Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы... 11
1.1. Вирус Эпстайна-Барр: молекулярные механизмы регуляции вирусной репликации и роль клеточных факторов 11
1.2. Теломеры, как аналоги нонамеров вирусного генома, и факторы, связывающиеся с теломерными повторами.. 23
1.3. Регуляция инициации транскрипции на уровне формирования предишщиационного транскрипционного комплекса 27
1.3.1. Образование и свойства прединициационного транскрипционного комплекса у дрожжей 27
1.3.2. Роль фактора TFIIA в регуляции транскрипции 38
1.4. Регуляция жизнедеятельности вирусов и клеток на уровне посттрансляционных модификаций белков 41
1.4.1. Роль поли-АДФ-рибозилирования белков в жизни клетки 41
1.4.2. Фосфорилирование и его роль в регуляции транскрипции 49
2. Материалы и методы... 54
3. Результаты 70
3.1. Идентификация теломерных белков, ассоциированных с DS-элементом через взаимодействие cEBNAl 70
3.2. Ассоциация теломерных факторов с огіР в латентно инфицированной клеточной линии лимфомы Бёркитта 75
3.3. Кооперативное связывание TRF2 и EBNA1 с DS элементом 77
3.4. Влияние белков, связывающихся с нонамерными последовательностями, на опР-зависимую репликацию ДНК. 84
3.5. Функции нонамеров в поддержании стабильности вирусного генома 87
3.6. Влияние поли-АДФ-рибозных модификаций на функцию поддержания стабильности вирусного генома 89
3.7. Значение взаимодействия между TFIIA и ТВР для роста и жизнеспособности дрожжей 92
3.8. Нарушение клеточного цикла у дрожжей, мутантных по TFIIA 97
3.9. Роль взаимодействия между TFIIA и ТВР в выборе промотора in vivo 101
3.10. Активатор- и промотор- зависимые дефекты у дрожжей, мутантых по TFIIA . 103
3.11. In vivo фосфорилирование Toal субъединицы TFIIA комплекса 106
3.12. Стимуляция образования TFIIA-TBP-ДНК комплекса в результате фосфорилирования Toal 109
3.13. Значение фосфорилирования Toal для поддержания индуцибельной транскрипции группы промоторов in vivo 113
3.14. Влияние фосфорилирования Toal на жизнеспособность дрожжей 115
4. Обсуждение результатов... 118
Выводы 128
Литература 129
- Вирус Эпстайна-Барр: молекулярные механизмы регуляции вирусной репликации и роль клеточных факторов
- Роль поли-АДФ-рибозилирования белков в жизни клетки
- Идентификация теломерных белков, ассоциированных с DS-элементом через взаимодействие cEBNAl
- Стимуляция образования TFIIA-TBP-ДНК комплекса в результате фосфорилирования Toal
Введение к работе
Любой живой организм, на каком бы уровне организации он не находился, представляет собой открытую систему. Он постоянно находится под воздействием внешних факторов, и потому должен обладать способностью быстро и адекватно реагировать на изменения, происходящие во внешней среде. Жизненный цикл любого организма включает в себя пролиферацию, сопровождающуюся циклическими изменениями, происходящими во всем организме, и, если речь идет о многоклеточных организмах, дифференциацию, сопровождающуюся изменениями, происходящими на определенной фазе развития организма. Все эти процессы требуют от организма присутствия четких регуляторных механизмов, способных модулировать его функции и поддерживающих его в стабильном состоянии. Из числа таких регуляторных механизмов, особое значение принадлежит посттрансляционным модификациям.
Посттрансляционные модификации играют большую роль в регуляции тонких процессов жизнедеятельности. Способность быстро модифицировать функциональный белок, добавляя или снимая с его поверхности физиологически активные группы с помощью специфических ферментов, тем самым меняя заряд на его поверхности, конформацию и другие физико-химические свойства, позволяет использовать эти модификации в качестве «переключателя» во многих клеточных процессах. К таким посттрансляционным модификациям относятся фосфорилирование, ацетилирование, гликозилирование и другие.
Фосфорилирование представляет собой наиболее общий и важный механизм быстрой и обратимой регуляции белковых функций. Исследования животных клеток выявили, что примерно одна треть всех клеточных белков ковалентно модифицирована фосфорилированием. Фосфорилирование белков и последующее их дефосфорилирование действуют совместно в , сигнальных путях и вызывают быстрые изменения в ответ на воздействия гормонов, факторов роста и нейротрансмиттеров. Большинство факторов роста [Heldin, 1995] и цитокининов [Ihle et al., 1994] стимулируют фос формирование во время связывания со своими рецепторами. Индуцированное фосфорилирование в свою очередь активирует цитоплазматические протеинкиназы [Marshall, 1995]. Дополнительно, клеточный цикл у всех эукариот в обеих G1/S и G2/M переходных фазах регулируется циклин-зависимыми протеинкиназами [Doree and Galas, 1994]. Фосфорилированием также контролируется дифференциация и развитие клеток, а в определенных случаях и метаболизм.
