Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА1. Обзор литературы 10
1.1. Физиолого-биохимические особенности жизнедеятельности микроорганизмов родов Beggiatoa, Leucothrix, Vulcanithermus 10
1.1.1. Разнообразие типов метаболизма бактерий 10
1.1.2. Органотрофный и литотрофный рост бактерий рода Beggiatoa 11
1.1.3. Эколого-биохимическая характеристика рода Leucothrix 12
1.1.4. Особенности метаболизма термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus 14
1.2. Трансформация метаболизма бактерий в различных условияхвнешней среды 15
1.2.1. Влияние химического состава среды 16
1.2.1.1. Роль серных соединений 17
1.2.2. Действие физических факторов 18
1.2.2.1. Влияние кислорода 18
1.2.2.2. Значение давления 19
1.2.2.3. Влияние температуры 20
1.2.3. Адаптивные изменения ферментных систем 22
1.3. Физико-химические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы 24
1.3.1. Способы получения высокоочищенных препаратов МДГ 24
1.3.2. Общая характеристика каталитического действия 26
1.3.3. Кинетические параметры 27
1.3.4. Влияние концентрации ионов водорода 29
1.3.5. Влияние интермедиатов и ионов 30
1.3.6. Аллостерическая регуляция 33
1.4. Различные уровни организации МДГ 36
1.5. Влияние температуры на активность фермента 45
1.5.1. Температурный оптимум 45
1.5.2. Термостабильность малатдегидрогеназы 46
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 54
2.1. Цель и задачи исследования 54
2.2. Объекты и методы исследования 55
2.2.1. Объекты исследования 55
2.2.2. Методы исследования ^ 55
2.2.2.1. Состав питательных сред для культивирования микроорганизмов 55
2.2.2.2. Определение активности фермента 56
2.2.2.3. Определение количества белка 57
2.2.2.4. Выделение и очистка малатдегидрогеназы 57
2.2.2.5. Электрофоретические исследования 59
2.2.2.5.1. Аналитический электрофорез 59
2.2.2.5.2. Определение гомогенности ферментных препаратов 59
2.2.2.5.3. Специфическое проявление малатдегидрогеназы 60
2.2.2.5.4. Определение молекулярной массы субъединиц МДГ 61
2.2.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента 61
2.2.2.7. Ингибиторный анализ 62
2.2.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности активности ферментов 62
2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных 63
2.3. Полученные результаты и их обсуждение 65
2.3.1. Получение гомогенных препаратов МДГ из бактерий родов Beggiatoa, Leucothrix, Vulcanithermus 65
2.3.1.1. Очистка малатдегидрогеназы 65
2.3.1.2. Определение гомогенности ферментных препаратов 71
2.3.2. Четвертичная структура малатдегидрогеназы из изучаемых бактерий 75
2.3.2.1. Определение молекулярной массы нативного фермента 75
2.3.2.2. Молекулярная масса субъединиц МДГ 76
2.3.3. Кинетические и регуляторные характеристики МДГ 81
2.3.3.1. Влияние концентрации ионов водорода 81
2.3.3.2. Определение константы Михаэлиса 84
2.3.3.3. Кооперативные свойства тетрамерной формы малатдегидрогеназы из Beggiatoa leptomitiformis Д-402 90
2.3.3.4. Определение константы субстратного ингибирования 92
2.3.3.5. Влияние интермедиатов и ионов на активность МДГ 94
2.3.4. Изменение субъединичной структуры малатдегидрогеназы у бактерий в различных условиях культивирования 96
2.3.4.1. Четвертичная структура МДГ из Beggiatoa leptomitiformis в условиях разного типа питания 96
2.3.4.2. Влияние типа питания на четвертичную структуру МДГ из бактерий Leucothrix mucor 103
2.3.4.3. Влияние ротенона и итаконата на соотношение димерной и тетрамерной форм МДГ 106
2.3.4.4. Механизм структурных изменений малатдегидрогеназы при воздействии тиосульфата 108
2.3.4.5. Хранение димерных и тетрамерных форм МДГ в присутствии стабилизирующих веществ 108
2.3.4.5. Влияние температуры 112
2.3.4.5.1. Температурный оптимум 112
2.3.4.5.2.Термостабильность 114
Заключение 118
Выводы 122
Список использованных источников 125
- Эколого-биохимическая характеристика рода Leucothrix
- Различные уровни организации МДГ
- Определение константы субстратного ингибирования
- Влияние типа питания на четвертичную структуру МДГ из бактерий Leucothrix mucor
Введение к работе
