Содержание к диссертации
Введение
Глава!. CLASS Обзор литературы CLASS 9
1. Общая характеристика внутриклеточного протеолиза 9
1.1. Протеолитические ферменты 10
1.1.1. Сериновые протеиназы И
1.1.2. Цистеиновые (тноловые) протеиназы 12
1.1.2.1. Лизосомальные протеиназы 13
1.1.2.2. Са2+-активируемые нейтральные протеиназы питозоля 16
1.1.3. Аспартильные (карбоксильные) протеиназы 20
1.1.4. Металлопротеиназы 22
1.1.5. Мультикаталитические протеиназы 22
2. Особенности протеолитических ферментов водных организмов и их участие в эколого-биохимических адаптациях 23
3. Влияние загрязнения и сопутствующих факторов среды на водные организмы 26
3.1. Общие положения токсичности... 26
3.2. Влияние промышленных и бытовых сточных вод 32
3.3. Влияние тяжелых металлов 38
3.4. Влияние соединений ртути 41
4. Роль солености окружающей среды для гидробионтов 49
Глава 2. Материал и методы исследований 62
2.1. Материал 62
1.2. Характеристика материала 62
1.3. Методика отбора и хранения биологических проб 63
2.2. Методы исследований 63
2.2.1. Определение стадии зрелости исследуемых организмов 63
2.2.2. Приготовление гомогенатов тканей и экстракция протеиназ 64
2.2.3. Количественное определение водорастворимого белка в тканях 64
2.2.4. Определение активности протеиназ 65
2.2.4.1. Определение активности катепсина В 65
2.2.4.2. Определение активности катепсина D , 65
2.2.4.3. Определение активности Са2+-зависимых нейтральных протеиназ 65
2.2.5. Схема выделения и очистки исследуемых протеиназ 66
2.2.5.1. Разделение белков из тканей исследуемых объектов методом гель-фильтрации на колонках с ультрагелем АсА 34 и сефадексом S-200 66
2.2.5.2. Определение молекулярной массы исследуемых белков методом гель-фильтрации 67
2.2.5.3. Ионообменная хроматография на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой.. 68
2.2.5.4. Оценка чистоты препаратов протеиназ методом электрофореза в долиакриламидном геле 68
2.2.6. Статистическая обработка данных 69
Результаты исследований 70
Глава 3. Частичная очистка, распределение, видо-, тканеспецифичность и некоторые физико-химические свойства Са2+-активируемых нейтральных протеиназ гид-робионтов ... 70
3.1.Активность и тканеспецифичность кальпаинов рыб и водных беспозвоночных 71
3.2. Свойства Са2+-зависимых протеиназ из гомогенатов цельных амфипод Gammaridae spp 77
3.3. Свойства Са2+-зависимых протеиназ из эритроцитов форели Salmo trutta L. 80
Глава 4. Влияние антропогенного загрязнения водоемов на внутриклеточный протеолиз у водных организмов 84
4.1. Влияние антропогенного загрязнения прибрежной акватории Белого моря на внутриклеточный протеолиз у амфипод Gammaridae spp. и мидий Mytilus edulish 84
4.2. Влияние стоков горно-обогатительного производства на внутриклеточный протеолиз у щуки Esox lucius и плотвы Rutilus rutilus 91
Глава 5. Влияние соединений ртути на внутриклеточный протеолиз у рыб и млекопитающих .. 97
5.1. Влияние ртутного загрязнения в сочетании с сопутствуюпщми факторами (ацидификация, гумифицированность) на протеолиз в тканях окуня Perca flu-viatilis L. из малых озер Вологодской области и Карелии 97
5.2. Влияние пищевой интоксикации соединениями ртути на внутриклеточный протеолиз у карася Carassius carassius и окуня Perca fluviatilis L. в аквариальных условиях 109
5.3. Влияние пищевой интоксикации солями ртути, различными по растворимости, на внутриклеточный протеолиз в органах крыс и протекторная роль энтеросорбентов 112
Глава 6. Роль солености окружающей среды для водных организмов 119
6.1. Влияние различной солености среды на показатели внутриклеточного протеолиза у мидий Mytilus edulis L. в аквариальных условиях 119
6.2. Влияние солености среды на некоторые показатели белкового обмена у личинок атлантического лосося Salmo satar L 124
6.3. Влияние солености среды на показатели белкового обмена у наваги Elegi-nus navaga Pall 127
Заключение 131
Выводы 134
Используемые сокращения 135
Список литературы 136
Приложение 161
- Особенности протеолитических ферментов водных организмов и их участие в эколого-биохимических адаптациях
- Определение активности протеиназ
- Свойства Са2+-зависимых протеиназ из гомогенатов цельных амфипод Gammaridae spp
