелым последствиям и даже к смерти. Однако существует большая группа животных, которые могут переносить понижение температуры тела до 0°С и даже ниже, не теряя при этом жизнеспособности и контроля за протеканием обмена веществ. Более того, многие из этих животных способны "управлять" температурой своего тела, "согреваясь" несколько раз в течение зимы до нормальной температуры тела и снова "охлаждаясь". Речь идет о млекопитающих, которые проводят зиму в состоянии зимней спячки (гибернации). В ответ на понижение температуры, ограничение длинны светового дня и снижение количества пищи эти животные впадают в глубокое оцепенение, при котором скорость обмена веществ падает до 1-5% от нормального значения, а температура тела составляет 1-2°С. Снижение температуры тела и скорости метаболизма не является простым следствием температурозависимого падения скорости химических реакций - напротив, это является результатом большого количества тонко скоординированных биохимических процессов, проходящих в различных органах и сопровождающихся значительными адаптационными изменениями как на биохимическом, так и на функциональном уровне. На биохимическом уровне гибернация сопровождается изменением кинетических свойств большого числа ферментов, обусловленных как влиянием различных аллостерических регуляторов или фософрилированием или дефосфорилированием протеинкиназами или протеинфосфатазами, так и экспрессией специфических изоформ различных ферментов и белков. Кроме того, в процессе подготовки к спячке в организме накапливается большое количество запасных питательных веществ, отличных от обычного пищевого рациона животного, и метаболизм перестраивается на их потребление в процессе спячки и последующего пробуждения. В настоящее время во многих лабораториях ведутся интенсивные исследования физиологических и биохимических процессов, которые происходят в организме животных во время зимней спячки. Однако многие вопросы остаются пока неясными. Так, например, неизвестно, что является сигналом для "согревания" и кратковременного пробуждения спящих животных в зимнее время. Более того, известно, что только 30% тепла при пробуждении выделяется в бурой жировой ткани, и это тепло идет на согревание сердца, мозга и ряда других внутренних органов. Остальное тепло выделяется в мышечной ткани, однако механизм теплопродукции в мышцах пока не известен.
Структурные и функциональные изменения, проходящие в разных типах мышц при гибернации, представляют особый интерес. Ряд мышц (сердце, диафрагма, межреберные мышцы, ряд скелетных мышц, поддерживающих специфическую позу гибернирующего животного) должны функционировать в экстремальных условиях. Частота сердечных сокращений у спящего животного составляет 4-5 ударов в минуту, за то же время происходит 1-2 акта вдоха/выдоха. В начале пробуждения резко увеличивается электрическая активность в скелетных мышцах, в которых зарегистрированы многочисленные, следующие один за другим потенциалы действия. Однако пока температура тела не повысится до 12-14°С, эти потенциалы действия не приводят к сокращению мышц. Таким образом, "источник тепла" в мышцах при низких температурах в процессе так называемого несократительного термогенеза пока не ясен. Предполагается, что тепло при этом может выделяться за счет работы миозиновои АТРазы, однако неясно, почему эта работа не приводит к сокращению мышц. С другой стороны, более вероятным кажется высказанное в нашей лаборатории предположение, согласно которому главную роль в несократительном термогенезе играет саркоплазматический ретикулум. Содержащиеся в мембранах СР Са-каналы способны в ответ на потенциал действия освобождать кальций из внутренних полостей ретикулума в цитоплазму, а Са-АТРаза, также локализованная в мембранах ретикулума, АТР-зависимо аккумулирует его обратно. Таким образом, при одновременной работе Са-каналов и Са-АТРазы СР имеет место классический футильный цикл, результатом которого и будет продукция тепла.
Известно также, что функционирование Са-каналов и Са-АТРазы СР зависит от их взаимодействия с рядом регуляторных белков, присутствующих в мембранах ретикулума, а также от свойств липидного бислоя мембраны. Имеющиеся в литературе данные указывают на крайнее разнообразие путей регуляции активности Са-транспортирующих систем мембран саркоплазматического ретикулума, зачастую строго видоспецифичных. Однако информация о свойствах Са-каналов и Са-АТРазы СР скелетных мышц гибернирующих животных, а также информация о белковом составе мембран СР этих животных в литературе в настоящее время очень скудна.