Актуальность проблемы. Молекулярные основы адаптации организмов к выживанию в экстремальных условиях среды определяются образованием внутри клетки ферментных систем, устойчивых к их воздействию и поддерживающих протекание важнейших метаболических процессов. При адаптации клеточного метаболизма к изменениям условий внешней среды организм использует стратегию регуляции активности ферментного аппарата клетки. Важная роль в осуществлении адаптивной реакции принадлежит малатдегидрогеназной системе, представленной в клетках эукариот различно локализованными изоферментами (Епринцев, Игамбердиев, 1995; Епринцев и др., 1996). Поскольку для бактерий, отличающихся большой вариабельностью метаболических потоков, изоферментный полиморфизм не характерен, участие малатдегидрогеназы (МДГ) в разных метаболических процессах может обеспечиваться перестройкой субъединичной структуры молекулы, определяющей функциональную роль фермента (Степанова и др., 2000; Епринцев и др., 2002). МДГ (КФ 1.1.1.37.), являясь полифункциональным ферментным комплексом, обеспечивает протекание конструктивного и энергетического метаболизма (Gietl, 1992). Известно, что в клетках бактерий встречаются как димерные (Charnock et. ah, 1992; Labrou, Clonis, 1997), так и тетрамерные формы этого фермента (Wynne et. al., 1996; Madern, Zaccai, 2004). У фототрофных aHa3po6oB(Riiodobacter capsulatusjlhodospirillum і rubrum) МДГ, функционирующая преимущественно в конструктивном обмене, имеет тетрамерное строение. У аэробных микроорганизмов с органотрофным типом питания (Paracoccus denitrificans, Pseudomonas stutzeri) фермент является димером и участвует в протекании конструктивного и энергетического метаболизма.
В ряде работ (Rolstad et al., 1988; Irimia et. al., 2004) показано, что не только тип питания может влиять на структуру и свойства МДГ. Важным
фактором, регулирующим активность малатдегидрогеназной системы путём изменения изоферментного состава или каталитической эффективности её белков, является температура. Изменения четвертичной структуры МДГ обнаружены у термофильной зеленой серной бактерии Chloroflcxus aurantiacus. Тетрамерная форма фермента из этих микроорганизмов обладает функциональной активностью только при 55С. Снижение температуры приводит к распаду МДГ на неактивные димеры и тримеры. Следовательно, структурные перестройки молекулы малатдегидрогеназы являются важнейшим регуляторным механизмом, обеспечивающим адаптивную реакцию к высокой температуре.
Изучение особенностей структуры и свойств МДГ у бесцветных серобактерий Beggiatoa leptomitiformis и Leucothrix mucor и термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus представляет определённый интерес. Бактерии родов Beggiatoa и Leucothrix, в зависимости от наличия в среде культивирования восстановленных соединений серы, и, в частности, тиосульфата, могут изменять тип метаболизма и расти как хемоорганогетерогрофно, так и хемолитогетеротрофно, используя в качестве источника энергии органические или неорганические доноры электронов. V. medioatlanticus, являясь термофильными организмами, растут при экстремальных температурах, значительно превышающих оптимальную температуру роста мезофильных бактерий В. leptomitiformis и L. mucor.
В связи с этим интересно исследование роли структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов, отличающихся не только типом питания, но и отношением к температуре.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы у микроорганизмов разных экологических групп. Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:
выделить и получить в электрофоретически гомогенном состоянии препараты МДГ из исследуемых бактерий;
изучить на высокоочищенных ферментных препаратах физико-химические, каталитические и регуляторные свойства м ал атдеги дроге наэы;
исследовать четвертичную структуру МДГ из серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402 и Leucothrix mucor DSM 2157 в условиях органо-, пито- и миксотрофного культивирования;
изучить субъединичное строение малатдегидрогеназы из термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus, культивируемых при разной температуре;
методом ингибиторного анализа выявить функциональную роль димерной и тетрамерной изоформ МДГ у Beggiatoa leptomitiformis Д-402 в условиях разного типа питания;
исследовать в модельных опытах воздействие тиосульфата на структуру очищенного препарата фермента;
изучить влияние температуры на скорость ферментативной реакции и термостабильность МДГ.