По сравнению с ацетилированим и фосфорилированием, гликозилирование является более узко направленной модификацией, необходимой для поддержания структурной целостности белков. Поли-АДФ-рибозилирование является одним из определяющих процессов, регулирующих жизнь клетки. Он представляет собой посттрансляционную
1 модификацию ядерных белков, как немедленный ответ клетки на разрушение ДНК, вызванное ионизирующей радиацией, окислением и мутагенами [Ате et al., 2000]. Кроме того, поли-АДФ-рибозилирование играет существенную роль в регуляции процессов экспрессии генов и некоторых аспектов репликации ДНК [D Amours et al., 1999; Dantzer et al., 1999; Kraus and Lis, 2003].
Одновременно вопросы, касающиеся таких фундаментальных процессов регуляции живых организмов, как наследование генетической информации и ее реализация, находятся на переднем крае современной биологии. Такие процессы, как репликация и транскрипция ДНК, являются наиболее важными, благодаря которым реализуется программа развития всех живьк организаций, от индивидуальных организмов до целых популяций.
В связи с вышеизложенным определяется актуальность исследования роли различных посттрансляционных модификаций в регуляции жизненноважных функций находящихся на различных уровнях организации микроорганизмов, таких как репликация и транскрипция. Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение функций белков, принимающих участие в инициации транскрипции дрожжей и репликации вируса Эпстайна-Барр, а также механизмов их регуляции на уровне посттрансляционных модификаций.
В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи.
1. Выделить и охарактеризовать белки, входящие в состав комплекса, связанного с сайтом инициации репликации oriP вируса Эпстайна-Барр.
2. Определить потенциальный вклад активности отдельных белков в регуляцию инициации репликации и поддержания стабильности генома вируса Эпстайна-Барр.
3. Установить функциональную активность основного транскрипционного фактора дрожжей TFIIA в зависимости от выбранного промотора in vivo.
4. Выявить роль посттрансляционных модификаций транскрипционного фактора TFIIA в формировании прединициационного комплекса на различных типах промоторов.
5. Подтвердить значение различных типов посттрансляционных модификаций белков - поли-АДФ-рибозилирования и фосфорилирования - в регуляции жизненноважных функций микроорганизмов.
Научная новизна. Используя новую методику биохимического выделения ДНК-связывающих белков, впервые выделена и идентифицирована группа клеточных белков, специфически взаимодействующих с сайтом инициации репликации oriP вируса Эпстайна-Барр in vitro и in vivo. Этими белками оказались теломерные белки, участвующие в регуляции длины теломер. Показано влияние выделенных белков на функции репликации и поддержания стабильности вирусного генома. Отмечено, что эти функции регулируются различными механизмами двух типов: пассивным, за счет белок-белковых взаимодействий, и энзиматически активным за счет посттрансляционных модификаций. Установлено, что поли-АДФ-рибозилирование регулирует стабильность вирусного генома, модифицируя белки комплекса, связанного с oriP.
Впервые показана in vivo необходимость образования стабильного комплекса между транскрипционными факторами TFIIA и ТВР (TATA Binding Protein) и промоторной ДНК для нормального роста и жизнеспособности дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Показано, что стабильное взаимодействие между TFIIA и ТВР является лимитирующим фактором для экспрессии некоторых, но не всех, генов класса II (регулируемых РНК-полимеразой II). Особенно важны такие взаимодействия для экспрессии генов, содержащих индуцибельные промоторы, а также для генов, специфически регулируемых на определенных фазах клеточного цикла. Все это позволило подтвердить функцию TFIIA, как транскрипционного фактора, зависимого от структуры корового промотора, и необходимого для инициации транскрипции определенной группы генов in vivo. Впервые получены данные о фосфорилировании TFIIA in vivo в дрожжах. Показано, что фосфорилирование TFIIA стимулирует его комплексообразование с ТВР и промоторной ДНК, что является необходимым условием для поддержания максимального уровня транскрипции с некоторых промоторов in vivo.
Вышеуказанные научные факты и наблюдения позволили выявить общие закономерности функционирования живых систем разного уровня организации, а также механизмов регуляции их наиболее важных процессов жизнедеятельности.. В результате проведенных исследований на защиту выносятся следующие научные положения, отражающие новизну проделанной работы.
Основные защищаемые положения диссертации:
I. Клеточные белки, связывающиеся с сайтом инициации репликации oriP вируса Эпстайна-Барр, принимают участие в регуляции функций репликации и поддержания стабильности вирусного генома, в том числе используя посттрансляционный механизм поли-АДФ-рибозилирования белков для снижения активности исследуемых функций.
2. Основной транскрипционный фактор TFIIA регулирует
• формирование прединициационного транскрипционного комплекса in vivo на паромоторах определенной группы генов в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, выполняя в определенных случаях зависимую от его фосфорилирования функцию ко-активатора.
