Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 4-7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ..... 8"38
Глава I. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИЯ ЦИТОХРОМА Р-450 8-14
Глава 2. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ПИТАНИЯ НА СОДЕРЖАНИЕ ЦИТОХРОМА
Р-450 И АКТИВНОСТЬ М0Н00КСИГЕНАЗН0Й СИСТЕМЫ
МИКРОСОМ . 15-25
Глава 3. ОБНОВЛЕНИЕ МИКРОСОМАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ .... 26-38
ВЫБОР ОБЪЕКТА ИССЛЕДОВАНИЯ 39-40
ЭШШРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 41-55
Глава 5. ВЛИЯНИЕ КОЛИЧЕСТВА И КАЧЕСТВА БЕЛКОВ В РАЦИОНЕ НА СКОРОСТИ ОБНОВЛЕНИЯ ЧАСТИЧНО ИЗОЛИРОВАННОГО ЦИТОХРОМА Р-450 МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ .... 56-82
5.1. Влияние разбалансированных по белку рационов на
индукцию и скорость деградации белков частично
изолированного цитохрома Р-450 микросом печени
крысы -56-64
5.2. Влияние высокого уровня белка в рационе на параметры
обновления белков частично изолированного цитохро
ма Р-450 и микросом печени крысы 64-71
5.3. Влияние качества пищевого белка на параметры обнов
ления белков и фосфолипидов частично изолированного
цитохрома Р-450 и микросом печени крысы 72-82
Глава б.ВЛИЯНИЕ КОЛИЧЕСТВА И КАЧЕСТВА. УГЛЕВОДОВ ПИЩИ НА
ПАРАМЕТРЫ ОБНОВЛЕНИЙ БЕЛКОВ ЦИТОХРОЩ Р-450
МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ Г . 83-91
Глава 7. ЗАВИСИМОСТЬ ПАРАМЕТРОВ ОБНОВЛЕНИЯ КОШОНЕНТОВ
ЧАСТИЧНО ИЗОЛИРОВАННОГО ЦИТОХРОЩ Р-450 МИК
РОСОМ ПЕЧЕНИ КРЫШ ОТ СООТНОШЕНИЯ УГЛЕВОДЫ:
ЖИРЫ В РАЦИОНЕ 92-99
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ІООчЕІО
ВЫВОДЫ ІІІ-ІІ2
ЛИТЕРАТУРА ІІ4-ІЗІ
_ 4 -
Введение к работе
Актуальность темы. Проблемы обеспечения человека высококачественными пищевыми продуктами тесно связана с выяснением роли отдельных пищевых веществ в репродукции и адаптивных реакциях человеческого организма на самых различных уровнях его организации. Социально-экономический прогресс и успешное выполнение Продовольственной программы СССР предполагает дальнейшее расширение ассортимента продуктов питания, при этом наряду с традиционными предполагается разработка новых источников белков, жиров и углеводов для питания человека.
К настоящему времени достаточно широко изучены механизмы действия отдельных компонентов пищи на ткани, клетки, химический состав мембран (24). В этом плане интенсивно исследуется вопрос о влиянии химического состава рациона на количество цитохрома Р-450 и активность гидроксилазной системы микросом (3, 103, 129, 134, 145). Известно, что по своей молекулярной организации биомембраны являются местом сосредоточения ферментных комплексов, обеспечивающих важнейшие проявления функции клетки. Одним из мембрано-структурированных ферментов является фосфолипид-зависимый питохром Р-450, входящий в состав монооксигеназной системы микросом печени. Монооксигеназная системы участвует в синтезе биологически активных соединений (стероидов, простагландинов и др.), в перекиснем окислении ненасыщеных жирных кислот, детоксикации чужеродных соединений (I, 17). Принято считать, что питохром Р-450-зависимые ферменты выполняют в организме функции посредника между внутренней и внешней средой организма. При этом режим
- 5 -обновления клеточных мембран и содержащихся в них ферментных комплексов обеспечивает поддержание гомеостаза, являясь тем самым одним из важнейших условий приспособления организма к изменяющимся условиям существования. Не вызывает сомнений и тот факт, что именно модуляция скоростей обновления субклеточных компонентов является важным условием успешной адаптации организма к изменяющимся внешним воздействиям и, в частности, к факторам питания (5, 117).