Научная новизна. Получение гомогенных препаратов малатдегидрогеназы из микроорганизмов, принадлежащих к разным экологическим группам, позволило показать функциональную роль тетрамерной и димерной изоформ МДГ в метаболизме бесцветных серобактерий родов Beggiatoa и Leucothrix. В условиях органотрофного роста у бактерий функционирует димерная форма МДГ, участвующая в работе цикла Кребса. При литотрофном культивировании МДГ представляет собой тетрамер, обеспечивающий протекание глиоксилатного цикла (ГЦ). Установлена динамика перехода тетрамера в димер при миксотрофном росте, обусловленная скоростью окисления тиосульфата. Выявлена важная структурная особенность являющейся термоэнзимом димерной МДГ из термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus - большая
молекулярная масса субъелиниц (58 кДа), обеспечивающая, по-видимому, повышенную жесткость структуры фермента (энергия активации 32,6 кДж/моль), необходимую для его функционирования в экстремальном температурном режиме. Показана важная роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к действию различных факторов внешней среды.
Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы помогают глубже понять современные представления о механизмах переключения метаболических потоков при разных условиях культивирования микроорганизмов. Практическая значимость настоящей работы состоит в расширении и углублении знаний о роли структурно-функциональных изменений МДГ в механизмах адаптации к изменяющимся факторам внешней среды. Полученные гомогенные препараты малатдегидрогеназы могут быть использованы в научно-исследовательских работах, связанных с изучением ферментативной кинетики, четвертичной структуры фермента, термодинамических параметров реакций, катализируемых МДГ. Выделение из термофильных организмов ферментов, отличающихся высокой термостабильностью, может иметь большое значение для биотехнологии, химической промышленности. Прикладные аспекты изучения бесцветных серобактерий определяются их использованием для удаления токсичных соединений серы из
промышленных и бытовых сточных вод, воздушной среды производственных помещений и других объектов.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, в спецкурсах по энзимологии, биохимическим механизмам адаптации прокариот, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Ам роби una работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских
конференциях. Они были представлены на восьмой международной конференции по химии и физикохимии олигомеров "Олигомеры - 2002" (Москва — Черноголовка, 2002); межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2002, 2003, 2004); 6-ой Путинской конференции молодых учёных "Биология - наука 21-ого века" (Пущино, 2002); второй межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); ежегодных научных сессиях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2002, 2003, 2004).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях - 7 статьях и 5 тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (248 источников). Иллюстрационный материал включает 35 рисунков и 10 таблиц.
Эколого-биохимическая характеристика рода Leucothrix
Микроорганизмы, как и все живые существа, способны проявлять активную жизнедеятельность только в определённых температурных границах. Большинство известных видов бактерий относится к мезофилам, у которых оптимальные температуры роста находятся в пределах между 30 и 40С. Вместе с тем, разнообразие прокариот, существующих при высоких или относительно высоких температурах, достаточно велико. Способность расти при температурах от 50 до 70С, свойственная представителям термотолерантных, факультативных и облигатных термофилов, не связана с осуществлением ими какого-либо одного специфического типа метаболизма. Среди термофильных бактерий найдены фотосинтезирующие, хемолитотрофные и хемогетеротрофные организмы. Есть среди них облигатные аэробы и анаэробы (Грабовим и др., 2002; Mirandaello et al., 2003; Takai et al., 2003; Takai et al., 2004). Термофилы, верхний предел роста которых ограничен 70С, в целом структурно напоминают своих мезофильных аналогов и по типам осуществляемого ими конструктивного и энергетического метаболизма относятся к тем же группам, что и мезофильные виды. По мере повышения температуры число видов, способных к росту, быстро уменьшается.
Бактерии рода Vulcanithermus — V. medioatlanticus — в отличие от мезофильных бактерий Beggiatoa leptomitiformis и Leucothrix mucor являются термофильными организмами. V. medioatlanticus штамм DSM 14978х были выделены из глубоководных гидротермальных источников. Они способны расти аэробно и анаэробно в интервале температур 37 - 80 С с оптимумом 70С и рН 5,5 — 8,4 с оптимумом 6,7. Для роста этим микроорганизмам необходим NaCl (от 10 до 50 г/л ). V. medioatlanticus растёт хемоорганогстеротрофно в среде, содержащей белковые субстраты (триптон, дрожжевой экстракт, пептон), органические кислоты (ацетат, сукцинат. фумарат) и спирты, используя кислород или нитрат в качестве акцептора электронов. Они также способны осуществлять л и то гетеротрофный метаболизм, используя водород как источник энергии и нитрат или кислород как акцептор электронов. Другие акцепторы электронов, такие как сульфат, тиосульфат, элементная сера, нитрит, не поддерживают рост этих бактерий ( Miroshnichenko at al., 2002 ).