3. Пост трансляционные модификации белков, на примере поли-АДФ рибозилирования и фосфорилирования, представляют универсальный механизм регуляции жизненноважных функций микроорганизмов, обладающих различными уровнями организации.
Практическая значимость работы. Вирусом Эпстайна-Барр инфицировано более 90% человечества.. Хотя он в большинстве случаев устанавливает "молчащую" латентную инфекцию, он также ассоциирован с некоторыми раковыми заболеваниями. Результаты работ по изучению регуляции процессов жизнедеятельности вируса Эпстайна-Барр способствуют выявлению механизма участия вируса в этих заболеваниях. Определение путей регуляции, в частности репликации вирусной ДНК и поддержания стабильности его генома, и нахождение способов модуляции этих процессов дает возможность использовать эти знания в медицинских целях, в разработке фармакологических препаратов. К тому же есть основание предполагать, что некоторые другие вирусы могут обладать похожим механизмом регуляции репликации.
Дрожжи, в частности Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи), широко применяются в производстве, поэтому базисные исследования транскрипции их белков могут быть использованы в дальнейшем в разработке новых технологий, новой продукции, а также в усовершенствовании производственных процессов.
Связь работы с базовыми научными программами. Работа в течение 1994 - 2004 гг. проводится в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета (№ госрегистрации 01910049994). Исследование в рамках тематики работы были поддержанными грантами NIH (GM 1 2345-01 и GM 54687-02, США) и грантами Leukemia S ociety о f America (США) и American Cancer Society (США).
Место выполнения работы. Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета под руководством д.б.н. О.Н. Ильинской и в отделе молекулярной генетики Института анатомии и биологии Уистара (Wistar Institute, г. Филадельфия, США) под руководством д.б.н. П.М. Либермана.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на итоговых конференциях кафедры микробиологии КГУ, на IV научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2004), на отчетных научно-практических конференциях молодых ученых института анатомии и биологии Уистера (Филадельфия, США, 1998, 1999, 2000, 2001).
Публикации. Основной материал диссертационной работы нашел отражение в 6 печатных работах. Из них 4 научные работы опубликованы в центральной зарубежной и 1 - в российской печати, 1 - в сборнике тезисов докладов российской конференции.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам института Уистера (США), в сотрудничестве с которыми возникла идея этой работы, Д. Озеру, СП. Солоу, 3. Дэнд, Ч.-Д. Чен, С, Штивелбанд, а также сотрудникам кафедры микробиологии Казанского , государственного университета за теплую рабочую атмосферу Автор выражает благодарность профессору Н.А, Барлеву за критические замечания по структуре и содержанию диссертационного материала. Автор особо благодарит своих научных руководителей профессора О.И. Ильинскую и профессора П.М. Либермана.
Вирус Эпстайна-Барр: молекулярные механизмы регуляции вирусной репликации и роль клеточных факторов
Вирус Эпстайна-Барр (ВЭБ) принадлежит к семейству вирусов герпеса и является одним из наиболее распространенных вирусов человека. Более 90% человеческой популяции является носителем этого вируса. В момент изначального инфицирования организма-хозяина ВЭБ вызывает инфекционный мононуклеоз примерно в 50% случаев. Далее, инфицировав В-лимфоциты человека, вирус существует в латентной форме. Латентный ВЭБ выделен также в большом количестве случаев злокачественных опухолей и других заболеваний, включая лимфому Бёркитта, болезнь Ходжкина, назофарингальную карциному.. Это указывает на достаточно высокую вероятность, причастности вируса к этим заболеваниям, однако механизм его участия в вызывании раковых опухолей неизвестен. Несмотря на то, что ВЭБ ассоциирован с некоторыми болезнями, в подавляющем большинстве случаев он достаточно безобиден и обусловливает молчащую латентную инфекцию до конца жизни организма хозяина. ВЭБ в течение своего жизненного цикла проходит через две фазы, литическую и латентную. Во время этих фаз репликация генома ВЭБ проходит по двум различным сценариям. Во время литической фазы вирус реплицирует линейную форму двуцепочечной ДНК по типу «катящегося кольца». При этом происходит интенсивное увеличение копий геномной ДНК, необходимой для продуцирования вирусных единиц. Репликационные факторы, необходимые для этого типа репликации, в своем большинстве кодируются вирусным геномом. Сайты инициации литической репликации, oriLyt, находятся в двух различных регионах вирусного генома [Hammerschmidt and Sugden, 1988].
В латентном состоянии вирусная ДНК существует, как правило, в кольцевой эписомной форме в количестве нескольких копий на клетку. В некоторых случаях, однако, вирусная ДНК может быть интегрирована в хозяйскую хромосомную ДНК [Hirai et al., 1998]. Эписомная форма представляет собой кольцевую, экстрахромосомную форму существования вирусной ДНК - так называемую вирусную плазмиду. В отличие от литической, латентная репликация инициируется только один раз на один цикл деления клетки-хозяина, так что в клетке поддерживается стабильность вирусного генома, другими словами, стабильное количество копий вирусных плазмид на клетку [Yates and Guan, 1991]. Сайт инициации латентной репликации, oriP, представляет собой 2,2 КЬр (тысяч пар оснований) участок генома ВЭБ. В дополнение к нему были обнаружены еще несколько сайтов инициации репликации, отличных от oriP [Little and Schildkraut, 1995]. В отличие от литической репликации, для поддержания латентного ВЭБ генома требуется только один вирусный белок — EBNA1, однако, механизм, благодаря которому EBNA1 инициирует репликацию вирусного генома, пока неизвестен.
