Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы ... 9
1.1. Морфофункциональные аспекты состояния печени при действии факторов космического полета и гипокинезии 9
1.1.1. Влияние факторов космического полета на печень 9
1.1.2. Влияние гипокинезии на печень 18
1.2. Компоненты транскрипционного комплекса и некоторые вопросы регуляции транскрипции.. 27
1.2.1. Основные элементы транскрипционного комплекса эукариотической клетки 27
1.2.2. Гормональная регуляция транскрипции 33
1.3. Обмен белков и нуклеиновых кислот при действии факторов космического полета и гипокинезии . 41
Глава II. Материалы и методы 48
Глава III. Результаты исследований 68
III.1. Исследование РНК-синтезирующего аппарата клеток печени при действии факторов космического полета 68
III.1.1. Влияние факторов космического полета на синтез РНК в ядрах клеток печени крыс 68
III.1.2. Влияние факторов космического полета на матричную активность хроматина 76
III.2. Исследование аппарата клеток печени в условиях гипокинезии 86
III.2.І. Влияние гипокинезии на содержание нуклеиновых кислот в печени крыс87
III.2.2. Эндогенный синтез РНК изолированными ядрами клеток печени .. 93
III.2.3. Активность солюбилизированных РНКнполимераз ядер клеток печени 95
III.2.4. Исследование матричных свойств препараттов хроматина печени 98
Глава ІV. Обсуждение результатов 103
Выводы 111
Литература 113
- Влияние факторов космического полета на печень
- Обмен белков и нуклеиновых кислот при действии факторов космического полета и гипокинезии .
- Влияние факторов космического полета на синтез РНК в ядрах клеток печени крыс
- Активность солюбилизированных РНКнполимераз ядер клеток печени
Введение к работе
По мере увеличения продолжительности космических полетов и усложнения программ исследований, проводимых космонавтами на борту орбитальных станций и в открытом космосе, все большее значение приобретает детальное изучение влияния экстремальных факторов полета на живой организм.Существенными факторами, действующими на организм в космическом полете, являются невесомость , радиация, перегрузки, вибрация и т.д.
Наиболее важным из перечисленных факторов является невесомость , при которой, вследствие длительной недогрузки опорно-двигательного аппарата, происходит снижение уровня мышечной активности, развивается гиподинамия. Поскольку невесомость невозможно воспроизвести в условиях Земли, изучение гиподинамии помогает решению многих проблем медико-биологического обеспечения космических полетов, представляя собой наиболее полную модель невеоомости.
Научно-техническая революция, обеспечившая небывалый прогресс механизации и автоматизации производства, развитие различных видов транспорта, способствовала существенному снижению мышечных затрат и двигательной активности здорового человека. Между тем показано, что гиподинамия отрицательно сказывается на общей резистентности организма, повышает его восприимчивость к различным заболеваниям и приводит к преждевременному старению.
Кроме того, проблема гиподинамии имеет большое народнохозяйственное значение в связи с практической необходимостью содержания сельскохозяйственных животных, птиц и пушных зверей в сравнительно малых пространствах обитания без нарушения их — 6 — продуктивности. Все сказанное выше выдвигает изучение действия гиподинамии на живой организм в число первоочередных задач биологии и медицины.
При гиподинамии, в условиях усиления катаболических процессов в скелетных мышцах, миокарде, сосудистом русле и костной ткани, важную роль в поддержании энергетических и пластических резервов организма играет печень /Могендович, 1961; Коваленко, Гуровский, 1980/, которая принимает участие в общих реакциях компенсаторно-приспособительного характера /Привес, 1971; Федоров, 1982; Панин, 1983/. имеются определенные успехи в исследовании влияния факторов космического полета и гиподинамии на структуру и морфологию печени (Ермольев, 1976; Логинов с соавт., 1979/ , особенности энергетического обеспечения гепатоцитов Доваленко с соавт., 1975/. Установлено изменение активности ряда ключевых ферментов углеводного и липид-ного обмена, находящееся в прямой зависимости от секреции гормонов, уровень которых в плазме крови и тканях, коррелирует с силой и длительностью стрессового воздействия /Abraham et al., 1981; Nemeth et al., 1981/. Между тем некоторые биохимические аспекты влияния экстремальных факторов на метаболизм печени остаются нерешенными. Среди них особый интерес представляет вопрос об изменениях, возникающих в обмене нуклеиновых кислот.