Внешняя среда оказывает влияние на все процессы жизнедеятельности организмов. Бактерии значительно больше зависят от условий окружающей среды, чем высшие растения и животные, что связано с их малым объёмом при относительно большой поверхности. Отношение микроорганизмов к факторам внешней среды чрезвычайно разнообразно. Отдельные виды приспособились к жизни в экстремальных условиях: при высокой и низкой температуре, в концентрированных растворах солей, при высоких давлениях), в кислой (рН 1 и ниже) и щелочной (рН 11 и выше) среде (Vossenberg et. al., 1998; Takami et. al., 1999; Kato, Takai, 2000; Nies, 2000; Banciu et al., 2004; Jolivet et al., 2004; Lauro et al., 2004; Wiegel, Kevbrin, 2004). Все метаболические процессы у этих организмов обеспечиваются ферментами и белками, которые оптимально функционируют в таких экстремальных условиях.
Метаболизм прокариот, как энергетический, так и конструктивный, отличается большим разнообразием, которое является результатом способности бактерий использовать в качестве источников энергии и исходных субстратов для построения веществ тела самый широкий набор органических и неорганических соединений.
Бактерии, как и другие организмы, нуждаются для своего роста в определённых питательных веществах. В состав таких питательных веществ должны входить все те химические элементы, которые необходимы для построения клеточного материала. Углерод, кислород, водород и азот -основные компоненты органических соединений, содержащихся в тканях различных организмов. Сера требуется для синтеза аминокислот цистеина и метионина и некоторых коферментов. Фосфор входит в состав нуклеиновых кислот, фосфолипидов, нуклеотидов. Более 16 металлов в виде микроэлементов играют важную роль в процессе роста и метаболизма микроорганизмов, они необходимы для биосинтеза ряда ферментов (Задворный и др., 2000).
В конструктивном метаболизме бактерий основная роль принадлежит углероду, поскольку все соединения, из которых построены живые организмы, - это соединения углерода. Прокариоты способны воздействовать на любое известное углеродное соединение, т.е. использовать его в своём метаболизме. В зависимости от источника углерода для конструктивного обмена все прокариоты делятся на автотрофов, способных синтезировать все компоненты клетки из углекислоты, и гетеротрофов, источником углерода для метаболизма которых служат органические соединения. Водород, кислород и азот могут использоваться бактериями D форме органических и неорганических соединений. Нитрат, прежде чем включиться в органические соединения, должен быть восстановлен до аммиака. Предпочтительным источником азота служит аммиак, который может использоваться практически всеми микроорганизмами. Металлы могут использоваться в форме катионов неорганических солей. Некоторые из них (магний, кальций, калий, железо) нужны в достаточно высоких концентрациях, потребность в других (цинк, марганец, натрий, молибден, медь) невелика (Готтшалк, 1982; Balkwill et al., 2004). Так, например. галофильным бактериям требуются высокие концентрации хлористого натрия (Yoon et al., 2004). Однако эти организмы составляют исключение. У большинства микроорганизмов потребность в ионах натрия и хлора мала. Молибден протеиды играют важную роль в азотном обмене и в окислении формиата. Кобальт требуется всем тем микроорганизмам, у которых протекают реакции, зависимые от витамина В . В некоторых редких случаях микроорганизмам требуются вольфрам и никель. Изменение концентрации микроэлементов, и в частности ионов металлов, в среде может оказывать существенное влияние на метаболизм микроорганизмов, поскольку они являются интегральными компонентами многих ферментов и белков (Ильченко и др., 1994).
Различные уровни организации МДГ
Все белки являются многофункциональными структурами, так как их специфическая аминокислотная последовательность одновременно определяет самоорганизацию линейной полипептидной цепи с образованием уникальной трёхмерной структуры, а также специфические функции и их регуляцию (Попов, 1992; Jaenicke, 1998). Следовательно, изучение аминокислотного состава и четвертичной структуры ферментов является одним из ключевых аспектов исследования механизмов регуляции их активности.
