Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Рибосомные белки эукариот: регуляция экспрессии их генов и внерибосомные функции (Обзор литературы) 9
1.1. Регуляция экспрессии генов рибосомных белков 10
1.1.1. Регуляция на уровне транскрипции 10
1.1.2. Регуляция на стадии сплайсинга 15
1.1.2.1. Традиционный сплайсинг 16
1.1.2.2. Альтернативный сплайсинг 19
1.1.3. Регуляция на стадии трансляции 25
1.1.3.1. Особенности регуляции трансляции мРНК рибосомных белков 25
1.1.3.2. Структурные элементы мРНК рибосомных белков, участвующие в регуляции трансляции 26
1.1.3.3. Белковые факторы, связывающиеся с 5'-UTR мРНК рибосомных белков 29
1.1.3.4. Роль компонентов аппарата трансляции в регуляции трансляции мРНК рибосомных белков 31
1.2. Внерибосомные функции рибосомных белков 34
1.2.1. Ферментативная активность рибосомных белков 35
1.2.2. Связь между рибосомпьши белками и апоптозом 35
1.2.3. Роль рибосомных белков при злокачественной трансформации клеток 39
1.2.3.1. Экспрессия генов рибосомных белков в опухолевых клетках 39
1.2.3.2. Функции рибосомных белков при злокачественной трансформации 41
1.2.4. Рибосомные белки как антигены при аутоиммунных заболеваниях 44
1.2.5. Участие рибосомных белков в клеточном ответе на вирусную инфекцию 45
1.2.6. Влияние рибосомных белков на эмбриональное развитие 47
1.2.7. Несистематизированные внерибосомные функции 48
1.3. Заключение 52
ГЛАВА 2. Рибосомный белок S26 человека: взаимодействие с собственной пре-мРНК и участие в регуляции ее сплайсинга 54
2.1. Результаты 54
2.1.1. ДНК-матрицы для синтеза РНК-транскриптов, соответствующих различным фрагментам мРНК и пре-мРНК рибосомного белка S26 54
2.1.2. Связывание суммарного 40S рибосомного белка с фрагментами мРНК и пре-мРНК рибосомного белка S26 55
2.1.3. Влияние рибосомных белков на взаимодействие белков ядерного экстракта с первым интроном пре-мРНК рибосомного белка S26 59
2.1.4. Получение специфической антисыворотки против rpS26 и рекомбипантного рибосомного белка S26 человека 61
2.1.4.1. Выделение индивидуального rpS26 человека и получение специфичной антисыворотки против него 61
2.1.4.2. Получение рекомбипантного rpS26 человека 62
2.1.5. Связывание рекомбипантного рибосомного белка S26 с фрагментами собственных мРНК и пре-мРНК 64
2.1.6. Связывание эндогенного rpS26 ядерного экстракте клеток HeLa с фрагментами собственных мРНК и пре-мРНК 65
2.1.6.1. Выделение специфичных антител против rpS26 из антисыворотки, полученной против rpS26 65
2.1.6.2. Связывание rpS26 в составе ядерного экстракта клеток HeLa с фрагментами собственных мРНК и пре-мРНК 66
2.1.7. Влияние rpS26 на сплайсинг собственной пре-мРНК 68
2.1.8. Определение участков мРНК и пре-мРНК, вовлеченных во взаимодействие с рибосомным белком S26 69
2.2. Обсуждение результатов 74
2.2.1. Связывание рибосомных белков 40S субчастиц рибосом человека с мРНК и пре-мРНК rpS26 74
2.2.2. Участки связывания рибосомпого белка S26 на пре-мРНК и мРНК 77
2.2.3. Альтернативный сплайсинг пре-мРНК рибосомного белка S26 78
2.2.4. Роль рибосомного белка S26 человека в регуляции сплайсинга собственной пре-мРНК 79
2.2.5. Предлагаемые механизмы, по которым происходит регуляция сплайсинга пре-мРНК рибосомного белка S26 80
2.3. Заключение S1
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 82
3.1. Материалы 82
3.2. Выделение 40S субчастиц рибосом человека 83
3.3. Выделение суммарного 40S рибосомного белка 84
3.4. Анализ рибосомных белков одномерным и двумерным гель-электрофорезом 85
3.5. Получение кДНК для синтеза фрагментов мРНК и пре-мРНК рибосомного белка S26 человека 86
3.6. Получение меченых и немеченых РНК-транскриптов 87
3.7. Получение рекомбинантного рибосомного белка S26 человека 87
3.8. Получение специфичной антисыворотки против рибосомного белка S26 89
3.9. Выделение антител против рибосомного белка S26 89
3.10. Получение ядерного экстракта клеток HeLa 90
3.11. Связывание рибосомных белков с РНК-транскриптами 91