Сам факт более сложного устройства эукариотической клетки по сравнению с бактериальной, наличие высокоорганизованного набора хромосом и ядерной мембраны, большая продолжительность жизни и многостадийный процессинг мРБК позволяет предположить, что реализация генетической информации у эукариот происходит в несколько этапов и каждый из них контролируется своими регу- ляторными механизмами. Регуляция активности генов в ходе индивидуального развития, клеточной дифференцировки, изменений условий окружающей среды происходит, в частности, на уровне транскрипции хроматина.
В настоящее время известно, что процесс транскрипции у всех без исключения высших организмов осуществляет система множественных РШ-полимераз, Строгая классификация этих ферментов вызывает до сих пор много споров, поскольку применяемые в разных работах критерии не всегда согласуются. Различают три основных класса эукариотических полимераз, транскрибирующие различные и неперекрывающиеся участки ядерного генома. Однако механизм транскрипции сходен для всех трех классов и включает: узнавание соответствующей промоторной последовательности ДНК и связывание с ней; инициацию синтеза (образование первой фосфодиэфирной связи); элонгацию вновь синтезированной цепи; терминапию транскрипции и освобождение РНК-продукта.
В последние годы показано, что тонкая структура хроматина является необходимой основой функционирования высокоспецифичных систем контроля транскрипции у высших организмов. Многочисленными исследованиями установлено неспецифическое влияние хромосомных белков на транскрипцию; однако, вопрос об их специфическом регуляторном действии (в основном это касается негиетоновых белков) остается открытым. Большой вклад в изучение механизма селективной транскрипции внесли исследования в области стероидных гормонов, которые, как оказалось, очень тонко регулируют активность определенных генов, индуцируя или подавляя биосинтез рибонуклеиновых кислот и белков и являясь одновременно мощными регуляторами обмена веществ во многих органах и тканях. Согласно классическим представлениям /Селье, 1977/, развитие общего адаптационного - 8 -синдрома реализуется через стрессовые гормоны, причем важная роль в формировании механизмов адаптации принадлежит генетическому аппарату клеток органов-мишеней (печень, лимфоидные органы и др.), В связи с этим данная работа посвящена исследованию РНК-синтезирующей системы ядер печени крыс при действии факторов космического полета и гиподинамии.
Конкретными задачами настоящего исследования были:
1. Выяснить влияние факторов космического полета на эндо генный синтез РНК в изолированных ядрах печени крыс: сразу после окончания полета, в период реадаптации к земным условиям, при дополнительном повторяющемся стрессовом воздействии (иммобилизации).
2. Изучить влияние факторов космического полета на матрич ную активность хроматина.
Эти исследования проводились на базе Института Медико-биологических проблем МЗ СССР в экспериментах на биоспутниках по программе Интеркосмос.
3. Изучить влияние гипокинезии различной длительности: а) на эндогенный синтез РНК изолированными ядрами печени; б) на активность солюбилизированных РБК-полимераз; в) на матричную активность хроматина.
Влияние факторов космического полета на печень
С целью научного обоснования принципов и методов медико-биологического обеспечения длительных космических экспедиций в период с 1973 года по настоящее время в Советском Союзе был осуществлен запуск пяти биоспутников серии "Космос", длительность полета которых составляла от 18,5 до 22 суток.
Ставились задачи изучения механизмов влияния невесомости и других факторов космического полета на структурно-функциональное состояние организма животного, была предпринята оценка возможности использования искусственной силы тяжести для предотвращения воздействия невесомости, исследовалось модифицирующее влияние невесомости на радиочувствительность млекопитающих, а также закономерности адаптации организмов к действию комплекса факторов космического полета.
В условиях полета на организм могут действовать следующие факторы: невесомость, радиация, шум, вибрация и перегрузки на этапах запуска и приземления, ограниченный объем движения, биологический ритм и др.Для дифференцировки эффектов невесомости от эффектов сопутствующих факторов, в макете спускаемого аппарата биоспутника одновременно с полетом проводился синхронный эксперимент.