Главные отличия в аминокислотном составе малатдегидрогеназы из разных объектов заключаются в количественном содержании и в процентной доле отдельных аминокислот. Так, фермент из термофильных зелёных несерных бактерий Chloroflexus aurantiacus характеризуется достаточно высоким содержанием аланина, глутамата, глицина, лейцина, аспартата, валина; и несколько меньшим — лизина, изолейцина, треонина, пролина и серина, при этом N-концевая последовательность отличается повышенным содержанием гидрофобных аминокислот — аланина, изолейцина, валина и лейцина. Цистеин обнаруживается в следовых количествах, триптофан -вблизи N-концевой последовательности (Rolstad et. ah, 1988).
Содержание этих аминокислотных остатков в МДГ из других источников также невелико. Например, молекула фермента из Nitzschia alba (Yueh et. ah, 1989) содержит маленькое количество цистеина, метионина и триптофана, но много остатков глицина, аланина, валина, лизина, лейцина. Следовые количества цистеина встречаются в МДГ из несерных пурпурных фототрофных бактерий (Tayeh, Madigan, 1988). Кроме того, тетрамерная малатдегидрогеназа из этих бактерий (Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus, Rhodomicrobium vanniellii) характеризуется необычно высоким содержанием глицина в отличие от димерной МДГ из Rhodocyclus purpurcus. В целом аминокислотный состав тетрамерных форм МДГ из несерных пурпурных бактерий сходен, однако значительно отличается от аминокислотного состава тетрамерных ферментов из других м и кроорган измов.
МДГ из психрофильной бактерии Aquaspirillum arcticum состоит из 329 аминокислот и их последовательность сходна с последовательностью МДГ из Thermus flavus. Сравнение аминокислотного состава показывает, что МДГ из Aquaspirillum arcticum характеризуется значительно меньшим содержанием глутаминовой кислоты и аргинина по сравнению с Thermus flavus. Количество других заряженных остатков сходно в двух ферментах. Число остатков глицина, пролина, а также гидрофобных ароматических аминокислот одинаково в молекулах МДГ из обоих источников; незначительные различия наблюдаются в содержании изолеицина, валина и лейцина (Kim et. al., 1999).
В состав митохондриальной и глиоксисомальной МДГ из эндосперма клещевины входит одинаковый набор аминокислот. Однако в молекулах глиоксисомального фермента содержится больше аспарагиновой кислоты, серина и валина, а в молекулах митохондриального - больше лизина, треонина, глицина, цистеина, изолеицина и фенилаланина. Такие аминокислоты, как гистндин, аргинин, глутамат, пролин, аланин и тирозин обладают большим постоянством в составе митохондриальной и глиоксисомальной форм МДГ (Пинейру и др., 1991).
Изоформы МДГ из клещевины различаются между собой также по содержанию высокогидрофильных и высокогидрофобных аминокислот, которые входят в состав их молекул. В митохондриальной МДГ преобладают высокогидрофильные аминокислоты - 37 %, высокогидрофобные остатки составляют 16,1% от общего количества аминокислот, 46,6% аминокислот обладают промежуточными свойствами. В молекулах глиоксисомальной МДГ содержание высокогидрофильных, высокогидрофобных и промежуточных аминокислот составляет, соответственно, 35,9; 14,9 и 49,2%. В отличие от этих белков в составе МДГ из Escherichia coli содержится 38,8; 38,8 и 28,4% высокогидрофильных, промежуточных и высокогидрофобных аминокислотных остатков. А в молекуле МДГ из Sulfolobus acidophilum присутствуют соответственно 30,2; 33,0; 36,8 % из этих групп аминокислот. Таким образом, аминокислотный состав МДГ из различных источников определяется видовыми признаками организма и зависит от условий внутриклеточной среды, образа жизни и места обитания. При исследовании структуры и аминокислотного состава изоферментов МДГ из разных источников была обнаружена большая консервативность и гомологичность N-концевых участков митохондриальных белков арбуза, сердца свиньи и дрожжей с N-концом фермента из Escherichia coli (McAIister-Henn et. al., 1987) и Nitzschia alba (Yueh et. al., 1989). N-концевая последовательность бактериальных малатдегидрогеназ нз шести штаммов Actinomycetales включает ряд аминокислот, которые присутствуют и в МДГ из Thermus flavus, а также в цитоплазматическом ферменте млекопитающих (Rommel et. al., 1989). В N-концевых последовательностях МДГ из Chloroflexus aurantiacus, Escherichia coli и Thermus flavus наблюдается высокая степень сходства функционально похожих аминокислотных остатков (гидрофобных, гидрофильных, ароматических) (Rolstad et. al., 1988). В то же время первичная структура МДГ из термофильной архсбактсрии Methanothcrmus fcrvidus сильно отличается от структуры других бактериальных и эукариотических ферментов. Степень сходства аминокислотных последовательностей ниже, чем между МДГ и ЛДГ (Нопка etal., 1990).