OriP имеет два участка сайтов связывания с белком EBNAL Один участок называется семейство повторов (FR) и представляет собой 20 сайтов связывания с EBNA1. Другой участок является элементом симметрии второго порядка (лучевой симметрии) (DS) и содержит 4 сайта связывания с EBNAL Благодаря работам с использованием направленного мутагенеза было показано, что DS элемент важен для репликационной функции oriP [Harrison, 1994; Niller, 1995]. Дальнейшие работы на клеточных линиях, стабильно экспрессирующих EBNA1, выявили, что DS элемент также является минимальной автономно реплицирующейся последовательностью [Shirakata and Hirai, 1998]. Другие биохимичекие исследования подтвердили, что двунаправленная репликация огг Я-содержащей плазмиды (оггР-плазмиды) инициируется в районе DS элемента [Gahn and Schildkraut, 1989]. Таким образом, DS элемент является сайтом инициации вирусной репликации. DS элемент состоит из 100 пар оснований и содержит два повтора последовательностей, симметрично расположенных относительно друг друга. Каждый повтор содержит два сайта связывания с EBNA1 по 20 Ьр (пар оснований), промежуток между которыми представляет собой всего только одну пару оснований. Таким образом, в общем числе DS элемент содержит 4 сайта связывания с EBNA1, пронумерованных от сайта 1 до сайта 4. EBNA1 формирует димер и в таком виде взаимодействует с единичным сайтом связывания [Bochkarev et al.,. 1995, 1996]. Эти EBNA1-связывающиеся последовательности очень важны для репликационнои функции ВЭБ. Единичный повтор, содержащий сайты связывания 1 и 2 (или сайты 3 и 4), обладает очень низкой автономной репликационнои активностью, в 30 раз меньше, чем у целого DS элемента. Однако в составе всей последовательности oriP половина DS элемента, содержащая два сайта связывания с EBNA1, обладает обычным уровнем репликационнои активности [Harrison, 1994]., Таким образом, семейство повторов FR, возможно, усиливает активность единичного повтора DS элемента и компенсирует нехватку другой половины. Дальнейшие эксперименты с использованием направленного мутагенеза выявили, что внедрение последовательности размером в 5 Ьр между сайтами 1 и 2 или сайтами 3 и 4 полностью уничтожает репликационную активность {Harrison, 1994]. В результате такой вставки сайт 2 (или сайт 4) поворачивается на 180 вдоль оси ДНК. EBNA1 может связываться со всеми 4 сайтами такого мутированного DS-элемента, но позиции EBNA1 -димеров относительно друг друга абсолютно различны по сравнению с таковыми дикого типа. Таким образом, определенная пространственная позиция EBNA1 на DS элементе важна для нормальной репликационнои активности. Анализ кристаллической структуры выявил, что один димер белка EBNA1,. связанный с сайтом 1, взаимодействует с другим, связанным с сайтом 2 [Bochkarev et al, 1996], Образование такого тетрамера может быть важным для инициации репликации с DS-элемента. Две пары сайтов связывания с EBNA1 на DS элементе разделены между собой и окружены с обоих сторон тремя нонамерными сайтами (TTAGGGTTA). Было показано, что нонамеры играют определенную роль в поддержании стабильности вирусного генома и сайт-направленные мутации всех трех последовательностей приводили к ослаблению этой функции [Niller et al, 1995; Yates et al.,2000; Deng et al., 2002]. Нонамеры также были -определены как сайты инициации синтеза ДНК, и, в результате мутации, уничтожающей две из трех нонамерных последовательностей, уменьшалась репликационная активность вирусной плазмиды [Koons et al., 2001]. К тому же нонамеры являются субъектом зависимого от клеточного цикла клетки-хозяина взаимодействия с неизвестными белками in vivo [Niller et al. 1995]. В настоящей работе были идентифицированы некоторые белки,, взаимодействующие с нонамерами. Характерно, что нонамерные последовательности идентичны теломерным последовательностям на концах человеческих хромосом.. Теломерные последовательности непосредственно .взаимодействуют с факторами TRF1 и TRF2 [Broccoli et al., 1997], и это взаимодействие регулируется ферментом танкиразой [Smith et al., 1998]. В работе [Deng et al., 2002] впервые было показано, что клеточные теломерные факторы взаимодействуют также и с нонамерными повторностями DS элемента генома ВЭБ. Известно, что теломерные факторы принимают участие в регуляции длины теломер, в то же время в данной работе было обнаружено, что эти факторы вовлечены в регуляцию важнейших процессов ВЭБ, таких как транскрипция и поддержание стабильного количества копий вирусного генома.