Анализ экспериментальных данных, полученных на биоспутниках серии "Космос", позволил выявить у животных ряд изменений, которые условно, для удобства, были разделены на две группы: -специфические, связанные с воздействием невесомости,и неспецифические, связанные с развитием стресс-реакции на различных этапах полета. Условность деления объясняется тем, что так называемые специфические изменения могут возникать не только при невесомости, но и в земных ситуациях (например, при гипокинезии). Наиболее выраженные специфические изменения отмечались в опорно-двигательном аппарате, миокарде, эритроцитарной системе. Неспецифические изменения проявлялись в различных органах и тканях в виде умеренно выраженной стресс-реакции и, как было показано, составляли значительную часть функциональных и структурных перестроек, выявляемых при послеполетном обследовании животных /іуровский с соавт., 1979; Газенко и соавт.,1981/.
Стресс-реакция - это совокупность всех неспецифических изменений, возникающих в организме под влиянием любых воздействий (стресооров), включающих стереотипный комплекс неспецифических защитно-приспособительных реакций. Такой комплекс реакций, направленный на создание резистентности организма к стрессовому фактору, обозначен Г.Селье /1977/ как общий адаптационный синдром, В динамике его развития прослеживаются три стадии: I) реакция тревоги; 2) стадия резистентности; 3) стадия истощения. Для реакции тревоги характерен острый процесс, направленный на активную мобилизацию адаптационных систем к стрессору, но при слишком сильном и длительном воздействии возможно снижение резистентности организма, которое отмечено на третьем этапе -стадия истощения.
Длительность и степень выраженности каждой стадии зависит от силы и природы стрессора, от вида и физиологического состояния организма и координируется нейро-эндокринной системой.
Эндокринный контроль метаболических процессов в животном организме при стрессе реализуется с помощью сложно организованных специфических ансамблей гормонов. Взаимодействие гормонов в каждом функциональном комплексе и между комплексами тонко сбалансировано на различных уровнях (периферическом, гипотала-мо-гипофизарном и др.) и тесно связано с деятельностью центральной нервной системы. Во взаимодействии различных уровней адаптации от клеточного и тканевого до интегрального организменного важное место занимает симпато-адреналовая система. Теснейшим образом с ней связана вторая адаптационная система - гипоталамо-гипофизарно-кортикостероидная. Однако физиологический смысл различных влияний этих двух систем при стрессе теряется, если их рассматривать изолированно от эффектов других гормонов. Так,инсулин и глюкагон также контролируют большое количество неспецифических реакций в организме, испытывающем на себе влияние повреждающих факторов внешней среды /Панин, 1983/.
Как оказалось, при действии факторов космического полета в организме животного развиваются стрессовые реакции /Махо с соавт., 1982; Федоров с соавт., 1980/. При этом в отдельных органах и системах, призванных поддерживать адаптационно-гомеоста-тические реакции организма, в ответ на действие стрессоров отмечается функциональное напряжение. Один из таких органов, чья функциональная активность в значительной степени обусловливает состояние всего организма - печень.
Печень является жизненно важным, полифункциональным органом, занимающим центральное место в обмене веществ организма человека и животного. К числу существеннейших функций печени следует отнести: гомеостатическую, метаболическую, экскреторную, барьерную и депонирующую. Многообразие функций печени связано с ее анатомическим положением, особенностями строения, кровоснабжения и лимфообразования. Основой структуры ткани печени является пластинка, представляющая собой у крысы один слой паренхимных клеток - гепатоцитов. Печеночные клетки отличаются необычайной чувствительностью к влиянию различных неблагоприятных воздействий, что при патологических процессах приводит к изменению структуры, химического состава печени.Печеночные пластинки разделяют синусоидные кровеносные капилляры. Кроме того, печень имеет два венозных и одно артериальное русло, образуя промежуточную станцию между портальным кругом и общим кровообращением организма. Такое своеобразное кровообращение печени, по данным ряда авторов, отражается на метаболизме органа при различных экстремальных состояниях / Elias, 1963; Привес, 1971; Книпше, 1982/.