Определение константы субстратного ингибирования
Чувствительность к температуре является одним из важнейших свойств белков. Температура играет важную роль в регуляции активности ферментативных систем внутри клетки, от неё зависят скорость биохимических превращений и состояние равновесия между молекулами фермента и фермент-субстратным комплексом. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции может быть обусловлено действием ряда различных факторов. Она влияет на стабильность фермента; на скорость распада фермент-субстратного комплекса; на сродство фермента к субстрату; на величину рН-функций одного или всех компонентов; на сродство фермента к активаторам и ингибиторам (Диксон, Уэбб, 1982; Клячко и др., 1993).
Температурные оптимумы МДГ из разных источников различны, но обычно лежат в пределах температур 30 - 60С. Так, температурный оптимум цитоплазматической МДГ из щитка кукурузы равен 50С. При повышении температуры среды до 60С наблюдается потеря 50 % от максимальной активности МДГ, а при 70С белок полностью инактивируется в результате денатурации его структуры. Температурные оптимумы митохондриальиои МДГ из эндосперма клещевины для реакций окисления малата и восстановления оксалоацетата составляют, соответственно, 40С и 50С (Пинейру и др., 1991).
Оптимум температуры для двух малатдегидрогеназ из дрожжей Candida sp. N-16 равен 50С для димерной и и 60С - для тетрамерной изоформ (Yoshikawa et. al., 2001). Однако ферменты термофильных организмов отличаются повышенной термостабильностью и термофильностью, т. е., наиболее активны при высоких температурах. Их температурный оптимум превышает 60С. Показано, что такие термоэнзимы, клонированные и экспрессированныс в мезофильных бактериях, сохраняют свои необычные термофильные свойства, подтверждая тем самым свою генетическую детерминированность (Vieille et. al., 1996). Возможным объяснением более низкой активности термофильных ферментов при комнатной температуре может быть их повышенная конформационная жесткость, необходимая для стабилизации белка и защиты от тепловой денатурации (Zavodszky et. al., 1998). Т. о., способность термоэнзима функционировать при повышенных температурах, по-видимому, связана со структурной устойчивостью, выражающейся в ограничении подвижности (гибкости) этого белка (Scandurra et. al., 1998). Термостабильность белков обычно коррелирует с температурой среды обитания (Александров, 1985; Smith, Sundaram, 1988; Hecht et. al-, 1989; Jaenicke, 1991), хотя их функциональная активность может модифицироваться относительно кратковременными температурными воздействиями (Хочачка, Сомеро, 1977; Клячко и др., 1993). С повышением температуры скорость инактивации ферментов в растворе быстро возрастает. Почти во всех случаях инактивация наступает при температуре около 70С. Число ферментов, устойчивых при высоких температурах, исключительно мало. Однако известно, что некоторые термофильные бактерии содержат ферменты, отличающиеся необычайно высокой термостабильностью. Изменение термостабильности белков определяется, с одной стороны, заменами аминокислот, как показано для некоторых ферментов (Argos et. al., 1979; Matthews et al., 1987; Goward et. al., 1994; Клячко и др., 1995; Федорчук и др., 2002), а с другой, - взаимодействием белков со стабилизирующими факторами (катионами, коферментами, мембранами, пептидами) (Risse et. al., 1992; Jaenicke eL al., 1996; Nateiblad cL al., 1996; Даниленко и др., 1998; Jaenicke, 1998; Персиков и др., 1999). Так, сравнительный анализ структуры белков из мезофильных и термофильных мигроорганизмов показал, что в ферментах с повышенной термостабильностью очень часто в а-спиральных участках вместо остатка лизина расположен остаток аргинина (Menendez-Arias,Argos, 1989). При анализе белков термофильных бактерий было установлено» что они необычайно устойчивы к тепловой денатурации. Некоторые белки этих бактерий in vitro выдерживают длительное нагревание при температуре около 90 С. Белки мезофильных бактерий денатурируют