В связи с этим изменения параметров обновления белков и фос-фолипидов, входящих в состав цитохрома Р-450 и его окружение, могут свидетельствовать о перестройке организма в ответ на качественные и количественные изменения в рационе. Более того, изучение влияния характера питания на параметры обновления компонентов цитохрома Р-450 может дать информацию о механизмах раз вития адаптационных реакций к внешним воздействиям, а также свидетельствовать о возможности нарушения механизма гомеостаза, стабильность которого во многом определяется обеспечением организма пластическими веществами и энергией.
В связи с этим целв]настоящего исследования состояла:
а) в изучении влияния количественных и качнственных измене
ний в составе пищи на параметры обновления белков и фосфолипи-
дов частично изолированного цитохрома Р-450 и микросомальных
мембран печени крысы;
б) в изучении возможных вариаций содержания и функциональной
активности цитохрома Р-450 в ответ на введение чужеродных соеди
нений на фоне качественно различного питания.
Конкретные задачи исследования включали:
изучение параметров обновления белков и фосфолипидов частично изолированного цитохрома Р-450 с использованием радиоактивных предшественников;
изучение влияния количества и качества белка в рационе на параметры обновления белковых и фосфолипидных компонентов микро-сомальных мембран и частично изолированного цитохрома Р-450, а также на содержание и активность микросомальной моноокоигеназной системы;
изучение влияния количества и качества углеводов пищи на параметры обновления и активность моноокоигеназной системы микросом;
изучение влияния соотношения углеводов и жиров в рационе на скорости синтеза и деградации белков и фосфолипидов частично изолированного цитохрома Р-450 и микросомальных мембран, а также на активность гидроксилазной системы микросом.
Научная новизна работы состояла в том, что впервые для оценки качества рациона применена очистка цитохрома Р-450 и исследование параметров обновления его компонентов с помощью радиоактивных предшественников. Впервые показано, что химический состав пищи избирательно влияет на скорости обновления белковых либо фосфолипидных составляющих как микросомальных мембран, так и частично изолированного цитохрома Р-450.
Подтвеждено существенное влияние химического состава пищи на активность и ферментный состав микросомальных мембран и степень их отклика на введение чужеродных веществ.
Научно-практическая значимость. Основная часть работы носит экспериментальный характер и посвящена выяснению влияния компо-
нентов пищи на ферментный состав и время жизни белков и фосфо-липидов микросомальных мембран и цитохрома Р-450.
Работа выполнена по координационному плану научно-исследовательских работ по проблеме "Структура и функция биологических мембран" на I98I-I985 г.г, (проблема Ik 2.28.8) и общесоюзной отраслевой комплексной программе (СЮ) "Развития научных исследований и ускорения внедрения достижений медицинской науки в отрасли агропромышленного комплекса до 1990 г."
На основании проведенных исследований показано существенное влияния химического состава пищи на функциональное состояние гид-роксилазной системы микросом. Установлено, что изменение скорости синтеза и деградации белков и фосфолипидов, входящих в состав микросомальных мембран и частично изолированного цитохрома Р-450-вызывает увеличение или уменьшение содержания ферментов микросомальных ансамблей при смене характера питания. Доказано, что обновление микросомальных мембран и частично изолированного цитохрома Р-450 происходят независимо.
Впервые показано, что определение скоростей синтеза и деградации компонентов мембран эндоплазматического ретикулума может служить дополнительным экспериментальным подходом для оценки качества пищи.
Полученные данные дредсталяются важными для обоснования норм профилактического питания населения, контактирующего с вредныии веществами , при поступлении контаминантов с пищей, а также для целей клинической фармакологии.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава I. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИЯ ЦИТОХРОМА Р-450
Поскольку основным объектом исследования данной работы являются процессы обновления химических компонентов мембран эндоплаз-матического ретикулума и цитохрома Р-4507 анализ сведений литературы целесообразно начать с данных по составу, структуре, функции и свойствам цитохрома Р-450.