В связи с этим, в настоящей работе было проведено исследование белкового состава мембран СР скелетных мышц активных (летних) и гибернирующих (зимних) сусликов Spermophilus undulatus и фосформирования этих белков под действием эндогенных протеинкиназ, присутствующих в мембранных препаратах СР.
. Гибернация млекопитающих
Гибернация - это один из способов биологической адаптации животных к неблагоприятным условиям окружающей среды. Термин «гибернировать» означает проводить зиму в оцепенении. Под это широкое понятие может подойти зимнее оцепенение рептилий и амфибий, рыб и беспозвоночных. Но гибернация млекопитающих отличается от гибернации других животных рядом специфических особенностей:
Млекопитающие могут охлаждаться до низкой температуры тела без нарушения координации между отдельными физиологическими процессами в организме. У длительно гибернирующих видов температура тела может падать до 0С и даже несколько ниже (Barnes, 1989), при этом скорость метаболизма уменьшается до 1% от нормальных значений (Geiser, Ruf, 1995). Характерно, что при наступлении состояния спячки снижению температуры тела животного предшествует снижение скорости метаболизма (Geiser, 1988; Heldmaier, Ruf, 1992). Это свидетельствует о сложной внутренней регуляции биохимических процессов, приводящей к наступлению состояния гибернации, в отличие от оцепенения беспозвоночных и холоднокровных, где ингибирование метаболизма обусловлено снижением температуры окружающей среды и, соответственно, температуры тела. В отличие от гибернации, оцепенение, характерное для ряда мелких млекопитающих, не всегда приводит к таким драматическим изменениям в организме; например, дневное оцепенение в летнее время длится только несколько часов, и падение температуры тела и скорости метаболизма во время такой формы оцепенения менее выражено, чем во время зимней гибернации: обычно температура тела при дневном оцепенении снижается до 11-28С, а скорость метаболизма уменьшается примерно до 30% (Hudson, 1973).
Млекопитающие способны пробуждаться и «согреваться» при низкой температуре окружающей среды, благодаря своей теплокровности и общему контролю над температурой тела и метаболизмом, что их резко отличает от других позвоночных (рептилий, амфибий, рыб). Зимняя спячка состоит из последовательности так называемых баутов продолжительностью 1,5-2 недели с кратковременными, на 20-30 часов, пробуждениями между ними (интербауты) (Lyman, 1982; Постникова и др., 1997). Во время таких баутов происходит существенное уменьшение скорости биения сердца и дыхательных движений, например, у ехидны Tachiglossus aculeatus в активном состоянии при температуре тела 32С сердце сокращается со скоростью 50-70 ударов в минуту, а во время гибернации - 2-4 удара в минуту (при температуре тела 10С) (Grigg, Beard, 1996). У суслика Spermophilus undulatus в активном состоянии при температуре тела 35,2 - 36,8С частота пульса составляет 150 - 370 ударов в минуту, а во время гибернации - 4-5 ударов при температуре тела 3-5С (Соколов и др., 1995).