3.11.1. Связывание на нитроцеллюлозных фильтрах 91
3.11.2. РНК-белковый блотинг 91
3.11.3. Связывание в составе ядерного экстракта клеток HeLa 92
3.12. Прямые УФ-индуцируемые сшивки белков ядерного экстракта с РНК-транскриптами 92
3.13. Сплайсинг фрагмента пре-мРНК in vitro и анализ продуктов сплайсинга 93
3.14. Тоу-принтинг комплексов рибосомного белка S26 с
фрагментами своих мРНК и пре-мРНК 94
Выводы 95
Список литературы 96
- Структурные элементы мРНК рибосомных белков, участвующие в регуляции трансляции
- Связывание суммарного 40S рибосомного белка с фрагментами мРНК и пре-мРНК рибосомного белка S26
- Связывание рибосомных белков 40S субчастиц рибосом человека с мРНК и пре-мРНК rpS26
- Получение рекомбинантного рибосомного белка S26 человека
Введение к работе
В состав эукариотической рибосомы входят четыре РНК и около 80 белков. Точная регуляция биосинтеза рибосомных компонентов является необходимым условием для полноценной жизнедеятельности как отдельной клетки, так и целых органов. Нарушение этой регуляции приводит к таким критическим последствиям, как злокачественные трансформации, апоптоз, отклонения в развитии органов и т.д. Поэтому неудивительно, что на исследовании биосинтеза компонентов эукариотической рибосомы, в частности, рибосомных белков в настоящее время сосредоточены усилия многих исследовательских групп. Вначале необходимо отметить принципиальные различия в регуляции биосинтеза рибосомных белков у про- и эукариот. У прокариот гены рибосомных белков сосредоточены в оперонах, и регуляция их экспрессии в основном происходит по принципу "обратной связи" на стадии трансляции [1]. У эукариот гены рибосомных белков диспергированы в геноме [2], и регуляция их экспрессии происходит на стадиях транскрипции [3], сплайсинга [4] и трансляции [5]. Кроме того, у эукариот регуляция количества рибосомных белков в клетке может осуществляться за счет изменения скорости деградации вновь синтезированных белков [6]. К настоящему времени времени достигнуты значительные успехи в изучении регуляции транскрипции у дрожжей [3] и трансляции у высших эукариот [5]. Согласно полученным данным, в обоих случаях регуляция происходит коордииированно для генов всех рибосомных белков. Координация достигается благодаря наличию общих cis-активных элементов как в генах рибосомных белков, так и в их мРНК. С другой стороны, с помощью анализа EST последовательностей, соответствующих мРНК рибосомных белков человека [7], выявлены существенные различия в количествах мРНК, кодирующих разные рибосомиые белки, в клетках нормальных тканей. Есть все основания полагать, что эти различия связаны с регуляцией экспрессии генов рибосомных белков на стадии сплайсинга их пре-мРНК. Однако экспериментальных доказательств регуляции биосинтеза рибосомных белков на стадии сплайсинга к настоящему времени получено мало, и большинство из них касается рибосомных белков низших эукариот (см., например, [4]). Согласно этим данным рибосомные белки могут связываться с собственными пре-мРНК и ингибировать их
сплайсинг. Данные по регуляции сплайсинга пре-мРНК рибосомных белков млекопитающих, в частности человека, на момент начала настоящей работы полностью отсутствовали.
Целью настоящей работы являлось изучение связывания рибосомных белков человека с пре-мРНК и мРНК rpS26 и выявление роли rpS26 в сплайсинге своей пре-мРНК. Рибосомиый белок S26 является одним из ключевых белков мРНК-связывающего центра рибосом млекопитающих [8] и не имеет гомологов среди рибосомных белков прокариот [9].
Основными задачами являлись:
-- выявление рибосомных белков, взаимодействующих с пре-мРНК и мРНК rpS26;
~ получение рекомбинантного rpS26 человека и характеризация его взаимодействия с фрагментами пре-мРНК и мРНК rpS26;
-- определение участков связывания rpS26 на своих мРНК и пре-мРНК;
— изучение сплайсинга in vitro фрагмента пре-мРНК rpS26, содержащего первый экзон, первый интрон и часть второго экзона, и выяснение роли rpS26 в этом процессе.