Благодаря тесной связи печени с кровью, а также с другими внутренними органами становится возможным ее участие в обмене веществ. Важнейшую роль играет печень в обмене липидов, углеводов, белков, аминокислот и биологически активных веществ -гормонов, биогенных аминов, витаминов. Печень является одним из потенциальных органов-мишеней для глюкокортикоидов, в ней осуществляется ферментативное инактивирование этих гормонов, а также инсулина и глюкагона, происходят метаболические превращения катехоламинов /Виру, 1980; Курцер, 1982/. Функциональная активность печени регулируется центральной нервной системой и гормональным звеном, причем действие гормонов сводится, по-видимому, к участию их в метаболических процессах печени.
Обмен белков и нуклеиновых кислот при действии факторов космического полета и гипокинезии .
Особенности морфологии, перестройки метаболизма липидов и углеводов, изменения гормональной секреции ряда стрессовых гормонов при действии факторов космического полета и гипокинезии свидетельствуют о функциональном напряжении печени, направленном на поддержание гомеостаза всего организма. Учитывая коррел-ляцию между функциональным состоянием органа и активностью бе-локсинтезирующей системы клетки, особый интерес представляет рассмотрение вопроса о состоянии белково-нуклеинового обмена печени при экстремальных воздействиях.
В экспериментах на биоспутниках "Космос" было показано, что включение 2х -С-лейцина как в суммарную фракцию ядерных белков, так и во фракции гистонов и белков ядерного сока печени животных, экспонированных в условиях 22-х дневного космического полета и синхронного контроля одинаково, но снижено по сравнению с виварним контролем /Раппопорт с соавт., 1977/. Эти изменения, отмечаемые на вторые сутки полета, сохраняются и в восстановительный период через 26 суток.
Определение активности полисом и микросом клеток печени жи - 42 -вотных , экспонированных в полете в течение 19,5 суток, проводили в системе in vitro /Сабо с соавт., 1979/, В первые сроки после окончания экспериментов не обнаружено различий в активности белоксинтезирующей системы животных полетного и синхронного экспериментов. В то же время через 26 суток после окончания экспериментов авторы отмечали снижение функциональной активности фракции рибосом, которое, однако, было скомпенсировано повышением активности фракции микросом.
Поскольку сведения о состоянии белкового обмена в печени животных при действии ФКП представлены единичными работами, в настоящее время не представляется возможным сделать общие выводы о характере возникающих изменений. Однако, принимая во внимание тот факт, что наиболее близкой моделью для изучения невесомости в наземных условиях является гипокинезия, исследования белкового обмена в такой модельной системе в некоторой мере могут компенсировать отсутствие информации, полученной в космических экспериментах.
Белковый обмен при гипокинезии изучен в ряде работ И.В.Федорова и его сотрудников /1973, 1977, 1978/. Показано, что в начальные сроки обездвиживания (3 сутки) синтез белка в печени был на уровне контроля, но при увеличении сроков гипокинезии (10, 15, 60, 90 суток) отмечали умеренное снижение синтеза белка и одновременно некоторое усиление интенсивности его распада Содержание белка в ткани печени, определяемое микробиуретовым методом также достоверно не менялось /Федоров, Шурова, 1973а/.
В работе Г.А.Макарова /1974/ установлено, что І5-, 30- и 45-дневная гипокинезия не вызывает снижения синтеза митохондри-альных белков печени, в отличие от скелетных мышц и миокарда, где отмечали существенное уменьшение интенсивности включения метки. В то же время Г.Д.Шитов /1979/ обнаружил увеличение скорости обновления митохондриальных белков печени, а также растворимых белков цитоплазмы, белков ядерного сока и гистонов к 1-й неделе гипокинезии. При более длительных сроках(3-4 неделя) эти изменения нивелировались.