Наличие запаса питательных веществ позволяет некоторым видам млекопитающих проводить в состоянии оцепенения долгое время. В течение летнего периода в состоянии физиологической активности у животных-гибернаторов происходит накопление в организме питательных веществ. Во время активного периода у суслика Spermophilus lateralis содержание жира увеличивается на 35-40%. Для нормального протекания спячки оптимальная диета животного во время активного накопления жиров должна содержать достаточно ненасыщенных жирных кислот, чтобы депонировать жиры с общим содержанием ненасыщенных жирных кислот 80-85%. При этом процент полиненасыщенных жирных кислот в диете должен быть в 2 раза больше мононенасыщенных. Возможно, это отчасти связано с тем, что организм не может синтезировать полиненасыщенные жирные кислоты, в отличие от мононенасыщенных, и они должны поступать с пищей (Frank, Storey, 1996). Как было установлено, именно линолевая и леноленовая полиненасыщенные жирные кислоты, температура затвердевания которых лежит ниже 0С, служат основным горючим во время спячки некоторых видов сусликов. В то же время количество насыщенных жирных кислот за время гибернации практически не изменяется. Олеиновая кислота, температура плавления которой 16-18С, содержащая одну двойную связь, очевидно, расходуется во время спячки лишь частично, в основном в периоды пробуждения, особенно в первые недели после спячки, когда источники кормов весьма скудны (Калабухов, 1985).
У суслика Spermophilns lateralis в период с мая по сентябрь увеличение мышечной массы и количества жира было пропорционально. Во время спячки оба эти параметра так же пропорционально снижались. Животные, чья диета в активный период была обеднена жирами, впадали в состояние гибернации существенно позже, чем животные с полной диетой, и теряли во время спячки в основном в мышечной, а не в жировой массе, хотя на длительность баутов спячки диета животных не сказывалась (Pulawa, Florant, 2000).
Источниками жиров у спящих животных служат бурая и белая жировая ткани. Бурая жировая ткань обильно снабжена сосудами и состоит из мелких полигональных клеток, которые содержат множество липидных капелек и митохондрий. В отличие от бурой жировой ткани, в клетках белой жировой ткани митохондрий очень мало (Калабухов, 1985; Ныосхолм, Старт, 1977). Симпатическая стимуляция бурой жировой ткани происходит, в основном, через Р3-адренергические рецепторы, что приводит к окислению липидов и продукции тепла (Cannon et al., 1996) Кроме того, в последнее время получено множество данных в пользу участия и otl-адренергической стимуляции в термогенезе (Nedergaard et al., 1996).
. Регуляция функциональной активности СР
Как уже отмечалось выше, саркоплазматический ретикулум является важнейшим внутриклеточным компартментом, отвечающим за регулирование обмена Са2+ и осуществление процесса мышечного сокращения. Очевидно, что процессы высвобождения ионов Са из полостей ретикулума и их последующей аккумуляции обратно должны быть тонко отрегулированы. В осуществлении регуляции функционирования основных белковых компонентов, осуществляющих высвобождение и закачку Са , принимает участие большое количество различных веществ, как низкомолекулярных, так и крупных белков и их комплексов. В настоящее время известно большое количество низкомолекулярных лигандов, способных модулировать активность кальциевого канала СР. Так, RyR может активироваться микромолярными концентрациями Са , адениловыми нуклеотидами, кофеином, рианодином (в наномолярных концентрациях), ионами тяжелых металлов, окисленным глутатионом, перекисью водорода и другими }4 модификаторами SH-групп. Ингибиторами Са-каналов являются Са и MgZT (в миллимолярных концентрациях), рутениевый красный, рианодин (в микромолярных концентрациях), лактат и вещества, восстанавливающие дисульфидные связи в белках (Favero, 1999)
Зависимость активности рианодинового рецептора от концентрации Са2+ имеет вид колоколообразной кривой с максимумом в области 100 мкМ Ca2+(Meissner, 1986). Са2+-индуцируемый выброс Са2+ активируется миллимолярными концентрациями ATP (Meissner, 1986). Кроме АТР, активирующим эффектом обладают и другие адениловые нуклеотиды (ATP, ADP, AMP, сАМР аденозин, аденин). Активация канала осуществляется за счет связывания нуклеотидов в регуляторных участках (Michalak et al., 1988).