Роль поли-АДФ-рибозилирования белков в жизни клетки
Поли-АДФ-рибозилирование является одним из определяющих процессов, регулирующих жизнь клетки. Он представляет собой посттрансляционную модификацию ядерных белков, как немедленный ответ клетки на разрушение ДНК, вызванное ионизирующей радиацией, окислением, или мутагенами. Кроме того, поли-АДФ-рибозилирование играет существенную роль в регуляции процессов экспрессии генов и некоторых аспектов репликации ДНК.
Поли-АДФ-рибозилирование включает в себя расщепление НАД и присоединение АДФ-рибозы к акцепторному белку. Присоединение первой АДФ-рибозной молекулы происходит через ковалентную связь с глутаминовой кислотой, аспартатом или лизином модифицируемого белка. Процесс сопровождается высвобождением никотинамида. Последующее присодинение АДФ-рибозных единиц приводит к образованию полимерных цепей, содержащих вплоть до 200 молекул и более с множественными точками ветвления через каждые 20-5 Оповторов. Таким образом, происходит существенная аккумуляция негативного заряда на белке. Интересно, что количество поли-АДФ-рибозы в нормальных, неподверженных разрушающим факторам, клетках относительно низкое (200-250 нг/r сухого веса), сравнивая с избыточным количеством ферментов, отвечающих за поли-АДФ-рибозилирование (от 200000 до 1 миллиона копий на клетку) [D Amours et al., 1999; Kim et al., 2002]. Надо отметить, что активное поли-АДФ-рибозилирование может привести к существенному сокращению пула НАД " [Sims et al., 1983], для ресинтеза одной молекулы которого из АДФ-рибозы и никотинамида требуется четыре молекулы АТФ [Kim et al., 1994], поэтому в нормальных условиях каталитическая активность поли-(АДФ-рибозо)-полимераз ограничена и активируется только в критических ситуациях, для чего необходима тонкая система регуляции. Таким образом, процесс поли-АДФ-рибозилирования включает в себя три этапа: (1) инициацию (присоединение АДФ-рибозы к акцепторному белку), (2) элонгацию и (3) разветвление [Alvarez-Gonzalezеtab, 1 999]. Все три этапа катализируются одним белком, поли-(АДФ-рибозо)-полимеразой (ПАРП). Активность ПАРП обнаружена у организмов, начиная от архебактерий и кончая млекопитающими, за единственно известным исключением в этом ряду в виде дрожжей [Hassa and Hottiger, 2002; Rolli et al., 2002]. На данный момент обнаружено несколько белков, обладающих подобной ферментативной активностью. Наиболее распространенной и изученной ПАРП является PARP1 (116 КДа), ядерный белок, экспрессируемый эукариотическими клетками., PARP1 обладает широким спектром действия, принимая участие в регуляции как репарации ДНК, так и в транскрипции [Kraus and Lis, 2003]. Другим белком, обладающим ПАРП активностью, является танкираза, специализирующаяся на регуляции и поддержании длины теломер [Smith et al., 1998; Cook et al., 2002]. Функции других членов семейства ПАРП разнообразны и значительно менее изучены. PARP1 - очень консервативный белок, особенно в своих функциональных доменах, которые включают (1) ДНК-связывающий домен, (2) домен аутомодификации и (3) каталитический домен. Такая консервативность указывает, что активность PARP1 играет критическую роль в жизни клетки. Каталитическая активность PARP1 зависит от различных факторов и достигает 500-кратного увеличения при связывании фермента с поврежденной ДНК [D Amours et al., 1999]. Было показано, что PARP1 специфично узнает и связывается с одноцепочечными разрывами на ДНК, что приводит к аллостерическим изменениям в структуре белка, и, как результат, к изменению его активности [Ame et al., 2000]. Отсюда и представление о PARP1, как о «клеточном сенсоре разрывов». Однако этот белок принимает также активное участие в жизни клетки и при нормальных физиологических условиях целостности генома. Действительно, PARP1 .связывается с высокой степенью аффинности как с неповрежденными двуцепочечными последовательностями ДНК, так и с другими третичными структурами ДНК. Он также может связываться с двумя спиралями ДНК одновременно [Rolli et al., 2002]. Более того, некоторые неповрежденные линейные и петлеобразные структуры ДНК стимулируют усиление активности PARP1 даже больше, чем поврежденная ДНК [Кип et al., 2002]. В дополнение к непосредственному связыванию с ДНК, энзиматическая активность PARP1 стимулируется также взаимодействием с белками партнерами по связыванию с ДНК [Griesenbeck et al., 1997], среди которых DNA-PK [Ruscetti et al., 1998], p53 [Kumari et al., 1998] и некоторые транскрипционные факторы [D Amours et al., 1999].