Отчетливое уменьшение синтеза белка в клетках печени найдено при 3-часовой иммобилизации (жесткие условия гипокинезии) /Huszti, Kenessen, 1981/, что вызвано острым стрессом. Однако, как и при гипокинезии, снижение синтеза белка в почках, ткани мозга, надпочечниках проявлялось более отчетливо, чем в печени. Показано, что в печени, в первую очередь, происходят сдвиги в метаболизме аминокислот, а затем уже изменения в синтезе белка.
При гипокинезии также отмечено изменение в спектре аминокислот, характерных для ткани печени. Так, общая сумма свободных аминокислот несколько повышается в первую неделю обездвиживания, при этом особенно заметно повышение содержания лейцина и аспарагиновой кислоты /Федоров, 19736 /. При 60-90-оуточной гипокинезии, наоборот, общая сумма аминокислот снижена в основном за счет заменимых аминокислот. Б.М.Кунер /1982/ проводил количественное определение аминокислот на 10, 15 и 28-е сутки гипокинезии. Общая сумма аминокислот оказалась сниженной во все сроки обездвиживания. Особенно существенно страдал уровень пис-теина и глицина, снижавшийся во все сроки исследования, что, по мнению автора, может быть связано с использованием этих аминокислот для обезвреживания токсических продуктов, образующихся в организме при гипокинезии. Содержание аланина, триптофана, тирозина снижалось на 10 и 15-е сутки. На 15-е сутки было также снижено содержание аспарагиновой кислоты, серина, гистидина и лизина, в то время как количество метионина, фенилаланина и ва - 44 -лина увеличивалось через 10 и 28 суток, а глютаминовой кислоты, треонина и аргинина через 10 суток.
Как известно, аминокислоты являются строительным материалом для синтеза белка и поэтому дефицит и дисбаланс в их содержании в результате усиленного гипокинезией глюконеогенеза или при обезвреживании токсических веществ может являться одной из причин, способствующих снижению синтеза ряда белков печени /Хакимов с соавт., 1982/. Однако, есть основания предполагать, что важную роль в этих процессах играет изменение обмена нуклеиновых кислот. На возможность существования связи физиологической функции и генетического аппарата клетки указывает в своих работах Ф.З.Меерсон/1973,1975/.
Первые работы по исследованию влияния факторов реального космического полета на метаболизм нуклеиновых кислот животных, экспонированных в течение 22-х дней на борту биоспутника "Кос-мос-605", проведены в нашей лаборатории. Показано, что содержание ДНК в тканях печени крыс, перенесших космический полет, не отличается от контрольного уровня. Однако найдено обратимое снижение общего количества РБК в клетках печени, отмечаемое в 1-е сутки после окончания полета (к 26-м суткам показатель нормализуется) /Ко-молова с соавт., 1977/. Также установлено, что действие комплекса факторов космического полета не вызывает в ДНК печени изменений , характерных для радиационного поражения организма. Так, в ДНК клеток печени не обнаружены одно- или двухнитевые разрывы или сдвиги в надмолекулярной структуре ДНК, а также характерные для действия радиации изменения в активности ДНК-аз.
Влияние факторов космического полета на синтез РНК в ядрах клеток печени крыс
Среди реакций, возникающих при действии факторов космического полета важное место принадлежит стресс-реакциям, поскольку в космическом полете животные в течение продолжительного времени находятся в экстремальных условиях. Полагают,что в условиях невесомости космического пространства развивается хронический стресс, в то время как на участке приземления биоспутника - острый. Сложный комплекс воздействий, имеющих место в космическом полете, определяет своеобразие течения и развития ответной реакции организма, которая в значительной степени зависит от резистентности организма, состояния гормональной регуляции и др.
Длительный хронический стресс или введение в организм кор-тикостероидов вызывает значительные изменения в метаболизме нуклеиновых кислот органов-мишеней /Германюк, 1977/.
В связи с этим представлялось интересным исследовать изменения, вносимые факторами космического полета в генетический аппарат клеток печени, в особенности же их влияние на процесс транскрипции.
О влиянии факторов космического полета на процесс транскрипции судили по эндогенному синтезу РНК изолированными ядрами. Эта система способна в течение длительного времени поддерживать синтез РНК, корректно отражая картину, имеющую место в живом организме. Эндогенный синтез происходит в основном за счет элонгации молекул РНК, инициированных in vivo, а не за счет инициации НОВЫХ цепей in vitro /Gilboa et al., 1977; Bitter,Roeder, 1978/.