Структурные элементы мРНК рибосомных белков, участвующие в регуляции трансляции
Очевидно, что для селективного контроля трансляции мРНК рибосомных белков необходимы некие общие структурные элементы, узнаваемые белковыми факторами, способными регулировать переход мРНК из активного в неактивное состояние и наоборот. Анализ нуклеотидных последовательностей мРНК рибосомных белков позвоночных показал, что эти мРНК имеют ряд отличительных особенностей. Так, мРНК всех рибосомных белков начинаются с остатка цитидина, что редко встречается среди мРНК других белков, и содержат короткие (в среднем до 40 нуклеотидов) 5 -UTR. мРНК большинства рибосомных белков на 5 -конце 5 -UTR несут короткий (4-13 нуклеотидов) олигопиримидиновый тракт. Кроме этого, 5 -UTR не содержат ложных старт-кодонов, а окружение инициирующего AUG ко дона совпадает с кон сенсу с ной последовательностью, характерной для позвоночных [5],
Первоначальное доказательство роли 5 -UTR в регуляции трансляции мРНК рибосоми ых белков получено в экспериментах, где использовали химерный ген хлорамфениколацетилтрансферазы, в котором 5 -UTR была заменена на 5 -UTR рибосо много белка S19. При инъекции этого химерного гена в оплодотворенные яйца Xenopus laevis он экспрессировался типичным для рибосомных белков образом [70]. Аналогичным способом показана важность 5 -UTR в регуляции трансляции мРНК рибосомного белка Al Drosophila mdanogaster. Химерный ген, содержащий 5 -UTR мРНК этого белка и кодирующую часть мРНК а-тубулина, был трансфицирован в зародыши Drosophila melanogaster. Уровень трансляции гибридной мРНК в яйцеклетках н на эмбриональных стадиях развития трансфицированных зародышей мух изменялся в соответствии с уровнем трансляции мРНК других рибосомных белков [71]. В этой же работе обнаружено, что З -UTR мРНК рибосомных белков тоже может играть регуляторную роль в трансляции этих мРНК. Так, скорость трансляции гибридной мРНК а-тубулина, в которой З -UTR была заменена на З -UTR мРНК рибосомного белка А1, понижалась по ходу развития зародышей, хотя не в такой сильной степени, как при замене 5 -UTR мРНК. Известны примеры, когда З -UTR участвует в регуляции трансляции мРНК нерибосомиых белков (см., например, [72]). Однако, данные о регуляторпой роли З -UTR мРНК рибосомных белков [71] до сих пор не получили подтверждения. Кроме того, эти данные не согласуются с результатами более ранней работы [73], полученными при трансфекции экспоненциально растущих клеток мыши Р1798 химерными генами, кодирующими мРНК, в которых кодирующие области и З -UTR рибосомных и нерибосомиых белков были связаны в различных комбинациях с нативной или мутантной 5 -UTRMPHK рибосомных белков или с 5 -UTR мРНК р-актина. Оказалось, что замена З -UTR в мРНК р-актина на З -UTR одного из рибосомных белков S16, L30 или L32 не меняла трансляционного поведения мРНК р-актина. Напротив, мРНК Р-актшга, у которой 5 -UTR была заменена на 5 -UTR одного из указанных выше белков, транслировалась как мРНК рибосомных белков. Чтобы более точно локализовать c/j-активныс регуляторные элементы, расположенные в 5 -UTR, в работе [73] использовали два мутантиых гена rpS16, в одном из них 5 из 8 пиримидиіюв в консервативном полипиримидиновом тракте были заменены на пурины, а в другом - 5 -концевой цитидин был заменен на аденозин. В обоих случаях картина распределения мутантных мРНК между полисомами и РНП была похожа на распределение мРНК нерибосомпых белков, что свидетельствует об участии этих структурных элементов 5 -UTR в регуляции трансляции. В другой работе изучали влияние полипиримидинового тракта на трансляционную активность мРНК rpL32 мыши при митогенной активации Т-лимфоцитов [74]. Оказалось, что мРНК в которой отсутствует полипиримндиновын тракт, не изменяет своей трансляционной активности, в то время как эффективность трансляции мРНК, содержащей полипиримидиновый тракт, возрастает. Способность 5 -полимиримидинового тракта регулировать трансляцию зависит от его положения в мРНК. Когда между 5 -полипиримидиновым трактом и кэпом вставили последовательность из 42 нуклеотидов, химерная мРНК транслировалась как мРНК типичного нерибосомного белка. Более того, сдвиг 5 -полипиримидинового тракта относительно кэпа только па один нуклеотид имел точно такой же эффект [75]. Природа нуклеотида, примыкающего к кэпу, также влияет на трансляционное поведение мРНК, У мРНК белка hnRNP А1 и ро1у(А)-связывающего белка, относящихся к классу ТОР мРНК, в отличие от мРНК рибосом ных белков, рядом с кэпом находится остаток гуанозина, вероятно, поэтому вышеупомянутые мРНК и мРНК рибосомных белков транслируются не синхронно. После замены этого остатка гуанозина па остаток цитидина трансляционное поведение этих мРНК становится таким же, как мРНК рибосомных белков [76].
Другим структурным элементом, важным для регуляции трансляции мРНК рибосомных белков, является вариабельная последовательность, расположенная в 5 -UTR с 3 -стороны от полипиримидинового тракта. По крайней мере, мРНК рибосомных белков S16 и L32 Xcnopus laevis, у которых эта последовательность отсутствовала, и мРНК других рибосомных белков, содержащих эту последовательность, транслировались не синхронно [75]. В этой же работе показано, что трансляционное поведение мРНК rpL14 Xenopus laevis, ген которого трансфецировали в клетки лимфосаркомы мыши, не отличается от поведения мРНК эндогенных рибосомных белков. И, наоборот, мРНК rpL32 мыши после трапсфекции гепа rpL32 в клетки печени Xenopus laevis ведет себя так же, как мРНК эндогенных рибосомпых белков. Эти данные свидетельствуют о том, что регуляторные m-элементы мРНК рибосомпых белков позвоночных являются консервативными.