Предполагается, что in vivo основным физиологическим регулятором активности Са-каналов является не ATP, a Mg2+-ATP. Внесение Mg2+ и АТР в концентрациях, близких к физиологическим (5 мМ АТР и Mg и дополнительно 700 мкМ свободного Mg ) оказывало стимулирующий эффект при индукции выброса Са2+ микромолярными концентрациями Са2+, что свидетельствует о существовании регуляторного участка, при связывании в котором Mg2+-ATP Са-канал становится более чувствительным к активации более низкими концентрациями Са2+ (Meissner, 1986). Особый интерес представляет вопрос о регулировании активности RyR при помощи белок-белковых взаимодействий, а так же путем активации различных протеинкиназ. Молекула RyR является мишенью для большого числа различных протеинкиназ. Установлено, что изоформы RyRl и RyR2 фосфорилируются протеинкиназами А, С, G и Са/СаМ-зависимой протеинкиназой (Strand et al., 1993, Bers, 2006).
Фосфорилирование сердечной изоформы рианодинового рецептора (RyR2) протеинкиназами А, С и G увеличивает уровень связывания рианодина, в то время как фосфорилирование Са/СаМ - зависимой протеинкиназой - снижает (Takasago et al., 1991). Поскольку рианодин связывается только с открытой формой Са-канала, то можно говорить о регуляторной роли фосфорилирования изоформы RyR2 разными протеинкиназами. Тем не менее, ряд данных указывает на то, что Са/СаМ - зависимое фосфорилирование RyR2 не только не снижает активности Са-канала, но наоборот увеличивает ее. Так, встроенный в плоский фосфолипидный бислой RyR2 активировался при фосфорилировании как эндогенной, так и экзогенной Са/СаМ-зависимой киназой (Witcher et al., 1992). С использованием сайт-специфического мутагенеза был выявлен участок фосфорилирования Са/СаМ-зависимой протеинкиназы, отличный от сайта протеинкиназы А. Фосфорилирование по этому участку увеличивало чувствительность RyR2 к Са2+. Кроме того, было показано, что Са/СаМ-зависимая протеинкиназа активируется при увеличении частоты сердечных сокращений, когда возникает необходимость стимулировать Са-индуцируемое освобождение Са из полостей СР (Wehrens et al., 2004). Возможно, это противоречие можно объяснить наличием в молекуле RyR2 двух или более участков фосфорилирования для Са/СаМ-зависимой протеинкиназы, один из которых совпадает с участком фосфорилирования сАМР-зависимой протеинкиназой, а другой (другие) является уникальным. При этом фосфорилирование по разным участкам может сопровождаться различными эффектами.
На изолированных кардиомиоцитах показано, что фосфорилирование RyR2 протеинкиназой А усиливается в присутствии Р-адренергического агониста изопротеренола и блокируется пропранололом, т. е. данный эффект осуществляется через (3-адренергические рецепторы. Следовательно, положительный инотропный эффект Р-адренергических агонистов может включать сАМР-зависимое фосфорилирование сердечной изоформы RyR (Yoshida et al., 1992). Протеинкиназа А осуществляет фосфорилирование RyR2 по двум участкам: Ser2030 и Ser2808, причем Ser2030 является более высококонсервативной мишенью для протеинкиназы А. Фосфорилирование по этому участку более чувствительно к р-адренергической стимуляции изопротеренолом, а также к специфическим ингибиторам протеинкиназы А. Кроме того, Ser2808, в отличие от Ser2030 стехиометрически фосфорилировался cGMP - зависимой протеинкиназой (Xiao et al., 2006).
Изменение стехиометрии фосфорилирования RyR2 протеинкиназой А по остатку Ser2808 может сопровождаться интересными эффектами. Показано, что физиологический уровень фосфорилирования остатка Ser2808 в молекуле RyR2 составляет около 75%. При таком уровне фосфорилирования Са-канал функционирует в обычном режиме и регулируется взаимодействием с различными лигандами. Однако при увеличении уровня фосфорилирования Ser2808 протеинкиназой А до 100% наступает резкое увеличение Са -проводимости канала за счет увеличения времени его закрытия. Этот эффект нивелируется активацией протеинфосфатазы 1, вероятно, снижающей уровень фосфорилирования Ser2808 (Carter et al., 2006).