В клетке эукариотов, как уже отмечалось, существует три основных тала FHK: мРНК, рРНК и тРНК, синтез которых осуществляется в ядре в виде предшественников тремя различными классами ферментов - РНК-полимераз. Ферменты различаются по внутриядерной локализации, субъединичной структуре, подвижности при хроматографии, а также по требованию к ионным условиям. Кроме того, эти ферменты проявляют разную чувствительность к токсину cL-аманитину, РНК-полимераза П угнетается при низких концентрациях ингибитора, РНК-полимераза Ш, наоборот, - при высоких, а РНК-полимераза I устойчива к токсину. Таким образом, добавляя в инкубационную среду dL-аманитин, можно установить вклад каждой из РНК-полимераз в тотальный ядерный синтез РНК.
Следует отметить, что имеются данные, свидетельствущие о низкой активности РНК-полимеразы Ш в некоторых тканях, в том числе и в печени. Предполагают, что этот фермент находится в нуклеоплазме ядра в лабильном состоянии и может теряться в процессе выделения ядер /Duceman and Jacob, 1980/. Поэтому наши результаты в основном относятся к активности РНК-полимераз I и П, синтезирующих в ядре пре-рРНК и пре-мРНК соответственно.
Данные по эндогенному синтезу РНК изолированными ядрами печени крыс (рис.6а), свидетельствуют о том, что в первые сутки после окончания полета и наземного синхронного эксперимента, синтез РБК несколько увеличивается по сравнению с контролем. Это увеличение составляет 26% у животных, перенесших космический полет и 19$ у животных синхронного эксперимента. Тенденция к увеличению синтеза РНК в полете по сравнению с синхронным контролем , возможно обусловлена резким переходом от невесомости к земной гравитации. На значение этого фактора в развитии острой стресс-реакции во время приземления биоспутника указано в ряде работ /Газенко с соавт., 1978; Серова, 1983/.
Синтез РНК, в исследуемый период, в присутствии cL-амани-тина у животных всех вариантов ингибируется примерно на 46$ (рис.66). Добавление в инкубационную смесь ингибитора не оказывало влияния на повышение тотального ядерного синтеза РНК, вызываемое действием факторов космического полета, следовательно вклад мРНК и рРНК в отмечаемый эффект одинаков (табл.2).
Вероятно, активация транскрипции в ядрах обусловлена повышенным уровнем глюкокортикоидных гормонов, для которых печень является прямой мишенью. Поскольку характер реакции системы тотального ядерного синтеза РНК у животных сразу после окончания полета, соответствует изменениям синтеза РНК, отмечаемым при однократном введении животным глюкокортикоидов / ЬоеЪ and ТоlentІ-по, 1970; Mansour and Naas, 1974/.
Аналогичные результаты получены и в наших экспериментах при введении интактным животным внутрибрюшинно препарата гидрокортизона (" Rusael", США), по 5 мг на 100 г веса животного за 3 часа до забоя. Включение иН-УМФ в РНК ядер печени у опытных животных было в 1,7-1,9 раз выше, чем в контроле. Увеличенный выброс кор-тикостероидов надпочечниками животных отмечен в первые часы после окончания полета и отражает, по мнению авторов, острую стресс-реакцию животных на приземление биоспутников /Газенко с соавт., 1978; Кветнянски, 19826; Тигранян с соавт., 1982/.
О том, что указанная реакция развивается остро на завершающем этапе полета свидетельствует тот факт, что они наблюдаются только в ближайшие часы после приземления, в то время как в ре-адаптационном периоде (через 6 суток), эндогенный синтез РНК в ядрах печени крыс, перенесших космический полет нормализуется по сравнению с этим же показателем у животных виварного контроля (табл.2). Аналогичная тенденция, но несколько более четко выраженная отмечается и у животных синхронного эксперимента.