Белковые факторы, связывающиеся с 5 -UTRрибосомпых белков Наличие регуляторних ds-активных элементов в структуре мРНК рибосомных белков дает основание предполагать, что существуют trans-активные элементы (белковые факторы), которые взаимодействуют с трансляционными регуляторными последовательностями, изменяя сродство мРНК к компонентам аппарата трансляции. Поиск таких элементов проведен в работе [77], где авторы изучали прямые УФ-индуцируемые сшивки белков клеточного экстракта Т-лимфоцитов с 32Р-меченым транскриптом, соответствующим 5 -UTR мРНК рибосомного белка L32 мыши. Анализ продуктов сшивки с помощью одномерного гель-электрофореза в присутствии SDS выявил единственную радиоактивную полосу, которую отнесли к белку с молекулярной массой в 56 кДа. Связывания транскрипта с этим белком не наблюдали, когда транскрипт содержал 5 -UTR, в которой были удалены хотя бы 10 нуклеотидов с 3 -стороны, или если остатки гуанина в последовательности, примыкающей к полипиримидиновому тракту с З -стороны, были заменены на остатки аденина или если транскрипт не содержал 5 -полипиримидинового тракта. Таким образом, данные, полученные в работе [77], позволяют заключить, что для связывания белка клеточного экстракта с молекулярной массой 56 кДа (p56L32) с мРНК рибосомного белка необходимы как 5 полипиримидиновый тракт, так и последовательность с 3 -стороны от этого тракта ("downstream" последовательность). Следует отметить, что ранее был найден белок с близкой молекулярной массой (57 кДа), который связывался с РНК, содержащими полипиримидиновый тракт [78], однако, в отличие охрЬв12,1, для связывания этого белка с 5 -UTR мРНК rpL32 не требовалась последовательность с З -стороны от полипиримидинового тракта.
Связывание суммарного 40S рибосомного белка с фрагментами мРНК и пре-мРНК рибосомного белка S26
При изучении связывания рибосомных белков с РНК особо остро встает вопрос о специфичности их взаимодействий из-за высокого положительного заряда, присущего большинству рибосомных белков. По этой причине в настоящей работе использованы три различных экспериментальных подхода для изучения взаимодействия рибосомных белков и, в частности, rpS26 с мРНК и пре-мРНК rpS26.
Эксперименты по РНК-белковому блотингу позволили идентифицировать рибосомные белки, которые могут связываться с мРНК и пре-мРНК rpS26, и выявить два из них, а именно S23 и S26, связывание с которыми было предпочтительным (рис. 8). О специфичности этого взаимодействия свидетельствует тот факт, что рибосомные белки не связываются с фрагментом пре-мРНК тропомиозииа человека в тех же условиях (рис. 8, дорожка б). Кроме идентификации рибосомных белков, связывающихся с мРНК и пре-мРНК rpS26, эксперименты по РНК-белковому блотингу позволили предварительно локализовать участок связывания на пре-мРНК. Одинаковые наборы белков, связывающихся с фрагментом I, содержащим первый интрон, и с фрагментом И, в котором наряду с первым интроном присутствует второй экзон (рис. 8, дорожки 3 и 4), и близкие величины эффективности связывания этих фрагментов с белками 40S субчастицы (рис. 8, эти же дорожки) рибосомы указывают на то, что участок связывания этих белков расположен в области первого интрона. Об этом же свидетельствуют данные эксперимента с фрагментом Ш, содержащим первый интрон, второй экзоп, второй интрон и часть третьего экзона, согласно которым с этим фрагментом связываются те же самые рибосомные белки, что и с фрагментами I и II (рис. 8, дорожки 3-5). Более того, участок связывания рибосомных белков на прс-мРНК расположен на границе между первым интроном и экзонами и, по-видимому, смещен в сторону нитрона, так как фрагмент мРНК связывается с тем же набором рибосомных белков (рис. 8, дорожка 2), что и фрагменты пре-мРНК (рис. 8, дорожки 3-5), но с меньшей эффективностью.
Результаты экспериментов по фильтрованию комплексов рибосомных белков с фрагментами мРНК и пре-мРНК rpS26 через нитроцеллюлозиые фильтры подтверждают сделанное выше предположение о связывание рибосомных белков с пре-мРНК rpS26 на границе между первым интроном и экзонами. В частности, об этом свидетельствуют более высокая степень связывания суммарного 40S рибосомного белка с фрагментами пре-мРНК и близкие величины уровней связывания фрагмента I, содержащего первый интрон и второй экзон, и фрагмента II, в котором второй экзон отсутствовал (рис. 7).
Следует отметить, что положение первого интропа в гене rpS26 эукариот является весьма консервативным [239], что указывает на участие этого интропа в регуляции экспрессии гена. Более того, именно первому интрону пре-мРНК рибосомных белков приписывают возможную регуляторную функцию на стадии процессинга [45]. Кроме того, известно, что через связывание с первым интроном рибосомные белки S14 [51] и L30 [4] дрожжей регулируют сплайсинг своих пре-мРНК.