- Влияние ртутного загрязнения в сочетании с сопутствуюпщми факторами (ацидификация, гумифицированность) на протеолиз в тканях окуня Perca flu-viatilis L. из малых озер Вологодской области и Карелии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Выяснение биохимических механизмов развития адаптивных реакций у животных является важным аспектом решения одной из фундаментальных проблем биологии - взаимодействия организма и среды. Особый интерес представляет изучение биохимических адаптации у водных организмов (беспозвоночных и рыб), являющихся пойкилотермными животными, у которых легче, чем у теплокровных, установить взаимосвязь со средой, так как у них эта система в большей степени открыта. Результаты таких исследований могут иметь несомненное значение для выяснения как специфических, так и общих механизмов развития адаптационного процесса. В современных условиях состояние организмов в природных водоемах в значительной степени зависит от степени антропогенной нагрузки, которое зачастую усугубляется естественными абиотическими и биотическими факторами. Водоемы Карелии, расположенные в зоне северной тайги, отличаются от более южных водных экосистем повышенной чувствительностью И НИЗКОЙ устойчивостью к антропогенному загрязнению (Заличева и др., 2002; Моисеенко, 2003). Известно, что действие на организм факторов среды сопровождается вовлечением различных механизмов регуляции гомеостаза. Среди них важное место занимает протеолиз, являющийся прерогативой выживания организмов. Протеолитические ферменты действуют на первом, ключевом этапе мобилизации белковых резервов клетки, и поэтому их роль в механизмах биохимических адаптации невозможно переоценить (Антонов, 1983; Локшина, 1986; Мосолов, 1988; Немова, 1996; Barrett, 1977; Bobley, 1987). При действии экстремальных факторов повышается активность внутриклеточных протеиназ, образуются биологически активные вещества, которые в последующем влияют на синтез белка и нуклеиновых кислот. Так индуцируются структурные перестройки, характерные для долговременной адаптации, что, цо-видимому, является проявлением общего адаптационного синдрома. Нарушение регуляции и нормального функционирования протеолитических ферментов приводит к развитию патологических состояний.
Цель настоящей работы состояла в выяснении особенностей функционирования системы внутриклеточных протеолитических ферментов у гидробионтов, выявлении приспособительных ответных реакций на уровне протеолиза у водных организмов, принадлежащих к разным таксонам, при воздействии на них факторов среды различной природы, в том числе антропогенных.
В задачи исследований входило:
1. охарактеризовать в сравнительном аспекте основные ферменты системы внутриклеточного протеолиза (лизосомальные и кальцийактивируемые протеиназы цито-
золя) у гидробионтов - представителей различных таксонов, включая ракообразных, моллюсков и костистых рыб;
изучить уровень активности и свойства протеиназ в органах рыб, различающихся особенностями биологии;
в натурных и аквариалыдах экспериментах изучить ответные реакции различных таксономических групп гидробионтов на действие наиболее характерных для водоемов Северо-Запада России факторов, включая антропогенное загрязнение;
провести сравнительный анализ состояния системы протеолиза в тканях гидробионтов, обитающих в акваториях с разным уровнем антропогенной нагрузки;
на основании анализа полученных данных выяснить возможность использования показателей внутриклеточного протеолиза в качестве биотестов при оценке качества сред обитания гидробионтов, их физиологического состояния и адаптивных возможностей при воздействии неблагоприятных факторов среды.
Научная новизна работы. Большая часть представленных в настоящей работе данных о протеолитических ферментах рыб и морских беспозвоночных получена впервые. Впервые выделены и изучены свойства кальций-зависимых протеиназ у ряда ранее не исследованных в этом отношении объектов. Показано, что под влиянием изменяющихся факторов среды внутриклеточные протеиназы вовлекаются в адаптивные или патологические перестройки в клетках в зависимости от силы и длительности воздействия фактора, резистентности организма, половой принадлежности, тканевой специфичности. Таким образом, научная новизна работы состоит в установлении общих и специфических черт ответных реакций различных таксономических групп гидробионтов на уровне внутриклеточного катаболизма белков на действие вариабельных факторов водной среды, естественных и антропогенных.