Активность солюбилизированных РНКнполимераз ядер клеток печени
Общепринято , что ДНК-зависимый синтез РНК происходит в результате совместного действия двух компонентов: матрицы - ДНК хроматина и ферментов РНК-полимераз. Поэтому различия, обнаруженные в уровнях синтеза тотальной ядерной РНК у животных виварного контроля и находившихся в условиях гипокинезии, могут быть обусловлены, как различиями в активности РНК-полимераз, так и состоя» нием матрицы - доступности ее для фермента, или и тем и другим одновременно. Для выяснения этого вопроса проведено раздельное исследование каждого из двух компонентов.
Получение РНК-полимераз проводили методом солюбилизации, исключающим многоэтапную очистку ферментов и последующее хроматогра-фическое разделение с целью максимально приблизить исследуемую систему к нативному состоянию. Определение активности ферментов проводили в неочищенных экстрактах. При таком приеме сводится к минимуму количество операций между солюбилизацией ферментов и определением их активности, что дает возможность обнаруживать относительно небольшие различия. Кроме того, как оказалось /shields, Tata, 1976/, в процессе очистки и фракционирования ферментов происходят неравномерные потери их активности, что затрудняет корректное сравнение разных препаратов РНК-полимераз.
Эндогенную матрицу-хроматин удаляли центрифугированием, которое следовало за обработкой ядер на ультразвуковом дезинтеграторе в растворе высокой ионной силы, В супернатанте, полученном после центрифугирования определяли активность солюбилизированных РНК-полимераз, используя в качестве экзогенной матрицы ДНК тимуса теленка.
На рис.13 представлены результаты по определению активности солюбилизированных РБК-полимераз ядер клеток печени в различные сроки обездвиживания по сравнению с аналогичным показателем у животных виварного контроля. Из диаграммы видно, что на 10-е сутки обездвиживания активность солюбилизированных РНК-полимераз снижена по сравнению с контрольным уровнем. Эффект составляет примерно 30$ и степень изменения активности ферментов соответствовала степени снижения эндогенного синтеза РНК в системе изолированных ядер.
Для дифференциального определения активности ядрышкового (I) и нуіслеоплазматического (її) ферментов был использован такой же прием, основанный на применении сС-аманитина, как и при исследовании эндогенной РШС-полимеразной активности целых ядер. Результаты эксперимента представлены в табл.6. При добавлении ингибитора в инкубационную среду активность ядрышковой РНК-полимеразы (І) у животных, находившихся в условиях 10-ти суточной гипокинезии была примерно такой же, как у животных виварного контроля,т.е. эффект гипокинезии снимался. Этот факт свидетельствует о том, что снижение общей активности солюбилизированных РНК-полимераз, наблюдаемое при 10-ти суточной гипокинезии, происходит главным образом за счет угнетения активности нуклеоплазматического фермента и при этом снижается синтез мРНК. Последнее согласуется с резуль
Не менее важным, чем РНК полимераза, компонентом РНК-синте -зирующей системы ядер, является хроматин, ДНК которого выполняет функцию матрицы в процессе транскрипции - 99 Транскрипция - многостадийный процесс и в нем как в любом матричном синтезе различают три основных этапа: инициацию, элонгацию и терминацию, причем лимитирующей скорость стадией является преимущественно инициация, исследование которой в связи с этим представляет значительный интерес. Использование системы матричного синтеза РНК in vitro , предложенной / Cedar, Felsenfeld, 1973/ позволяет разграничить стадии транскрипции и оценить уровень инициации синтеза РНК путем определения доступности ДНК хроматина для бактериальной РНК-полимеразы. Применение гетерологичного фермента правомочно, поскольку показано /Chan et al., 1976; Crouse et al., 1979/, что как бактериальная, так и гомологичная РНК-поли-мераза способны узнавать in vitro , активные участки хроматина и осуществлять с них транскрипцию.
Установленная на предыдущих этапах работы корреляция между эндогенным синтезом РНК в изолированных ядрах и активностью РНК-полимераз, не исключает возможность существования обусловленных гипокинезией различий в структурно-функциональном состоянии хроматина. В связи с этим представлялось интересным выяснить, имеются ли изменения в матричной активности хроматина печени при различных сроках обездвиживания животных.