Способность PARP1 к связыванию со специфичными белками и участками ДНК зависит от его статуса. В случае целостности клеточного генома, когда нет необходимости в массовых процессах поли-АДФ-рибозилирования, PARP1 является одним из основных акцепторов своей энзиматической активности. Результатом автомодификации может быть ингибирование связывания PARP1 с ДНК, с другими белками, ингибирование АДФ-рибозил-трансферазной активности, и, в конечном счете, инактивация фермента [D Amours et al., 1999].. В дополнение к автомодификации, многие другие ядерные белки могут выступать в качестве акцепторов поли-АДФ-рибозилирования. К примеру, предполагается, что гистоны являются основным объектом модификации [Althaus and Richter, 1987].. Сейчас обнаружено, что и более редкие белки могут быть модифицированы поли-АДФ-рибозилированием. Интересно, что большинство из них непосредственно задействованы в процессах репликации или репарации ДНК (например, ДНК полимеразы, топоизомеразы и другие), или транскрипции (некоторые транскрипционные факторы)..В работах на человеческих клетках была показана роль PARP1 в ингибировании процессов рекомбинации [Schreiber et al., 1995; Meyer et al., 2000]. На основе этих и других примеров можно предположить, что основная функция PARP1 связана с поддержанием постоянства клеточного генома.
Нормальная жизнедеятельность организмов зависит от постоянства их геномов. Очевидно, насколько существенно, чтобы корректная генетическая информация и неповрежденный генетический материал передавались по наследству во время репродукции клетки или организма. Однако ДНК постоянно находится под воздействием разрушающих факторов, как эндогенной природы, так и из внешних источников. В ответ на это в дополнение к нескольким предупредительным механизмам, природой был 1 выработан богатый выбор путей для починки пострадавшего генома. Важным фактором является способность клетки немедленно распознать повреждение и включить систему репарации ДНК как можно быстрее, пока это не привело к еще большим повреждениям. В связи с важностью процесса репарации ДНК, клетка должна использовать для него большую долю своих ресурсов. В таком случае, а также для предотвращения распространения некорректной генетической информации, имеет смысл приостановить жизненные процессы, такие как репликация и транскрипция, до момента окончательной репарации ДНК. На данный момент основные типы репарации ДНК достаточно хорошо изучены [Lindahl and Wood, 1999].
Идентификация теломерных белков, ассоциированных с DS-элементом через взаимодействие cEBNAl
На первом этапе работы была поставлена задача выделить и идентифицировать белки клетки-хозяина, взаимодействующие с oriP и EBNAI. Дня этих целей нами была получена клеточная линия (SL1), происходящая от HeLa клеток и стабильно экспрессирующая белок EBNAlr содержащий эпитоп с гем-агтлютининовой последовательностью (ENBA1-НА). Ядерный экстракт, полученный из SL1 клеток, затем использовали в ДНК-аффинной хроматографии с DS элементом (рис. 1) или с контрольной ДНК похожего размера. Полученный материал, обогащенный белками, взаимодействующими с изучаемой ДНК, использовали во втором цикле ДНК-аффинной хроматографии. Чтобы определить силу взаимодействия белков с ДНК, отмывку и элюцию проводили буферами с разной ионной силой. При элюции буфером, содержащим 300 мМ КС1 с аффинного ДНК матрикса сходили наиболее слабо взаимодействующие белки, а белки, обладающие большей аффинностью к ДНК, были затем элюированны 1000 мМ KCI-буфером. Иммуноблоттинг с антителами против НА эпитопа выявил, что EBNA1 обладает высокой аффинностью к DS элементу, так как присутствует только в 1000 мМ фракции (рис. 2А). EBNAI связывается с DS элементом строго специфично, поскольку взаимодействий с контрольной ДНК отмечено не было. Окраска серебром этого же самого афинно выделенного материала выявила несколько клеточных белков, специфично взаимодействующих с DS элементом, так как они отсутствовали во фракции, выделенной на контрольной ДНК (рис. 2В). Чтобы определить, зависит ли связывание с DS элементом этих клеточных белков от присутствия EBNA1, мы сравнили аффинно выделенные белки из HeLa и SL1 клеток. После двух последующих циклов DS-аффинной хроматографии, 1000 мМ КС1 фракция из SL1 клеток была в несколько сот раз обогащена белком EBNA1, отсутствующим, как и следовало ожидать, в HeLa клетках (рис. ЗА). Окраска серебром этих же фракций показала, что некоторые полипептиды, выделенные из SL1 экстракта, являются EBNA-специфичными, так как не были обнаружены во фракции из HeLa экстракта (рис. ЗВ). Последовательности некоторых наиболее широко представленных полипептидов были определены с помощью жидкостной хроматографии с последующей масс-спектрометрией. Проведенный анализ подтвердил, что 54 КДа полипептид является EBNA1, а 32 КДа полипептид — Tat-ассоциированным белком р32, еще ранее определенным как взаимодействующий с EBNA1 [Van Scoy et al., 2000; Wang et al., 1997]. Интересно, что остальные наиболее обогащенные полипептиды, выделенные из этой фракции, обладают функциями, связанными с поддержанием длины теломер. Самый большой полипептид, р150, был идентифицирован как танкираза, фермент, обладающий АДФ-рибозо-полимеразной активностью, который модифицирует белки TRF1 и TRP2, взаимодействующие с теломерными повторами [Smith et al., 1998], р60 определен как TRF2 [Broccoli et al., 1997], р50 - как ТКР2-взаимодействующий белок RAP1 [Li et al., 2000]. Дополнительно, pi 16 идентифицирован как поли(АДФ-рибозо)полимераза PARPl [D Amours et al., 1999], которая ранее не была ассоциирована с теломерами, но обладает функцией, близкой с взаимодействующей с ними танкиразой. Также было обнаружено несколько меньших форм белка EBNA1, что свидетельствует о некотором его протеолизе, происходящем во время процесса биохимического выделения белков.