Практическая значимость работы. Работа является частью многолетних исследований, проводимых в лаборатории экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАН в рамках основных направлений биологических наук РАН (5.15, 5.21), грантов РФФИ №98-04-48482а, №02-04-48451, №03-04-06351 мае, ФЦП "Интеграция" №641, №3 3010/2354, грантов Санкт-Петербургского конкурса для молодых ученых (№М 01-2.6К-714, №М03-2.6.К-588), гранта Президента РФ "Ведущие научные школы" (НШ-894.2003.4). Результаты исследований имеют практическое значение для оценки физиолого-биохимического состояния организмов. Исследуемые показатели белкового катаболизма (уровень активности лизосомальных катепсинов В и D, молекулярных форм кальпаинов цитозоля) могут быть использованы в качестве дополнительных биохимических критериев при разработке
системы эколого-биохимического мониторинга водоемов. Результаты, полученные в ходе исследований, могут послужить основой для более углубленного изучения сравнительно-эволюционных и физиолого-биохимических аспектов протеолиза у животных. Материалы диссертации используются в лекционных курсах "Экологическая биохимия" и "Введение в энзимологию" для студентов ПетрГУ и КГПУ.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на V conference "Ich-thyonaematology" (Protivin, Czech Republic, 1998), V international conference "Mercury as a global pollutant" (Rio de Janeiro, Brasil, 1999), 3rd international Lake Ladoga symposium "Monitoring and sustainable management of Lake Ladoga and other large lakes" (Petrozavodsk, 1999), международной конференции "Биологические основы изучения, освоения и охраны жив. и раст. мира, почв, покрова Восточной Фенноскандии" (Петрозаводск, 1999), международной конференции "Атлантический лосось Salmo Salar. биология, запасы, воспроизводство" (Петрозаводск, 2000), IX Всероссийской конф. "Экологическая физиология и биохимия рыб" (Ярославль, 2000), Vr1 European symposium on calcium binding proteins in normal and transformed cells (Paris, France, 2000), международной конференции "Биокатализ 2000" (Москва, 2000), XX-XXI Workshops "Biological essentiality of trace and ultratrace elements" (Jena, Germany, 2000, 2002), международной конференции "Экологическая физиология и биохимия рыб" (Ярославль, 2000), конференции "Поморье в Баренц Регионе: Экономика, экология, культура" (Архангельск, 2000), ni-IV international symposia "Micro and trace elements in human: new perspectives" (Athens, Greece, 2001, 2003), конференции "Экологические проблемы онтогенеза рыб (физиолого-биохими-ческие аспекты)" (Москва, 2001), конференции "Современные проблемы биоиндикации и биомониторинга" (Сыктывкар, 2001), V симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 2002), Ш съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), конференции "Современные проблемы водной токсикологии" (Борок, 2002), XIth symposium on trace elements in man and animals (Berkeley, USA, 2002), международном семинаре "Современные проблемы физиологии и экологии морских животных (рыбы, птицы, млекопитающие)" (Ростов-на-Дону, 2002), II АМАР symposium on environmental pollution of the Arctic (Rovaniemi, Finland, 2002), IIIrd young scientists conference "XXI century: ecological science in Annenia" (Yerevan, 2002), И3 international conference on enzymes in the environment: activity, ecology and applications (Praha, Czech Republic, 2003), 9th meeting of PhD students in evolutionary biology (Fiesch, Switzerland, 2003), конференции "Экологические проблемы бассейнов крупных рек - 3" (Тольятти, 2003), международной конференции "Инновации в науке и образовании-2003" (Калининград, 2003), 10th meeting of PhD students in evolutionary biology (Shrewsbury, Great Britain, 2004).
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаб. экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАН (особенно с.н.с. Е.И. Кяйвяряйнен и с.н.с. М.Ю. Крупновой), кафедры молекулярной биологин, биологической и органической химии ПетрГУ, ББС ЗИН РАН "Картеш", ИБВВ РАН (пос. Борок Ярославской обл.), Кандалакшского государственного природного заповедника (Мурманская обл.), ИВПС КарНЦ РАН за помощь в получении биологического материала, в постановке экспериментов и обсуждении результатов исследований.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 37 работ, в том числе 12 статей и 25 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, четырех глав результатов исследования, заключения, выводов, списка литературы и приложения. В работе имеется 44 таблицы, 42 рисунка. Список литературы включает 361 источник, из них 116 на русском и 245 на иностранных языках.
Особенности протеолитических ферментов водных организмов и их участие в эколого-биохимических адаптациях
Вопрос об участии протеолиза в физиологических изменениях клетки привлекает к себе внимание исследователей. Биохимические изменения большей частью носят адаптивный характер на уровне основных метаболических функций и потому макроскопически не проявляются (Хочачка, Сомеро, 1977), Биохимические адаптации часто являются отражением физиологических процессов, таких как нерест, голодание, зимовка, миграция и т.д. Интенсивность белкового катаболизма регулируется на уровне количества и активности протеиназ. Изменения уровня обмена белков происходит в ходе всех физиологических процессов. В таком аспекте изучение системы протеолиза представляет несомненную важность.