Функциональное значение фосфорилирования RyRl различными протеинкиназами пока окончательно не установлено. В Са-каналах скелетных мышц, встроенных в липидные бислои, под действием эндогенного фосфорилирования (главным образом, Са/СаМ-зависимой протеинкиназой) увеличивалась вероятность перехода канала в открытое состояние и возрастала чувствительность к Са2+ и АТР. Этот эффект устранялся под действием фосфатазы 2А (Hermann-Frank et al., 1991). Недавно было обнаружено, что инкубация встроенных в липидные бислои везикул тяжелого СР скелетных мышц в присутствии АТР в течение 5-8 минут приводит к необратимой активации Са-каналов за счет их фосфорилирования эндогенными протеинкиназами, причем в результате такого фосфорилирования чувствительность Са-каналов к АТР, аденозину и Са2+ снижается (Dulhunty et al., 2001). Ингибиторный анализ и использование специфических антител показали, что фосфорилирование RyR обеспечивается эндогенной Са/СаМ-зависимой протеинкиназой II, которая локализована в мембранах СР вблизи Са-каналов.
Как уже отмечалось выше, рианодиновый рецептор является центром массивного макромолекулярного комплекса, включающего в себя большое количество регуляторних белков. В этот комплекс входят как белки, взаимодействующие с цитоплазматической частью молекулы RyR, так и трансмембранные и внутрилюминальные белки СР (кальсеквестрин, кальмодулин, кальстабин 2, сорцин, триадин, джанктин, протеинкиназы А и С, тАКАР, богатый гистидином Са-связывающий белок и т.д.) (Bers, 2004).
В скелетных мышцах RyR формирует устойчивый комплекс с триадином, джанктином и кальсеквестрином. При этом каждый из белков имеет участки связывания с другими участниками комплекса. Триадин непосредственно взаимодействует со второй люминальной петлей RyR. Входящие в ее состав остатки Asp4878, Asp4907 и Glu4908 взаимодействуют с КЕКЕ-мотивом триадина (Lee et al., 2004).
. Получение микросомального препарата СР
Взрослых сусликов Spermophihts undulatus отлавливали в Якутии и содержали в виварии Института биофизики клетки РАН (Пущино) в индивидуальных клетках при 20-25С в условиях естественной длины светового дня и стандартного кормления. В ноябре сусликов помещали в темную комнату и содержали при температуре 2-4С. В течение января - февраля зимние спящие суслики декапитировались в середине баута спячки. Материалы летних активных животных получали в июле - августе. После декапитации скелетные мышцы задних конечностей освобождали от сухожилий и жира, замораживали в жидком азоте и затем хранили при температуре -70С до использования (до полугода без потери энзиматической активности). Препараты микросом СР получали из скелетных мышц методом дифференциального центрифугирования (Ритов и др., 1977) с некоторыми изменениями.
Замороженные конечности размораживали в ледяном физиологическом растворе. Далее срезали мышцы, очищали их от жира и измельчали ножницами. Полученный фарш помещали в 4-х кратный объем буфера, содержащего 0,3 М сахарозы и 10 мМ гистидина, рН = 7,7, и гомогенизировали в ножевом гомогенизаторе три раза по 30 секунд с интервалом в 15 секунд (10000 об/мин).
Гомогенат центрифугировали в течение 20 мин на центрифуге «Beckman J2-21», ротор JA-14 при 12000xg. Супернатант фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали 100 мин при 31000xg на роторе JA-20. Осадок суспендировали в растворе, содержащем 0,6 М КС1, 0,6 мг/мл БСА, 10 мМ гистидина (рН 7,2). Затем суспензию гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера 3 раза по одной минуте с минутным интервалом при скорости вращения пестика, задаваемой напряжением в 150 В. Объем гомогената доводили до 30 мл тем же раствором и инкубировали 1 час при 4 С при механическом перемешивании. Затем суспензию центрифугировали в течение 100 мин при 31000xg на роторе JA-20. Осадок суспендировали в среде хранения (0,25 М сахароза и 25 мМ имидазол, рН 7,0) и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера вручную. Препарат замораживали в жидком азоте и хранили при -70С.