Чтобы убедиться? что выделенные полипептиды были правильно идентифицированы, мы подтвердили их тождественность с помощью иммуноблоттинга (рис. 4). К тому же было показано, что танкираза обладала высоким сродством к DS элементу, оказываясь высоко обогащенной во фракциях с высокой ионной силой после DS-аффинной хроматографии. Связывание танкиразы с DS элементом оказалось EBNA1-специфичным и весьма устойчивым, так как наблюдалось только в случаях ядерного экстракта из SL1 клеток, но не контрольных HeLa клеток, и при отмывках 150 мМ и 300 мМ КС1. TRF2 также был обогащен в DS-аффинных фракциях, полученных из SL1 клеток, хотя связывание происходило и в контрольных HeLa клетках в условиях низкой соли. PARP1 одинаково хорошо связывался с DS элементом как в составе экстракта, выделенного из HeLa, так и из SL1 клеток. По всей вероятности, взаимодействие PARP1 с DS элементом в большей степени зависит от присутствия EBNA1 во втором цикле ДНК-аффинной хроматографии, по сравнению с другими DS—ассоциированными белками. Как и следовало ожидать, белок EBNA1 присутствовал во фракциях, полученных исключительно из SL1 экстракта (рис. 4А).
ДНК-специфичное связывание белков было подтверждено иммуноблоттингом, сравнивая DS- и контрольные аффинно выделенные белки (рис. 4В). Танкираза, PARP1, TRF2 и EBNA1 связываются исключительно с DS элементом,, что указывает на специфичность их взаимодействий с DS элементом.
Стимуляция образования TFIIA-TBP-ДНК комплекса в результате фосфорилирования Toal
Известно, что посттрансляционные модификации широко используются и играют важную роль в регуляции многих жизненных процессов у эукариот. Чтобы выяснить, имеют ли эти модификации такое же первостепенное значение в более просто организованных живых системах, мы исследовали некоторые аспекты инициации репликации и транскрипции на предмет изучения роли посттрансляционных модификаций в регуляции этих процессов. В качестве моделей мы использовали вирус Эпстайна-Барр и дрожжи Saccharomyces cerevisiae.
Вирус Эпстайна-Барр устанавливает латентную инфекцию в В-лимфоцитах человека. Геном ВЭБ существует в виде кольцевой внехромосомной эписомы. Область ДНК, ответственная за репликацию эписомы (oriP) состоит из двух участков: FR элемента и DS элемента. DS элемент является сайтом инициации репликации вирусного генома [Gahn and Schildkraut, 1989]. FR элемент необходим для поддержания стабильного количества копий вирусного генома в клетке-хозяине [Aiyar et al., 1998; Sugden and Leight, 2001]. Репликация и поддержание стабильности генома ВЭБ зависят от вирусного белка EBNA1. EBNA1 является единственным белком, кодируемым вирусом в его латентной форме. Поскольку EBNA1 не обладает активностями, необходимыми для инициации репликации ДНК и поддержания вирусной стабильности, то вполне очевидно, что вирусу необходимо использовать клеточные белки хозяина для репликации вирусной ДНК. EBNA1 находится в постоянно связанном состоянии с FR и DS элементами, что является необходимым условием для поддержания стабильной латентной инфекции.
Таким образом, активность EBNA1 должна каким-то образом регулироваться. Посттрансляционные модификации являются, пожалуй, самым быстрым и эффективным способом модулировать активности белков. Потому можно было ожидать, что EBNA1 также может подвергаться таким модификациям. Соответственно гипотетический белок-фермент, модифицирующий EBNA1, может либо непосредственно взаимодействовать с EBNA1, либо образовывать дополнительный контакт с ДНК рядом с EBNA1-связывающим сайтом.
В своей работе мы использовали оригинальный, разработанный нами самими метод выделения клеточных белков, чьё взаимодействие с DS элементом зависит от присутствия EBNA1. Таким образом, нами было выделено несколько белков, многие из них связаны с функцией регулирования длины теломер. Это белки TRF2, танкираза, Rapl, а также PARP1 - поли(АДФ-рибозо)полимераза, близкая по функциям с танкиразой.