Протеиназы у всех животных выполняют две основные функции. Они катализируют процессы распада белка и служат регуляторами обмена веществ. Изменения в наборе и активности ферментов часто бывают необходимы по следующим причинам (Хочачка, Сомеро, 1977):
1. при переходе к другой физиологической стадии развития организма и, соответственно, изменении его потребностей в отношении общей интенсивности белкового метаболизма;
2. при изменении физических факторов окружающей среды, например, температуры, давления, рН и т.д., приводящих к значительному изменению структуры и функций ферментов;
3. при изменениях химического состава среды (поскольку он влияет на качественный и количественный состав внутриклеточных и внеклеточных жидкостей). Следует подчеркнуть, что большинство исследований по выделению и очистке протеиназ проведено с использованием в качестве источника ферментов тканей млекопитающих, реже - рыб. Данные такого рода исследований на морских беспозвоночных очень скудны и фрагментарны. Протеиназы водных пойкилотермных животных имеют некоторые свойства, отличные от протеиназ из тканей млекопитающих. Прежде всего, это касается более высокой активности при низких температурах (Milanesi, Bird, 1972).
Кислые протеиназы млекопитающих достаточно полно охарактеризованы (Press et al., 1960; Казакова, Орехович, 1975; Barrett, Heath, 1977). Наиболее детально изучены протеиназы печени (Казакова и др., 1980; Barrett, 1977) и селезенки (Евтихина и др., 1963). Что касается гидробионтов, и в частности беспозвоночных, то такого рода исследований немного и проводились они, как правило, на мышцах и внутренних органах рыб (Makino-dan et al., 1982; Немова, Сидоров, 1990).
Система, обеспечивающая деградацию белков у морских беспозвоночных в кислой, нейтральной и щелочной зонах рН (Немова, 1991), напоминает таковую у высших животных и обеспечивает гидролиз белков различной структуры, но вместе с тем, имеет ряд особенностей. Следует отметить следующие из них:
во-первых, протеолитические ферменты беспозвоночных холодных морей имеют более высокую активность при низких температурах;
во-вторых, общая протеолитическая активность во внутренних органах беспозвоночных значительно выше, чем у позвоночных;
в-третьих, протеолитические ферменты беспозвоночных, являясь эволюционными предшественниками протеиназ высших животных, обладают, как правило, более широкой специфичностью (Мухин, 1998).
Особенности протеолитических ферментов морских беспозвоночных объясняются, с одной стороны, эволюционной древностью и примитивностью организации, а с другой, средой обитания этих организмов.
Гонады. Активность катепсинов В и D в гонадах рыб была выявлена многими исследователями (Немова, Сидоров, 1990; Yamashita, Konagaya, 1989). По морским беспозвоночным таких данных значительно меньше. Катепсин В был выделен и охарактеризован из яиц морского ежа (Okada, Yokota, 1990). Катепсин D характерен для всех рассматриваемы типов животных. Трипсиноподобные нейтральные протеиназы, наряду с акрозином, принимают участие в акросомной реакции (Ciereszko et al., 1994) и присутствуют в половых железах многих организмов. Предполагается, что дезинтеграция оболочки яйца осуществляется протеазами при участии ионов кальция (Epel et al., 1978). Так, наличие кальцийакти-вируемых нейтральных протеиназ зафиксировано в гонадах исландского гребешка, морского ежа (Мухин, 1998), карпа (Toyohara et al., 1985) и атлантического лосося (Немова, 1996). Наличие кальцийактивируемой протеолитической активности в гонадах беспозвоночных и рыб может свидетельствовать о важной роли кальций-зависимого протеолиза в физиологических процессах, происходящих в период гаметогенеза и оплодотворения (Немова,1991). В целом, набор протеолитических ферментов в гонадах морских беспозвоночных имеет сходство со спектром протеиназ в половых железах рыб, что может быть обусловлено общностью среды обитания, плана строения половых органов и способа размножения. С помощью чувствительных методов были получены доказательства протеаз-ного механизма оплодотворения. Считают, что протеиназы участвуют в разрушении бел ков сперматозоида, белков яйцевых оболочек, блокировании полиспермии, декомпенсации хроматина, расщеплении комплекса мРШС-белок и других процессах, сопровождающих оплодотворение (Репин, 1980; Fritz et al., 1979; Osuna et al., 1977). Ранее было показано, что уровень активности катепсинов и их субклеточное распределение меняются в процессе оплодотворения и в ходе онтогенеза у сига, форели (Немова, Сидоров, 1980), карпа (Коновалов, Местечкина, 1975), трески, морского ежа, рачков Artemia salina, Xenopus laevis (Нейфах, Давидов, 1964).