Оказалось, что белки 40S субчастицы рибосомы значительно повышают эффективность УФ-индуцируемых сшивок белков ядерного экстракта клеток Не La с фрагментами прс-мРНК rpS26 в условиях сплайсинга in vitro, но сами при этом не образуют продуктов сшивок с этими РНК (см. рис. 10). Эти ядерные белки (один из которых, возможно, является La аутоантигеном), как и рибосомные белки взаимодействуют с пре-мРНК в области первого интропа. Об этом свидетельствует тот факт, что один и тот же набор белков ядерного экстракта связывается с фрагментами пре-мРНК, содержащими первый интрон, независимо от наличия в них второго экзон а или второго интрона и части третьего экзона. Можно было бы предположить, что повышение сродства пре-мРНК rpS26 к некоторым белкам ядерного экстракта происходит вследствие изменения ее вторичной/третичной структуры, вызванного взаимодействием с рибосомными белками, которые после связывания белков ядерного экстракта диссоциируют в раствор. Однако результаты экспериментов по иммунопреципитации (см. рис. 15) показали, что rpS26 (один из двух белков, наиболее сильно связывающихся с фрагментами пре-мРНК rpS26) находится в комплексе с пре-мРНК в ядерном экстракте. Следовательно, диссоциации по крайней мере rpS26 из комплекса с пре-мРНК после связывания ее с белками ядерного экстракта не происходило. Кроме того, обращает на себя внимание тот факт, что рибосомные белки S23 и S26, сродство которых к первому интрону значительно выше, чем у других белков 40S субчастицы рибосомы, не сшивались с фрагментами пре-мРНК даже в отсутствие ядерного экстракта. Следовательно, отсутствие сшивок с белками rpS23 и rpS26 объясняется другими причинами. В частности, одной из возможных причин могло быть то, что среди аминокислотных остатков rpS26, контактирующих с пре-мРНК, не было остатков, конформация которых подходила бы для образования сшивки. Кроме того, метод прямых УФ-сшивок дает информацию только о белках, взаимодействующих с одн оцеп очечными участками РНК [240], а по данным тоу-принтинга по крайней мере половина нуклеотидов, на которых происходили зависимые от rpS26 остановки обратной транскрипции, расположена в двуцепочечных участках РНК. Следует отмстить, что рибосомные белки S2/S3a, S6 и S8, сродство которых к первому интрону значительно ниже, чем у рибосомных белков S23 и S26, сшивались с фрагментами пре-мРНК в отсутствие ядерного экстракта (рис. 10). В присутствии ядерного экстракта сшивок с этими белками не наблюдали, по-видимому, благодаря тому, что белки ядерного экстракта вытесняли данные рибосомные белки из комплексов с пре-мРНК. Таким образом, метод УФ-индуцируемых сшивок оказался непригодным для регистрации комплексов рибосомных белков с фрагментами пре-мРНК rpS26 в ядерном экстракте клеток.
Альтернативным подходом для выявления комплексов рибосомных белков с мРНК и пре-мРНК rpS26 в ядерном экстракте клеток является метод иммунопреци питании. Поскольку выделение индивидуальных рибосомных белков и получение антител против каждого из них является чрезвычайно дорогостоящей и трудоемкой процедурой, дальнейшие усилия были сосредоточены на изучении взаимодействия этих РНК с rpS26. Для этого в настоящей работе был создан соответствующий суперпродуцент и осуществлена препаративная наработка рекомбинантного rpS26 в клетках E.coli, С использованием этого белка были выделены специфичные антитела из кроличьей антисыворотки, содержащей антитела против rpS26 из плаценты человека. Результаты экспериментов по иммунопреципитации показали, что повышение в ядерном экстракте концентрации rpS26 при добавлении рекомбинантного белка приводит к увеличению количества как пре-мРНК, так и мРНК, находящихся в комплексе с rpS26. Это подтверждает сделанный нами ранее вывод о том, что rpS26 специфично связывается со своей пре-мРНК в области границы между первым интропом и экзонами и указывает иа то, что rpS26 принимает участие в регуляции сплайсинга своей пре-мРНК.
Как и в случае суммарного 40S рибосомного белка эффективность связывания рекомбинантного rpS26 с пре-мРНК rpS26 была выше, чем с мРНК, хотя эти различия не так выражены, как в экспериментах с суммарным 40S рибосомным белком. О специфичности связывания свидетельствуют данные о том, что фрагменты мРНК и пре-мРНК в значительно меньшей степени связываются с rpS19, чем с rpS26 (рис. 13а), и что немеченые РНК (poly(A U), фрагмент 18S рРНК и фрагмент пре-мРНК rpS13) слабо конкурируют с меченым первым интроном пре-мРНК rpS26 за связывание с rpS26; в то время как немеченый интроп в значительной степени подавляет это связывание (рис. 136).
Связывание рибосомных белков 40S субчастиц рибосом человека с мРНК и пре-мРНК rpS26
При изучении связывания рибосомных белков с РНК особо остро встает вопрос о специфичности их взаимодействий из-за высокого положительного заряда, присущего большинству рибосомных белков. По этой причине в настоящей работе использованы три различных экспериментальных подхода для изучения взаимодействия рибосомных белков и, в частности, rpS26 с мРНК и пре-мРНК rpS26.