Мембраны эндоплазматического ретикулума содержат системы переноса электронов, способные использовать молекулярный кислород для окисления специфических органических молекул путем прямого присоединения одного или обоих атомов кислорода к субстрату. Ферменты, присоединяющие к субстрату только один из двух атомов 02 и восстанавливающие другой атом до Н20, называются гидроксилазами, или монооксигеназами, или оксидазами со смешанной функцией (I). Они объединены в сложные полиферментные комплексы, содержащие в качестве терминальной оксигеназы гемопро-теид - цитохром Р-450, получивший свое обозначение в связи с тем, что в восстановленной форме он присоединяет окись углерода, после чего имеет максимум проглощения света при длине волны 450 нм (122). Содержание цитохрома Р-450 в клетке печени наивысшее среди других гемо- и флавопротеидов, на его долю приходится до 20$ всего белка микросомальной фракции печени, при этом гемо- и флавопротеиды монооксигеназной системы составляют в сумме не менее трети общей массы микросомальных белков (67)
ій *- \>s<*— фП^ «— НАД» <Н
,г+
Рисі. Последовательность реакций функционирования гидро-ксилазной системы макросом печени (20). АН и АОН субстрат и продукт реакции,соответственно; Fe2+ и Fe^" "" Дгоохром Р-450 (КФ I.I4.I4.I.) в восстановленном и окисленном состояниях; cfflj -НАДФ Н-цитохром Р-450-редуктаза (КФ I.6.2.4.); ФП2 - НАД Н-цитохром ъ 5-редуктаза (КФ 1.6.2.2.); ъ 5 - цитохром ъ; е - электрон.
Механизм функционирования гидроксилазной системы мембран эндоплазматического ретикулума крайне сложен и состоит по крайней мере из пяти этапов:
связывание субстрата АН с окисленной формой цитохрома Р-450;
восстановление цитохрома Р-450 в образовавшемся фермент-субстратном комплексе первым электроном, поступающим из НАДФ Н специфичной цепи переноса электронов с участием ріедуктазн ФП-т-;
присоединение молекулы 02 восстановленным фермент-субстратным комплексом; 4) активирование молекулярного кислорода путем его восстановления вторым электроном, поступающим из НАД Н специфичной цепи переноса, по-видимому, включающей цитохром ъ5»
- 10 -5) внедрение активированного кислорода в субстрат с образованием продукта реакции и молекулы воды (20).
Как было отмечено выше ферментная система мембран эндоплазма-тического ретикулума является местом гидроксилирования самых разнообразных по своей природе химических соединений. Например, ал-кильные боковые цепи барбитуратов и некоторых других лекарственных веществ окисляются с образованием спиртов. При окислении соединений с ароматическими кольцами, к которым относятся полициклические углеводы, содержащиеся, например в табачном дыме, в выхлопных газах транспорта, отходах химических промышленных предприятий и др., гидроксильная группа появляется в кольце. В других случаях происходит отщепление аминогрупп или алкильной группы от атомов азота или кислорода, или образование суль-фоксидов.
Проведенные в последние годы экспериментальные исследования показали, что на активность ферментов монооксигеназной системы микросом печени могут оказывать влияние самые разнообразные химические соединения, при этом многие из них, попадая в организм, вызывают обратимое увеличение содержания цитохрома Р-450 и активности гидроксилазной системы микросом (18). Например, при введении фенобарбитала крысам, количество цитохрома Р-450 увеличивается в 3-4 раза, а содержание редуктазы вдвое, и вследствие этого инактивация таких препаратов как р-нитроанизол и этил-морфин происходит в 3-4 раза быстрее, чем обычно (42,101, 112). В 1967 году было описано белее 200 химических соединений, способных вызывать в организме млекопитающих обратимое увеличение содержания ферментов, входящих в состав гидроксилазной системы микросом. Среди них оказались наркотические и снотворные лекарст-
- II -
венные вещества, противосудорожные и стимулирующие центральную нервную систему, антипсихотические и противоспалительные средства и многие другие (51). В последние годы этот список пополнился десятками новых названий (4).
Индуцированное ксенобиотиками увеличение активности оксидаз со смешанными функциями, как правило, связано с пролиферацией мембран эндоплазматического ретикулума в гепатоцитах и гипертрофией печени (91, 125, 119). Гипертрофия печени, вызванная введением фенобарбитала, например, является главным образом следствием увеличения объема клеток более чем на половину, и может быть объяснена пролиферацией эндоплазматического ретикулума (127, 143), Существуют и другие данные доказывающие, что помимо увеличения размеров клеток при индукции происходит также увеличение числа клеток печени (38, 154).