Определение концентрации белка в препаратах проводили по методу Лоури (Lowry et al., 1951) . Препараты белков готовили на 1%-м растворе дезоксихолата Na. В качестве стандарта использовали раствор бычьего сывороточного альбумина, содержащий 1 мг/мл белка. Измерения проводили на спектрофотометре «Hitachi 200-20» при длине волны Х= 750 нм. Измерение активности Са-АТРазы проводили в системе сопряженных реакций (Gould et al., 1987):
Активность Са-АТРазы регистрировали на спектрофотометре «Hitachi 200-20» при 37С по изменению оптической плотности при длине волны X = 340 нм, происходящей в результате снижения концентрации NADH в системе. Длинна оптического пути составляла 1 см.
Реакцию проводили в среде, содержащей 80 мМ КС1, 50 мМ MOPS (рН 7,0), 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 2 мМ PEP, 2,5 мМ АТР (рН 7,0), 0,3 мг/мл NADH, 5 ед РК, 10 ед LDH. Концентрации РК и LDH были подобраны так, что бы они не лимитировали АТРазную реакцию.
Реакцию начинали добавлением в пробу объемом 1 мл препарата саркоплазматического ретикулума в количестве 10 мкг белка. После добавления препарата СР в пробу регистрировали некоторую активность, обусловленную присутствующей в препарате Mg -зависимой АТРазой. Затем в пробу вносили Са2+ и 2 мкл кальциевого ионофора А23187 (1 мг/мл), препятствующего накоплению Са в везикулах саркоплазматического ретикулума и ингибированию Са-АТРазы внутривезикулярным кальцием.
Для определения потенциального влияния фосфорилирования белков СР эндогенными протеинкиназами на активность Са-АТРазы микросомальные препараты СР инкубировали в среде, содержащей 2 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 1 мМ EGTA, 1 мМ PMSF, 10 мМ имидазол и 2 мМ АТР, рН 7,0 при 37 С. Концентрация белка в пробе составляла 1 мг/мл. Затем из пробы отбирали 10 мкл раствора и вносили в кювету для измерения активности Са-АТРазы. Дальнейшее измерение и расчет активности проводили, как описано выше.
Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лэммли в присутствии додецилсульфата натрия в пластинах ПААГ толщиной 0,75 мм при силе тока 20 мА в концентрирующем и 60 мА в разделяющем гелях (Laemmly, 1970), используя 4%-й концентрирующий и 6-20%-й разделяющий градиентный гели (Shorina et al., 1997). В качестве белков-маркеров для определения молекулярной массы белков СР использовались фосфорилаза b (97 кДа), бычий сывороточный альбумин (66,2 кДа), овальбумин (45 кДа), карбоангидраза (31 кДа), ингибитор трипсина 21,5 кДа), лизоцим (14,4 кДа). Фиксацию гелей проводили в растворе, содержащем 10% изопропанола и 25 % уксусной кислоты в течение часа. Окраску проводили в растворе, содержащем 25% изопропанола, 10% уксусной кислоты и 0,25% кумасси Brilliant Blue R-250. От избытка красителя гели отмывали в растворе уксусной кислоты (10%). Отмытые гели сканировали с разрешением 600 dpi и анализировали с помощью программы Foretix ID (Nonlinear Dynamics Ltd).
При необходимости выявления малых количеств белка гели прокрашивали серебром. После проведения электрофореза гель фиксировали в растворе, содержащем 40% этанола и 10% уксусной кислоты в течение 30-60 мин, затем дважды отмывали в 10% этаноле, после чего 5 раз по 5 мин отмывали дистиллированной водой. После этого гели помещали на 2 мин в ослабитель Фармера (0,15% K3Fe(CN)6, 0,3% Na2S203, 0,5% Na2C03), снова промывали 4 раза по 5 мин дистиллированной водой и помещали на 30 мин в 0,1% нитрата серебра. Затем гели отмывали в течение 5 мин в 2,5% растворе Na2C03 и проявляли в растворе, содержащем 2,5% Na2C03 и 0,02% формальдегида до проявления окраски. После проявки гели на 5 мин помещали в 1% раствор уксусной кислоты.