при температурах, физиологических для термофилов (Хочачка, Сомеро, 1988). Малатдегидрогеназа является хорошей моделью для исследования повышенной стабильности, так как она принадлежит к группе белков, включающих ферменты как из мезофильных, так и из термофильных организмов. Более того, МДГ является олигомерным белком и, г. о., позволяет исследовать процессы диссоциации, которые могут быть ключевыми для инактивации (Staniforth et. al., 1994). Как известно, механизмы инактивации ферментов и других белков могут быть связаны с их агрегацией, конформационными изменениями макромолекул, расщеплением S-S-связей, тиолдисульфидным обменом и изменениями в первичной структуре при химической модификации функциональных групп. Кроме указанных причин для субъединичных ферментов характерна термическая диссоциативная инактивация, связанная с распадом белка на мономерные единицы (Mariana et al., 1990). Интерес при изучении инактивации МДГ обусловлен ее четвертичной структурой, нарушение которой приводит к потере каталитических свойств этого биокатализатора (Маркина и др., 1985; Метелица, Еремин, 1987). Исследование термостабильности малатдегидрогеназы из Mycobacterium phlei показало, что фермент сохраняет полную активность при температурах до 55 С в течение 15 мин (Tyagi et ah, 1977). МДГ, выделенную из термофильных бактерий Bacillus species инкубировали при 60С в течение различных периодов времени, затем охлаждали во льду 20 мин и измеряли активность при 30С. Было установлено, что после инкубации при 60С в течение 1ч фермент сохранял более 50 % своей активности. В аналогичном эксперименте МДГ, выделенная из Е. coli, сохраняла менее 1 % первоначальной активности (Wynne et. al., 1996). Цитоплазматическая форма МДГ из Echinococcus granulosus теряла около 90% от начальной активности при 65С в течение двух минут (Vessal, Tabei. 1996). Инкубация МДГ из Nitzshia alba при 35С и 45С в течение 10 мин приводила к потере 57 % и 97% активности, соответственно (Yuen et. al., 1989).
МДГ из экстремального термофила Bacillus candolyticus стабильна при 4 ГС и более низких температурах. В интервале температур 51-59С почти сразу наблюдалось снижение активности на 20%, но дальнейшей инактивации не происходит в течение 60 мин инкубации. При 59С фермент терял 50% начальной активности за 38 сек. Также показано, что высокая концентрация НАДН стабилизирует фермент при этой температуре (Kristjansson, Ponnamperuma, 1980).
Влияние типа питания на четвертичную структуру МДГ из бактерий Leucothrix mucor
Внесение новых дополнительных порций тиосульфата в среду культивирования индуцирует быструю перестройку структуры МДГ и функционирование в бактериях только тетрамерной формы фермента.
Интересно отметить, что у другого вида серобактерий обнаружены некоторые особенности функционирования МДГ при миксотрофном культивировании. У L. mucor, которые в отличие от В. leptomitiformis используют соединения серы лишь при низкой концентрации органических веществ (Grabovich et. al., 1999), при миксотрофном росте показано преобладание гомодимера МДГ, что подтверждает наличие универсального механизма (взаимопревращение изоформ данного фермента) при адаптации серобактерий к изменению типа питания.
Следовательно, тиосульфат служит фактором, регулирующим соотношение димерной и тетрамерной изоформ малатдегидрогеназы у микроорганизмов данной экологической группы.
В определенной степени об этом свидетельствуют результаты исследований прямого аіияния тиосульфата на гомогенный препарат МДГ. С помощью гель-хроматографии установлено, что Na2S203, соответствующий его концентрации в среде культивирования, индуцирует структурные изменения молекулы и превращение димерной формы МДГ в тетрамерную.
Выявлены различия в кинетических и регуляторных характеристиках димерной и тетрамерной изоформ МДГ из серобактерий, что подтверждает их участие в разных метаболических процессах. Особый интерес представляет высокая устойчивость тетрамера МДГ к цитрату, ингибирующему димерную форму фермента.