Мышечные ткани. Совокупность сократимых элементов тела представляет собой мышечную систему животного. Мышечные клетки у беспозвоночных могут образовывать обособленные ткани или являться включениями в другие органы. Основываясь на функции, строении и особенностях биохимического состава к мышечным тканям следует отнести: у моллюсков - мускул-замыкатель, мантию, жабры; у ракообразных - мышцы конечностей, абдомена, жабры (Беклемишев, 1964). Подобно пищеварительным и половым органам в мышечных тканях морских беспозвоночных обнаруживается спектр протеиназ, активных в кислой, нейтральной и щелочной зонах рН. У всех рассматриваемых таксонов в мышечных тканях обнаружен катепсин D. Присутствие трипсиноподобного фермента в мускульных тканях морских беспозвоночных (Мухин, 1998) является их отличительной чертой от млекопитающих и рыб, так как известно, что трипсин - типичный пищеварительный фермент, образуемый у позвоночных в железах кишечника. В ходе дивергентной эволюции трипсин приобретает, по-видимому, более специфическую тканевую локализацию и более узкую пищеварительную функцию.
По мнению П. Хочачка и Дж. Сомеро (1977), в рамках экологической биохимии прежде всего необходимо установить и описать принципиальные биохимические механизмы, выработанные в процессе эволюции животных, обеспечивающие им необходимую адаптацию на химическом уровне к меняющимся условиям внешней среды, причем эти механизмы могут быть очень близкими даже у далеких друг от друга видов. Часто на уровне метаболизма и химической организации у разных организмов довольно однотипно в отдельных случаях происходит приспособление (биохимическая адаптация) к разнообразным факторам среды (различным температуре, давлению, содержанию кислорода и углекислоты).
А.А. Нейфах и М.Я. Тимофеева (1977) считают, что при изучении ферментов важное значение имеет то, какие показатели рассматриваются: (а) знзиматическая активность, определенная in vitro в оптимальных условиях, (б) количество ферментного белка в весовых или молярных единицах, которое можно определить лишь в отдельных случаях, (в) действительная-активность фермента в клетке, то есть не максимально возможная, а ре ально проявленная. Эти величины связаны между собой, связь эта не прямая, и коэффициенты пропорциональности зависят от многих условий и, как правило, не известны. Тем не менее, значительное повышение активности ферментов, определенное in vitro, позволяет ожидать, что возросла и скорость катализируемых ими реакций в клетке. На последний постулат мы опирались в своих исследованиях. Известно, что ферменты синтезируются в клетке задолго до начала функционирования (Нейфах, Тимофеева, 1977).
Определение активности протеиназ
Готовили 10%-ные гомогенати ткани в 0.25 М растворе сахарозы, содержащим 1 мМ Na-соли ЭДТА и 0.1% неионного детергента тритона Х-100. Гомогенизировали и центрифугировали, как описано ранее. В дальнейших анализах использовали супернатант. Эстеразную активность катепсина В определяли по расщеплению 0.065 М раствора этилового эфира гидрохлорида N-бензоил L-аргинина в 0.1 М ацетатном буфере (рН 5.0) (Matsuda, Misaka, 1974) при 37 С в течение 30 минут. Изменение оптической плотности регистрировали на спектрофотометре (Е525) в кюветах с толщиной рабочей грани 10 мм против контрольного раствора. Активность фермента выражали в единицах изменения оптического поглощения (Е525) на 1.0 г сырой массы ткани за 30 минут инкубации (37 С).
Готовили 10%-ные гомогенаты ткани в 0.25 М сахарозе с добавлением тритона Л-100 (0.1%) для разрушения клеточных структур. Гомогенизировали и центрифугировали, как описано ранее. В дальнейших анализах использовали супернатант. Активность катепсина D оценивали по гидролизу 1% р-ра бычьего гемоглобина в 0.1 М ацетатном буфере (рН 3.6) согласно модифицированному методу Ансона (Алексеенко, 1968) во фракции лн-зосом после дифференциального центрифугирования исходных гомогенатов ткани (Покровский, Тутельян, 1976). Единица активности катепсина D определялась в единицах изменения оптического поглощения (Е28о) на 1 г сырой массы ткани за 1ч инкубации (37 С).