Эксперименты по РНК-белковому блотингу позволили идентифицировать рибосомные белки, которые могут связываться с мРНК и пре-мРНК rpS26, и выявить два из них, а именно S23 и S26, связывание с которыми было предпочтительным (рис. 8). О специфичности этого взаимодействия свидетельствует тот факт, что рибосомные белки не связываются с фрагментом пре-мРНК тропомиозииа человека в тех же условиях (рис. 8, дорожка б). Кроме идентификации рибосомных белков, связывающихся с мРНК и пре-мРНК rpS26, эксперименты по РНК-белковому блотингу позволили предварительно локализовать участок связывания на пре-мРНК. Одинаковые наборы белков, связывающихся с фрагментом I, содержащим первый интрон, и с фрагментом И, в котором наряду с первым интроном присутствует второй экзон (рис. 8, дорожки 3 и 4), и близкие величины эффективности связывания этих фрагментов с белками 40S субчастицы (рис. 8, эти же дорожки) рибосомы указывают на то, что участок связывания этих белков расположен в области первого интрона. Об этом же свидетельствуют данные эксперимента с фрагментом Ш, содержащим первый интрон, второй экзоп, второй интрон и часть третьего экзона, согласно которым с этим фрагментом связываются те же самые рибосомные белки, что и с фрагментами I и II (рис. 8, дорожки 3-5). Более того, участок связывания рибосомных белков на прс-мРНК расположен на границе между первым интроном и экзонами и, по-видимому, смещен в сторону нитрона, так как фрагмент мРНК связывается с тем же набором рибосомных белков (рис. 8, дорожка 2), что и фрагменты пре-мРНК (рис. 8, дорожки 3-5), но с меньшей эффективностью.
Результаты экспериментов по фильтрованию комплексов рибосомных белков с фрагментами мРНК и пре-мРНК rpS26 через нитроцеллюлозиые фильтры подтверждают сделанное выше предположение о связывание рибосомных белков с пре-мРНК rpS26 на границе между первым интроном и экзонами. В частности, об этом свидетельствуют более высокая степень связывания суммарного 40S рибосомного белка с фрагментами пре-мРНК и близкие величины уровней связывания фрагмента I, содержащего первый интрон и второй экзон, и фрагмента II, в котором второй экзон отсутствовал (рис. 7).
Следует отметить, что положение первого интропа в гене rpS26 эукариот является весьма консервативным [239], что указывает на участие этого интропа в регуляции экспрессии гена. Более того, именно первому интрону пре-мРНК рибосомных белков приписывают возможную регуляторную функцию на стадии процессинга [45]. Кроме того, известно, что через связывание с первым интроном рибосомные белки S14 [51] и L30 [4] дрожжей регулируют сплайсинг своих пре-мРНК.
Оказалось, что белки 40S субчастицы рибосомы значительно повышают эффективность УФ-индуцируемых сшивок белков ядерного экстракта клеток Не La с фрагментами прс-мРНК rpS26 в условиях сплайсинга in vitro, но сами при этом не образуют продуктов сшивок с этими РНК (см. рис. 10). Эти ядерные белки (один из которых, возможно, является La аутоантигеном), как и рибосомные белки взаимодействуют с пре-мРНК в области первого интропа. Об этом свидетельствует тот факт, что один и тот же набор белков ядерного экстракта связывается с фрагментами пре-мРНК, содержащими первый интрон, независимо от наличия в них второго экзон а или второго интрона и части третьего экзона. Можно было бы предположить, что повышение сродства пре-мРНК rpS26 к некоторым белкам ядерного экстракта происходит вследствие изменения ее вторичной/третичной структуры, вызванного взаимодействием с рибосомными белками, которые после связывания белков ядерного экстракта диссоциируют в раствор. Однако результаты экспериментов по иммунопреципитации (см. рис. 15) показали, что rpS26 (один из двух белков, наиболее сильно связывающихся с фрагментами пре-мРНК rpS26) находится в комплексе с пре-мРНК в ядерном экстракте. Следовательно, диссоциации по крайней мере rpS26 из комплекса с пре-мРНК после связывания ее с белками ядерного экстракта не происходило. Кроме того, обращает на себя внимание тот факт, что рибосомные белки S23 и S26, сродство которых к первому интрону значительно выше, чем у других белков 40S субчастицы рибосомы, не сшивались с фрагментами пре-мРНК даже в отсутствие ядерного экстракта. Следовательно, отсутствие сшивок с белками rpS23 и rpS26 объясняется другими причинами. В частности, одной из возможных причин могло быть то, что среди аминокислотных остатков rpS26, контактирующих с пре-мРНК, не было остатков, конформация которых подходила бы для образования сшивки. Кроме того, метод прямых УФ-сшивок дает информацию только о белках, взаимодействующих с одн оцеп очечными участками РНК [240], а по данным тоу-принтинга по крайней мере половина нуклеотидов, на которых происходили зависимые от rpS26 остановки обратной транскрипции, расположена в двуцепочечных участках РНК. Следует отмстить, что рибосомные белки S2/S3a, S6 и S8, сродство которых к первому интрону значительно ниже, чем у рибосомных белков S23 и S26, сшивались с фрагментами пре-мРНК в отсутствие ядерного экстракта (рис. 10). В присутствии ядерного экстракта сшивок с этими белками не наблюдали, по-видимому, благодаря тому, что белки ядерного экстракта вытесняли данные рибосомные белки из комплексов с пре-мРНК. Таким образом, метод УФ-индуцируемых сшивок оказался непригодным для регистрации комплексов рибосомных белков с фрагментами пре-мРНК rpS26 в ядерном экстракте клеток.