При изучении структурной организации фермента из термофильных бактерий, характеризующихся значительно большей устойчивостью к температуре, чем серобактерии, установлено, что МДГ из Vulcanithermus medioatlanticus представляет собой димер, важной особенностью которого являются "тяжелые" субъединицы (Mr = 58 к Да), обеспечивающие, по-видимому, жесткость структуры фермента (Vogt et. al., 1997). Повышенная жесткость молекулы, проявляющаяся в более высокой энергии активации по сравнению с мезофильными бактериями, обычно достигается большей компактностью и образованием дополнительных электростатических и гидрофобных связей, что является необходимым условием для функционирования МДГ в экстремальном температурном режиме. Кинетические и регуляторные характеристики фермента из термофилов имеют сходство с димерной формой МДГ из серобактерий.
Т.о., показано, что молекулярная трансформация малатдегидрогеназной системы играет важную роль в адаптации бактерий разных экологических групп (рис.35). Структурно-функциональные изменения фермента (взаимопревращение димер-тетрамер) обеспечивают переключение и регуляцию метаболизма у серобактерий в зависимости от типа питания. МДГ из термофильных бактерий обладает большой массой субъединиц и приобретает за счет этого потенциальную возможность к образованию дополнительных электростатических и гидрофобных взаимодействий, обеспечивающих жесткость её структуры, необходимую для функционирования термоэизима при высоких температурах. 1. С помощью модифицированной многостадийной очистки получены электрофоретически гомогенные препараты МДГ из бактерий разных экологических групп. Установлено, что значения удельной активности исследуемого фермента зависят от источника выделения. При органотрофном культивировании В. leptomitiformis Д-402 и L. mucor DSM 2157 удельная активность составляет 24,4±0,73 и 1,19±0,035 Е/мг белка (степень очисіки 131 и 54, еооїьеісшенно), при литотрофном — 20,4±0,61 и 0,56±0,017 Е/мг белка (степень очистки 123 и 62). Препарат МДГ из термофильных бактерий V. medioatlanticus DSM 14978г имеет величину удельной активности 6,9±0,2 Е/мг белка, степень очистки -110. 2. МДГ из исследуемых микроорганизмов имеет сложную четвертичную структуру, представляя собой олигомер. Выявлено, что в условиях органотрофного роста у серобактерий В. leptomiiiformis и L. mucor формируется димерная форма фермента (Мг = 84 и 74 кДа), тогда как при литотрофном культивировании индуцируется гомотетрамер (Mr = 165 и 158 кДа дія В. leptomitiformis и L. mucor, соответственно). Молекулярная масса субъединиц МДГ составляет 40 и 39 кДа. 3. Показано, что МДГ из термофильных бактерий представляет собой димер с "тяжелыми" субъединицами, молекулярная масса которого, определённая гель-хроматографией насефадексе G-150, составляет 128 кДа. Методом Ds-Na-электрофореза установлено значение молекулярной массы субъединиц МДГ из V. medioatlanticus - 58 кДа. Культивирование и очистка термофильных бактерий V. medioatlanticus при различных температурах не приводит к изменению четвертичной структуры фермента. 4. Выявлена важная роль структурных изменений малатдегидрогеназы в адаптации изучаемых микроорганизмов к условиям среды обитания. Установлена динамика перехода тетрамера в димер при миксотрофном культивировании В. leptomitiformis, обусловленная скоростью окисления тиосульфата. 5. С использованием специфических ингибиторов установлена функциональная роль изоформ МДГ. Показано, что димерная форма фермента обеспечивает работу ЦТК, а тетрамерная - глиоксилатного цикла. 6. Анализ термодинамических параметров (термостабильности, температурного оптимума и энергии активации) МДГ из исследуемых бактерий показывает, что МДГ из V. medioatlanticus обладает высокой термостабильностью. Установлено большее значение энергии активации для МДГ из термофильных организмов (32,6 кДж/моль) по сравнению с мезофильными (5,4 кДж/моль), свидетельствующее о повышенной жесткости молекулы фермента, необходимой для его функционирования в экстремальном температурном режиме. 7. Выявлено разное сродство фермента к субстратам. Значения Км для МДГ из исследуемых бактерий свидетельствуют о высоком сродстве фермента к оксалоацетату и более низком - к манату. Установлено, что Км по оксалоацетату для МДГ из серобактерий при органотрофном росте выше, чем при литотрофном. Обратная картина наблюдается при окислении маната. Для тетрамерной формы МДГ из В. leptomitiformis выявлена отрицательная кооперативность по оксалоацетату при высоких концентрациях фермента.