Активность кальпаинов определяли после предварительной гель-хроматографии образцов на колонках (2.5x95 см) с гелем Sephacryl S-200 (Pharmacia) или ультрагелем АсА34 (Sigma), уравновешенными буфером А (10 тМ трис-НС1 (рН 7.5), содержащим 50 mM NaCl, 4 тМ EDTA, 5 тМ меркаптоэтанола), используемым в дальнейшем в качестве экстрагирующего раствора. Используемые гели характеризуются большим диапазоном разделения белков по молекулярной массе (20-400 кДа). Цель гель-хроматографического разделения центрифугатов тканей - отделение специфического белкового ингибитора -кальпастатина - от собственно фермента - кальпаина, а также фракционирование отдельных молекулярных форм фермента. Фермент (120-65 кДа) и ингибитор (200-300 кДа) раз деляются за счет разницы их молекулярных масс. Разделение проводили в холодильной камере при температуре +4 С на стандартной аппаратуре фирмы LKB-Pharmacia (Швеция). Наносили на колонку по 12.0 мл 25%-ных супернатантов цитозольных фракций тканей (105 Tbrc.g. х 60 мин) в буфере А, содержащим 0.25 М сахарозы (рН 7.5) восходящим током элюента с помощью перистальтического насоса. Элюцию проводили со скоростью 20 мл/ч буфером А. Выходящие с колонки фракции регистрировали на абсорбциометре Uvicord II при 280 нм, соединенным с 6-канальным самописцем типа "6520 Н". Сбор фракций элюента объемом 4 мл осуществляли с помощью коллектора фракций, и в них определяли активность Са +-активируемых протеиназ стандартным методом по гидролизу казеина (Murachi et al., 1981). Реакционная смесь для обоих кальпаинов включала 0.4 % казеина, 5 тМ дитиотреигола, 50 тМ имидазол-НС1 буфер (рН 7.5) и ферментный раствор. Инкубация опытных проб происходила в присутствии 3.0 тМ СаСЬ, в контрольные пробы кальций добавляли после инкубации. После 30 мин инкубации (30 С) реакцию останавливали добавлением 2.5 мл 10% ТХУ. Концентрацию кислоторастворимых продуктов гидролиза определяли спектрофотометрически (Егяо)- Единица активности кальпаинов определялась как количество фермента во фракции, вызывающее увеличение на 1.0 оптического поглощения (Е28о) за 1 час инкубации (30 С).
Для разделения белков без ущерба их каталитической активности существуют достаточно мягкие способы, когда белки находятся в растворе в течение всей процедуры. Среди таких методов - гель-хроматография, которая относится к важнейшим методам, применяемым для очистки ферментов и других белков.
Спектр выпускаемых на данный момент носителей весьма широк: сефадексы, се-факрилы, полиакриламид (биогель), СТ сефарозы, ультрагели. Принцип разделения молекул методом гель-фильтрации основан на "фильтрующей" способности гелевых носителей пропускать белковые молекулы соответственно их размерам (Уильяме, Уилсон, 1978), а значит, пропорционально их молекулярным массам. Гель состоит из открытой поперечно-сшитой трехмерной молекулярной сеткн, сформированной в виде шариков (гранул) для удобства наполнения колонок. Поры внутри гранул имеют такие размеры, что некоторые из них недоступны для крупных молекул, тогда как более мелкие молекулы могут проникать во все поры. Хроматография основана на том, что растворенные вещества отстают от фронта растворителя по мере его продвижения по носителю. Образец на старте представляет собой диск или цилиндр. По мере прохождения растворителя по колонке вещества, содержащиеся в образце, распределяются следующим образом: вещества, полностью извлеченные растворителем, движутся вместе с фронтом растворителя и очень быстро вымываются; вещества, полностью адсорбированные носителем, останутся на старте. Хроматография возможна только в том случае, когда вещество задерживается в результате частичной адсорбции, но в конечном счете элюирует. Широко применяются перистальтические насосы, с помощью которых можно поддерживать постоянную скорость протекания буфера. Белки элюируют с колонки в порядке уменьшения молекулярного веса в соответствии со степенью торможения их неподвижной фазой геля. Результаты элюции регистрируются УФ-спектрофотометром, измеряющим оптическую плотность при длине волны 280 им (полоса поглощения Trp + Туг), а коллектор фракций собирает равные объемы жидкости за определенные промежутки времени. Поток с колонки можно разделить, с тем чтобы отбирать небольшое количество элюата на ферментативный анализ. При правильной синхронизации можно записывать результаты определения ферментативной активности параллельно с кривой элюции белка (Скоупс, 1985).
Подобная система из перистальтического насоса, колонки размером 2.5x95 см, заполненной ультрагелем АсА34 (Sigma) или сефакрилом S200 (Pharmacia), УФ-спектрофотометра и коллектора фракций использовалась в эксперименте. Все исследования проводили в холодильной камере при температуре 4.0 С. Перед экспериментом хро-матографическую систему в течение суток уравновешивали пропусканием используемого в дальнейшем экстрагирующего раствора. Образцы объемом 12,0 мл наносили на колонку восходящим током элюента с помощью перистальтического насоса.
Свойства Са2+-зависимых протеиназ из гомогенатов цельных амфипод Gammaridae spp
Имеющиеся в литературе сведения о кальпаинах беспозвоночных фрагментарны (Maeda et al., 1992b; Beyette et al., 1993), но есть указания на большее их разнообразие, различие в размерах молекул кальпаинов и отсутствие классического разделения кальпаи-нов на кальпаин Ї и кальпаин П (Mykles, Skinner, 1983; Pinter, Friedrich, 1988).