Характеристика мембранных препаратов СР скелетных мышц , используемых в работе
Данные по выходу белка СР из скелетных мышц разных животных представлены в таблице 1. Как видно из этой таблицы, выход белка СР из скелетных мышц активных животных примерно в полтора раза выше, чем зимних гибернирующих. Это хорошо согласуется с данными литературы о том, что при гибернации в результате отсутствия нагрузки наблюдается умеренная атрофия скелетных мышц (Lyman et al., 1982; Rubtsov, 2001), что и может быть причиной пониженного выхода СР из ткани.
Активность Са -АТРазы была измерена в стандартных условиях. Полученные значения представлены в таблице 1. Из приведенных данных видно, что активность Са-АТРазы (при расчете на мг белка СР) у бодрствующих сусликов примерно в 3 раза выше, чем у спящих животных. Возможно, такое снижение активности Са-АТРазы направлено на уменьшение потребления АТР в период спячки, что лежит в общем русле стратегии на снижение энергозатрат. Тем не менее, необходимо помнить, что при пробуждениях между баутами спячки скелетные мышцы сусликов сохраняют способность выполнять необходимый объем мышечной работы.
Снижение активности Са-АТРазы не может быть обусловлено снижением содержания белка Са-АТРазы в исследуемых препаратах СР, так как удельная активность фермента, рассчитанная с учетом этого содержания, у зимних гибернирующих сусликов в 1,8 раз ниже, чем у активных животных (табл. 1). Эти данные полностью согласуются с результатами аналогичных опытов, проведенных ранее в нашей лаборатории (Малышева и др., 2001; Rubtsov, 2001).
Белковый состав полученных нами препаратов СР анализировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии SDS. Электрофореграммы этих препаратов представлены на рисунке 4. Можно видеть, что по качественному составу препараты СР активных и спящих животных практически идентичны, тогда как количественный состав белков мембран СР при гибернации претерпевает изменения (табл. 2). Так, содержание белков с молекулярными массами 24, 31, 44 и 55 кДа в препаратах, полученных из зимних спящих животных, в 1,5-2,5 раза выше, чем у бодрствующих. Вместе с тем, препараты бодрствующих животных обогащены высокомолекулярными белковыми компонентами. В частности, содержание белков с молекулярными массами 450, 350, 165, 130 и 63 кДа, которые на основании литературных данных мы идентифицировали как Са-канал (рианодиновый рецептор) и его протеолитический фрагмент, богатый гистидином Са-связывающий белок, саркалюменин и кальсеквестрин соответственно, в 2-3 раза выше в препаратах СР из активных животных. Следует отметить, что мы не проводили специальной процедуры разделения препаратов СР на тяжелую и легкую фракции, поэтому на электрофореграммах присутствуют белки, характерные для контактной зоны СР (например, RyR). Содержание Са-АТРазы в препаратах СР гибернирующих животных несколько ниже, чем у бодрствующих (табл. 2). Однако проведенный расчет удельной активности фермента показывает , что изменение содержания белка Са-АТРазы в мембранах СР не является причиной изменения ее активности. Это может свидетельствовать о том, что активность Са-АТРазы изменяется в связи с воздействием на нее каких либо пока не идентифицированных факторов.
В целом, обнаруженные нами различия в белковом составе мембран СР активных и гибернирующих сусликов хорошо согласуются с известными ранее данными (Малышева и др., 2001; Rubtsov, 2001). Можно также предположить, что изменение белкового состава мембран СР вносит свой вклад в снижение активности этого фермента при гибернации.