Альтернативным подходом для выявления комплексов рибосомных белков с мРНК и пре-мРНК rpS26 в ядерном экстракте клеток является метод иммунопреци питании. Поскольку выделение индивидуальных рибосомных белков и получение антител против каждого из них является чрезвычайно дорогостоящей и трудоемкой процедурой, дальнейшие усилия были сосредоточены на изучении взаимодействия этих РНК с rpS26. Для этого в настоящей работе был создан соответствующий суперпродуцент и осуществлена препаративная наработка рекомбинантного rpS26 в клетках E.coli, С использованием этого белка были выделены специфичные антитела из кроличьей антисыворотки, содержащей антитела против rpS26 из плаценты человека. Результаты экспериментов по иммунопреципитации показали, что повышение в ядерном экстракте концентрации rpS26 при добавлении рекомбинантного белка приводит к увеличению количества как пре-мРНК, так и мРНК, находящихся в комплексе с rpS26. Это подтверждает сделанный нами ранее вывод о том, что rpS26 специфично связывается со своей пре-мРНК в области границы между первым интропом и экзонами и указывает иа то, что rpS26 принимает участие в регуляции сплайсинга своей пре-мРНК.
Как и в случае суммарного 40S рибосомного белка эффективность связывания рекомбинантного rpS26 с пре-мРНК rpS26 была выше, чем с мРНК, хотя эти различия не так выражены, как в экспериментах с суммарным 40S рибосомным белком. О специфичности связывания свидетельствуют данные о том, что фрагменты мРНК и пре-мРНК в значительно меньшей степени связываются с rpS19, чем с rpS26 (рис. 13а), и что немеченые РНК (poly(A U), фрагмент 18S рРНК и фрагмент пре-мРНК rpS13) слабо конкурируют с меченым первым интроном пре-мРНК rpS26 за связывание с rpS26; в то время как немеченый интроп в значительной степени подавляет это связывание (рис. 136).
Получение рекомбинантного рибосомного белка S26 человека
Суммарную РНК из плаценты человека выделяли по методу, описанному в работе [245], Выделение полиаденилировапной РНК из суммарной клеточной РНК и синтез первой цепи кДНК с помощью праймера d(T)n.is проводили в соответствие со стандартными протоколами, описанными в [246]. кДНК rpS26 получали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием набора фирмы "Advanced Biotechnology". В качестве праймеров для амплификации использовали олигодезоксирибонуклетиды . Реакционную смесь предварительно инкубировали при 94СС 3 мин, после чего проводили амплификацию в течение 30 циклов (30 с - 95С, 40 с - 55С и 1 мин - 72С). Последнюю элонгацию проводили при 72С в течение 7 мин. Продукты амплификации анализировали в 2%-ном агарозном геле. После гидролиза полученной ДНК рестриктазачи ВатШ и Ndel ее лигировали с плазмидой рЕТ-15Ь, которая предварительно была линеаризована по тем же самым сайтам рестрикции. После трансформации полученных плазмид в штамм E.coli XLl-Blue клетки наращивали в 100 мл среды LB, и плазмиду выделяли согласно [246]. Нуклеотидную последовательность кДНК rpS26, клонированную в плазмиду, определяли с помощью секвенированиия. Полученную плазмиду трансформировали в штамм Exoli BL21 (DE3), содержащий хромосомную копию гена РНК-полимеразы фага Т7. Посевной материал выращивали в 100 мл среды LB в присутствии 100 мкг/мл ампицилина до ОПзао 2 о.е./мл, затем переносили в вихревой биореактор "БИОК", и проводили культивирование клеток согласно [247], Синтез рекомбинантного белка индуцировали добавлением изопропил-В-О-тиогалактозида до концентрации 1 мМ. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием, ресуспендировали в 20 мМ буфере HEPES-KOH, рН 7.6, содержащем 20 мМ КО, 6 мМ 2-меркаптоэтапол и 2 мМ фенилметансульфонил фторид, и лидировали с помощью 100 мкг/мл лизоцима в течение 30 мин при 0С. После этого лизированные клетки обрабатывали ультразвуком (44 кГц) в течение 1.5 мин при 0С, тельца включения осаждали с помощью центрифугирования при 18000 об/мин, 15 мин, 4С, растворяли в 6 М гуанидингидрохлориде и осветляли центрифугированием при тех же условиях. Рекомбинантный белок выделяли из телец включения с помощью хроматографии на колонке, содержащей Ni-NTA-агарозу, как описано в инструкции фирмы-производителя. Белок элюировали 200 мМ имидазолом в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5 и 6 М гуанидингидрохлорид. После выделения rpS26 ренатурировали методом ступенчатого диализа против 10 объемов 50 мМ буфера HEPES-KOH, рН 7.6, содержащего 1 М КС1, 20 мМ MgCh, 10 мМ 2-меркаптоэтанол и 1 М гуанидингидрохлорид на первой ступени, 0.5 М - на второй, 0.25 М - па третьей. На последней ступени диализа использовали тот же буфер, но без гуагшдингидрохлорида. На каждой ступени диализ проводили в течение 2 ч при 0С. После ренатурации концентрацию белка определяли по Брэдфорду. Полученный рекомбинантный rpS26 анализировали с помощью одномерного гель-электрофореза и двумерного гель-электрофореза в первой системе (см. п. 3.4). Для иммунизации кроликов фрагмент геля, содержащий 100-120 мкг rpS26 (после двумерного гель-электрофореза во второй системе (см. п. 3.4)), гомогенизировали в 0.7 мл 10 мМ буфера Трис-HCl рН 7.5, содержащего 130 мМ NaCl и 50%-ный полный адъювант Фрейнда. Полученную суспензию вводили кроликам подкожно в область холки в четыре места. Последующие три иммунизации проводили апологичным образом с интервалом 1 месяц, но вместо полного адъюванта Фрейнда использовали неполный адъювант. Забор крови у кроликов проводили из крайней ушной вены через неделю после трех последних иммунизации. Сыворотку очищали с помощью центрифугирования при 10000 об/мші в течение 15 мин, замораживали и хранили при -10С. Специфичность полученной атисыворотки проверяли с помощью иммуноблотинга. Для этого суммарный 40 S рибосомный белок разделяли с помощью одномерного или двумерного (первая система) гель-электрофореза (см. п. 3.4) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану в 192 мМ буфере Трис-глицин, рН 7.5, содержащем 0.05% ный SDS и 10%-ный метанол, в течение 30 мин при силе тока 100 мА на 50 см2 геля. После этого нитроцеллюлознуго мембрану выдерживали в 50 мМ буфере Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 150 мМ NaCI, 0.05%-ный Tween 20 и 5%-пое обезжиренное молоко, в течение 1 ч и затем инкубировали 2 ч со специфичной антисывороткой, разбавленной в 1000 раз вышеуказанным буфером. После этого мембрану промывали три раза по 5 мин буфером А (50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, содержащим 150 мМ NaCl, 0.2%-ный Tween 20 и 5 мМ MgCb), инкубировали 2 ч с разбавленными в 1000 раз буферам А антителами против IgG кролика, конъюгированных со щелочной фосфатазой, и промывали 3 раза по 5 мин щ буфером А. После этого мембрану промывали в течение 2 мин в 50 мМ буфере Трис-НО, рН 9.2, содержащем 150 мМ NaCl, 0.2%-ный Tween 20 и 5 мМ MgCh, и инкубировали в этом же буфере с субстратами щелочной фосфатазы, а с именно 0.33 мг/мл нитротетразолевого синего и 0.165 мг/мл 5-бром-4-хлор-З-индолилфосфата. 3.9, Выделение антител против рибосомного белка S26 Сто миллиграммов BrCN-агарозы инкубировали в 1 мМ НС1 в течение 15 мин при 20С, после чего промывали 0.1 М ИагСОз, рН 9.0. Активированную BrCN-агарозу инкубировали при перемешивании с 15.6 нмоль рекомбинантного rpS26 в течение 2 ч при 20С. К раствору белка предварительно добавили 0.1 М Na2COj, рН 9.0 до конечного рН 8.5. Затем сорбент попеременно промыли 4 раза по 1 мл 0.1 М СНзСОСЖа, рН 5.5 и 0.1 М Na2C03, рН 9.0, оба буфера содержали 0.5 М NaCl. Полученный аффинный сорбент уравновешивали 100 мМ буфером Трис-HCl, рН 7.5, содержащим 150 мМ NaCl (буфер Б), и инкубировали с 1 мл предварительно осветленной антисыворотки в течение 16 ч при 4С. После этого сорбент промывали 2 мл 50 мМ буфера Трис-HCl, рН 7.5, содержащего 120 мМ NaCl и 0.5%-ный Нонидет Р-40 (буфер В), 2 мл 50 мМ буфера Трис-HCl, рН 7.5, содержащего 1.0 М LiCl и 0.5%-ный Нонидет Р-40, 4 мл буфера В и 4 мл буфера Б. Связавшиеся с сорбентом антитела элюировали 50 мМ буфером глицин-HCl, рН 2.5, содержащим 150 мМ NaCl. Очищенные антитела анализировали с помощью иммуноблотинга, как описано в. п. 3.8.