Отмечено, что для амфипод характерно относительно низкое содержание высокомолекулярных белков в сравнении с изученными нами ранее видами рыб и млекопитающих. Следует также отметить, что отношение площади пика низкомолекулярных веществ белковой природы к площади пика высокомолекулярных у амфипод выше, чем у прочих изученных видов. Са2+-зависимая активность у амфипод элюируется в трех пиках с молекулярными массами 110, 80 и 65 кДа (рис. 5). Дальнейшее изучение таких свойств различ-ных фракций, как чувствительность к Са (рис. 7), рН-зависимость (рис. 8), температурная устойчивость (табл. 2), чувствительность к действию ингибиторов (табл. 3), позволило идентифицировать выделенные ферменты как кальпаин-подобные ферменты беспозвоночных.
Для фракций элюента после гель-хроматографии, в которых выявляется Са2+ зависимая активность, определили концентрацию Са2+, необходимую для проявления максимальной активности (рис. 7). Ферменты максимально активны при 5.0 мМ - фракция
Мг 110 кДа, 3.0 мМ - фракция с Мг 80 кДа, и промежуточная между двумя вышеуказанны ми формами зависимость активности от концентрации Са2+ 4.0 мМ характерна для фракции с Мг 65 кДа. Следует отметить, что столь высокий уровень Са2+ не физиологичен для цитоплазмы клетки.
Известно, что одним из критериев распознавания кальпаинов 1 и И у позвоночных служит их термостабильность при 58 С. Активность кальпаина II карпа снижается на 25% при нагревании в течение 5 минут, тогда как активность кальпаина I не изменяется (Ми-rachi et аІ., 1981). Показано, что фракция фермента амфипод с Мг ПО кДа полностью инактивируется уже при воздействии 48 С. Протеиназа с Мг 80 кДа частично теряет активность только при 58 С. Фракция фермента 65 кДа демонстрирует промежуточную термостабилъность (активность постепенно снижается до нулевого значения). Полученные данные свидетельствуют о том, что кальпаин-подобные ферменты амфипод значительно более чувствительны к нагреванию, чем кальпаины рыб. Это также согласуется с данными Maeda (1992) о том, что кальпаины, выделенные из беспозвоночных, менее термостабильны, чем кальпаины млекопитающих (Maeda et al., 1992b).
Чувствительность протеиназ к действию специфических ингибиторов является единственным абсолютным критерием принадлежности фермента к одному из четырех общепризнанных типов по структуре активного центра. Показано, что Са2+-зависимые протеиназы амфипод чувствительны к действию ингибиторов, воздействующих на SH-группы цистеина: алкилирующих реагентов, соединений тяжелых металлов, а также агентов, связывающих двухвалентные ионы (например, Са ), что позволяет отнести их к цис-теиновым протеиназам.
Кроме того, известно, что в цитозоле присутствие Са """-зависимых протеиназ обязательно сопровождается присутствием их эндогенного конкурентного ингибитора - каль-пастатина (Murachi, et al., 1981), необычайно термостабильного (Maki et al., 1990). Кальпа-статин из амфипод элюируется с колонки Sephacryl S200 в белковой фракции с ММ - 130 кДа, что согласуется с данными литературы, полученными для млекопитающих (Murachi et al., 1981,1983; Murachi, 1990) и рыб (Toyohara et al., 1985a).
Следует подчеркнуть, что несмотря на вышеназванные отличия в уровне активности, молекулярной массе, термостабильности Са2+-активируемые протеиназы морских беспозвоночных обнаруживают значительное сходство с таковыми млекопитающих и рыб по многим параметрам (оптимум рН, чувствительность к Са2+, ингибиторам), что говорит о высокой степени эволюционной консервативности исследуемых протеиназ (Мухин и др., 1995; Немова, 1996) и подтверждает тот факт, что процесс протеолиза имел место уже на самых ранних этапах химической эволюции и имеет сходные механизмы у видов, различающихся длительностью своей истории (Антонов, 1983). Эволюция таксонов, различающихся длительностью своей истории, отбирала те биохимические принципы, которые нашли окончательное выражение у высших позвоночных и человека (Сидоров, 1986).
Влияние ртутного загрязнения в сочетании с сопутствуюпщми факторами (ацидификация, гумифицированность) на протеолиз в тканях окуня Perca flu-viatilis L. из малых озер Вологодской области и Карелии
При всей очевидности существования в России проблемы ртутного загрязнения, усиливающегося с закислением поверхностных вод, молекулярные механизмы воздействия этих факторов на биоту водоемов практически не изучены. Мелкие пресные водоемы подвержены таким изменениям в большей степени, чем крупные. Протеиназы могут принимать участие в инактивации, превращении и экскреции химических соединений. Ранее было показано, что протеолитическая система лизосом у рыб оказывается чувствительной при воздействии токсикологических факторов различной природы (Немова, Сидоров, 1990; Немова и др., 1994). Учитывая тот факт, что для проявления активности цистеинза-висимых протеиназ (кальпаинов цитозоля и лизосомального катепсина В) необходимы SH-группы, чувствительные к воздействию тяжелых металлов, особенно ртути, можно полагать, что с ними связан один из возможных механизмов воздействия ртути на клеточный метаболизм, а уровень активности этих ферментов может служить дополнительным биоиндикатором ответной реакции организма рыб на этот фактор. Эти исследования имеют значение также и с точки зрения здоровья человека, так как известно, что основным источником поступления ртути в человеческий организм является рыба (Haines et al., 1994).