Одной из предпосылок нашей работы являлось наличие в микросомальных препаратах СР эндогенной протеинкиназной активности (Малышева, 2001). Нами была проведена работа по определению оптимальных условий для включения 32Р в белки препаратов СР. С этой целью нами было исследовано влияние различных факторов на эффективность фосфорилирования.
Для анализа кинетики фосфорилирования препаратов СР исследовали уровень включения метки в них в зависимости от времени инкубации (рис.5). Полученные данные свидетельствуют о том, что включение фосфата в течение первых 2 мин достигает максимума, а затем несколько снижается, на 5 % за последующие 5 - 10 мин в препаратах активных животных и на 15% в препаратах зимних гибернирующих (рис. 5). По видимому, такую кинетику включения фосфата в препараты СР можно объяснить активностью присутствующих в препаратах ретикулума протеинфосфатаз, причем эти фосфатазы более активны в препаратах СР зимних гибернирующих животных. Таким образом, оптимальное время проведения реакции фосфорилирования составляет 1-2 мин.
Помимо определения оптимальных временных параметров фосфорилирования нами было исследовано влияние концентрации АТР в среде инкубации на включение Р в препараты СР. Фосфорилирование проводили при концентрациях АТР в 0,15; 0,3; 0,6; 0,9; 1,5 мМ. Полученные данные показывают, что максимальное включение метки в препараты СР как бодрствующих, так и спящих животных наблюдается при концентрации АТР в пробе 1 мМ. Включение фосфата при концентрации АТР 1,5 мМ практически не отличается. Проведенный анализ включения 32Р в препараты СР в зависимости от времени инкубации при разных концентрациях АТР показал, что характер кривой временной зависимости фосфорилирования от концентрации АТР практически не зависит.
В связи с тем, что препараты СР содержат значительное количество белка Са-АТРазы, использующей АТР в качестве субстрата, можно было предположить, что определенная часть у-[32Р]АТР при инкубации СР в среде для активации протеинкиназ может расходоваться в ходе АТР-азной реакции. Это может снижать уровень фосфорилирования белков СР эндогенными протеинкиназами, так как содержание протеинкиназ в мембранах СР, естественно, несравнимо ниже, чем содержание Са-АТРазы, и при конкуренции за субстрат Са-АТРаза имеет неоспоримые преимущества. С целью ингибирования Са-АТРазы мы добавляли в среду фосфорилирования ванадат (100 мкМ) и NaF (5 мМ), которые являются ингибиторами Са-АТРазы. Проведенные ранее эксперименты по определению влияния этих веществ на активность Са-АТРазы показали, что в указанных концентрациях они являются эффективными ингибиторами фермента. Для оценки полноты ингибирования Са-АТРазы этими ингибиторами мы проводили анализ включения фосфата в отсутствие и присутствии растительного лактона тапсигаргина, который является специфическим ингибитором Са-АТРазы мембран СР (Sagara et al., 1991). Было установлено, что тапсигаргин достоверно не изменяет уровня включения фосфата в белки мембран СР как бодрствующих, так и спящих животных (рис 6). На основании этого можно предположить, что в используемых нами условиях фосфорилирования Са-АТРаза находится в заингибированном состоянии и не расходует находящуюся в среде АТР.
Однако Са-АТРаза теоретически может связывать Р и ингибироваться ингибиторами в состоянии фосфорилированного интермедиата. Фосфофермент лабилен в щелочной среде, поэтому не обнаруживается при авторадиографическом исследовании, но стабилен в кислой области рН, что может приводить к завышенным результатам при определении суммарного уровня включения фосфата в белки СР. С целью проверки возможности образования фосфофермента мы проводили обработку фильтров с образцами гидр оксил амином, разрушающим фосфорилированные интермедиаты Са-АТРазы. Анализ суммарного уровня фосфорилирования белков СР эндогенными протеинкиназами не выявил влияния гидроксиламина на уровень фосфорилирования белков. Это свидетельствует о том, что Са-АТРаза не связывает Р в условиях проводимых нами экспериментов и не образует фосфорилированного интермедиата.