"Такие результаты являются вполне объяснимыми, т.к. DS элемент вируса Эпстайна-Барр содержит в своем составе три нонамерных повтора, чьи последовательности аналогичны теломерным последовательностям, являющимися сайтами связывания TRF2 на теломерах. Известно, что Rapl и танкираза взаимодействуют с TRF2 на теломерах, при этом танкираза посттрансляционно модифицирует его, тем самым модулируя его функции. Мы же показали, что TRF2 и танкираза взаимодействуют с эписомальным oriP in vivo, подтвердив in vitro результаты.
Относительно TRF2 мы показали, что он связывается с DS элементом кооперативно с EBNA1. Это выражается в том, что, с одной стороны, он связывается с DS элементом только в присутствии EBNA1, с другой стороны, он одновременно усиливает взаимодействие EBNA1 с ДНК. Мы также экспериментально подтвердили, что сайтами связывания TRF2 являются нонамерные повторы, расположенные на DS элементе между сайтами связывания EBNA1. Более того, наши данные показали, что взаимодействие EBNA1 с DS элементом вызывает изменения в ДНК нонамер. Ранее было обнаружено, что EBNA1 нарушает ДНК oriP и вызывает образование одноцепочных участков на EBNA1-связывающих сайтах DS элемента [Frappier and O Donneil, 1991]. Исходя из вышесказанного можно предположить, что вызванные EBNA1 конформационные изменения на DS элементе способствуют связыванию TRF2 с нонамерами.
Разные авторы, используя различные подходы, показали, что нонамерные повторы играют важную роль в поддержании функций oriP, таких как репликация и поддержание стабильности вирусного генома. Так, например, было отмечено, что в зависимости от клеточного цикла происходят изменения в нуклеотидах в области всех трех нонамерных сайтов что дает основание предполагать образование, зависимое от клеточного цикла, нуклеопротеинового комплекса на этих сайтах in vitro [Niller et al.,. 1995]. Генетический анализ нонамер дал противоречивые результаты. Согласно одному исследованию, делеция сайтов а и с приводила к ослаблению репликации вирусной ДНК в клетках Raji [Koons et al., 2001], в то время как в другом исследовании, сайт-направленный мутагенез всех трех нонамеров не оказывал эффекта на репликацию в НЕК293 клетках [Yates et al., 2000]., Нами было обнаружено, что сверхэкспрессия белков TRF1 и доминантно-негативного TRF2, конкурирующих с TRF2 за сайты связывания с ДНК, приводила к ингибированию репликации. Этот факт дает основание предполагать, что взаимодействующие с нонамерами белки модулируют репликационные функции ЭБ вируса в определенных типах клеток, хотя, возможно они не являются строго необходимыми для минимальной реплекационной функции. Поскольку TRF2 связывается с DS элементом кооперативно с EBNA1, мы предполагаем, что TRF2 может способствовать образованию комплекса EBNA1 с другими белками, особенно в тех типах клеток, где концентрация белка EBNA1 понижена или ослаблена его способность к связыванию. Согласно другому сценарию, TRF2 может способствовать формированию репликационного комплекса на oriP и инициации синтеза ДНК на нонамерных сайтах. Известно, что TRF2 обладает способностью усиливать разъединение цепей на теломерной t-петле [Stansel et al., 2001], и подобная активность может содействовать репликационным функциям и на oriP.
Ранее было замечено [Niller et al., 1995; Yates et al.r 2000], и мы подтвердили это наблюдение, что нонамеры играют определенную роль в поддержании стабильности вирусного генома. Несколько пассивных механизмов было предложено для описания функции комплекса EBNA1-огІР в этом процессе.. Весьма вероятно, что нонамер-связывающие белки также участвуют в этих механизмах. Известно, что индуцированное EBNA1 формирование петли ДНК между DS и FR элементами коррелирует с функциями репликации ДНК и поддержания стабильности вирусных эписом [Frappier and O Donnell, 1991; Middleton and Sugden, 1992; Su et al., 1991]. Связывающиеся с нонамерами белки могут способствовать образованию и стабилизировать вторичную структуру oriP, С другой стороны, EBNA1 также может связываться с метафазными хромосомами; в этой связи другими авторами показано, что искусственное присоединение EBNA1 к гистону HI и HMG-белкам может поддерживать постоянство вирусных эписом [Hung et al., 2001]. Ассоциация ВЭБ с ядерным матриксом также может вносить свой вклад в этот процесс [Jankelevich et al., 1992]. Известно, что человеческие теломеры ассоциируются с ядерным матриксом, и вероятно благодаря PARP1 [Galande et al., 1999].. Поэтому весьма вероятно, что TRP2 и другие теломерные белки могут содействовать ассоциации EBNA1 с определенными хроматиновыми структурами, что в свою очередь может способствовать удерживанию вирусных эписом на митотических хромасомах во время их конденсации и, таким образом, передаче постоянного числа копий вирусного генома от материнской клетки к дочерним.