В представленной главе приводятся результаты исследований влияния аккумуляции ртути в мышцах рыб, обитающих в малых озерах с различной степенью ацидифика-ции (рН) и цветности (гумифицированности) на активность цистеинзависимых (тиоловых) протеиназ: лизосомального катепсина В и кальпаинов цитозоля, а также на содержание белка и тиоловых групп в некоторых тканях окуня. Окунь Perca fluviatilis L. интересен как объект изучения воздействия ртути и сопутствующих факторов, поскольку является представителем хищных рыб, завершающих трофическую цепь водоема, а также он весьма устойчив к закисленню среды, продолжая существовать в озерах, рН воды которых падает до уровня рН ниже 4.0 (Комов, 1999). Кроме того, при сопоставлении одноразмерных рыб наибольший возраст и самое высокое содержание ртути в мышцах имеет окунь, а интенсивность линейного роста рыбы может рассматриваться как существенный фактор, влияющий на бионакопление ртути (Степанова, Комов, 2002).
Материал получен при сотрудничестве с лаб. физиологии и токсикологии водных животных Института биологии внутренних вод РАН (пос.Борок). Рыбу отлавливали из озер Дарвинского государственного заповедника (ДГЗ) (Вологодская обл.) с различным уровнем закислення и цветности. Ацидные озера представлены как гумифицированными (темноводными) - Змеиное, Дубровское - с высоким содержанием растворенного органического вещества (РОВ), так и светловодными - Мотыкино - с низким содержанием РОВ (табл. 8). Исследованные озера расположены на охраняемой территории на значительном удалении от источников загрязнения.
Сопоставление гидрохимических данных изученных малых озер и аккумуляции ртути в мышцах обитающих в них окуней (табл. 9) согласуется с прежними обследованиями (Haines et al., 1994) ряда бессточных нейтральных и кислых озер различной типологии, показавшими повышенный уровень ртути (0.8-1.0 мг/кг) у окуней из ацидных озер с рН 5.0, что превышает ЩЦС и представляет угрозу здоровью людей при употреблении рыбы в пищу.
Совместно с сотрудниками ИБВВ РАН исследовано соотношение содержания ртути в различных звеньях трофической цепи на примере ацидного оз.Дубровское, где наблюдается отсутствие последнего звена пищевой цепи - типичных хищных рыб, что связано с тем, что щуки в этом озере нет, поскольку она не переносит такого закислення. Установленный факт накопления ртути по звеньям пищевой цепи в ацидном озере при ее низких концентрациях в абиотических компонентах свидетельствует о протекании процессов, резко повышающих биодоступность ртути в этих условиях (Комов, 1999). Также известно, что в озерах с гуматным классом вод и уровнем рН 5.0 накопление ртути в мышцах окуня незначительно и не превышает 0.2 мг/кг (Haines et al., 1994).
Ранее И.К. Степанова и В.Т. Комов (1997) обнаружили у рыб преимущественное отложение ртути в мышечной ткани по сравнению с кишечником, жабрами и гонадами самцов. В исследуемых водоемах наблюдается та же тенденция, причем также высока аккумуляция ртути в печени (табл. 10). Это объясняется повышенным содержанием в макромолекулах, присутствующих в мышечной ткани, функциональных групп белков (-SH, =NH2, -СООН, -ОН), к которым ртуть проявляет высокую степень сродства, и значительной ролью печени в детоксикации соединений ртути за счет высокого содержания серосодержащих компонентов. Характерно, что депонирование ртути в гонадах на порядок ниже по сравнению с другими органами: гонады каждый год формируются заново, поэтому для них характерна меньшая степень аккумуляции токсиканта (Svobodova et al., 1999).
Одним из аспектов исследования влияния солей ртути на белковый метаболизм в тканях рыб было изучение содержания тиоловых белковых групп, компонентов металло-тионеинов и цистеинзависимых ферментов (включая протеиназы) (Немова и др., 2001) (табл. 11). Снижение содержания серосодержащих биомолекул в условиях закислення можно расценивать как подавление защитных реакций на уровне органов и систем организма, т.к. это свидетельствует об угнетении основного пути выведения тяжелых металлов - в связанном с серосодержащими лигандами состоянии с желчью (Clarkson, 1997; Urano, 1997).