Специфическая активность гидроксилазной системы микросом увеличивается в несколько раз при введении индукторов, в то время как активность многих других ферментов, не участвующих в процессе окисления чужеродных соединений, не изменяется, а в некоторых случаях даже снижается. Таким образом, изменения в гепатоцитах состоят не просто в валовом увеличении мембран эндоплазматического ретикулума, имеющих нормальный ферментный состав, а в избирательном увеличении числа некоторых микросомальных белков (119,93). Исследование этого явления выявило существенную роль синтеза белков после введения индукторов. Было также показано, что в процессе индукции синтезируются ферментные белки, идентичные энзимам, синтезирующимся в яеиндуцированном состоянии (52, 92, 93, 119).
С другой стороны имеются данные, свидетельствующие о том, что при индукции не образуются мембраны, обогащенные индуцируемыми ферментами. Это удалось показать при изучении распределения глю-козо-6-фосфатазы в подфракциях микросомальных мембран (125).
Значительный вклад в формирование современных представлений об индукции, свойствах и механизме действия монооксигеназ со смешанными функциями внесли эксперименты по реконструкции изолированных и частично очищеных компонентов гидроксилазной системы микросом и,в первую очередь,цитохрома Р-450 (34, 35, 78, 83, 118).
Белки мембран можно разделить на две группы по их расположению относительно липидного слоя. К первой группе относятся белки, связанные только с поверхностью мембраны; вторую составляют белки, погруженные в толщу мембранного слоя. К какой из двух групп относится тот или иной белок,можно судить по их поведению при химической обработке мембран или с помощью рентгенострук-терного анализа, или электронной микроскопии. Так, цитохром Р-450 является внутренним белком мембран, его довольно сложно отделить от других ферментов мембран эндоплазматического рети-кулума.
Впервые реконструкция монооксигеназной системы со -гидрокси-лирования лаурата, состоявшей из частично очищенного цитохрома Р-450, НАДФ Н-цитохром Р-450-редуктазы и фосфотидилхолина, была проведена в лаборатории Сооп (96). Для выделения отдельных фракций авторы использовали обработку микросом дезоксихолатом натрия с последующим фракционированием на колонке с ДЕАЕ-цел-люлозой в градиенте концентрации хлористого калия (96). Этот
- ІЗ -метод, как и многие другие,появившиеся вслед за ним, не нашли широкого применения, так как сопровождались значительной потерей активности препарата и низкой степенью очистки. Лишь сравнительно недавно в двух лабораториях разработаны способы очистки цитохрома Р-450 из индуцированных фенобарбиталом микросом печени кролика (78, 83). Оба метода позволяют получить гемопро-теид, содержание цитохрома Р-450 в котором достигает 17 нмоль/ мг белка. В последние годы появилось большое число сообщений о том, что удалось осуществить очистку цитохрома Р-450 из других объектов:печени крысы (29), печени кролика (10), дрожжей (40). Из водоросли Pseoudomonas putidaHe только выделили высокоочи-щенный цитохром Р-450, но и расшифровали полную аминокислотную последовательность этого протеина, состоящего из 412 аминокислотных остатков, описали его вторичную структуру (75).
Электрофоретический анализ высокоочищенных форм цитохрома Р-450, обработанных додецилсульфатом натрия и ^-меркаптоэтанолом, выявил несколько изоэнзимов, с различной электрофоретической подвижностью, и получивших название в порядке снижения подвижности и нарастания молекулярного веса (77). Анализ этих изоэнзимов показал, что форма Р-450 ьм2, например, соответствует основной полосе при электрофорезе микросомальных белков печени крысы, индуцированной фенобарбиталом натрия, а форма цитохрома Р-450 LM4-, микросомальным белкам из печени животных, индуцированных jS-наф-тофлавоном. другие фракции содержат относительно большее количество неиндуцированных форм гемопротеида (53,77).
Для некоторых форм, различающихся по электрофоретической
подвижности выявлена специфичность их действия в отношении субстратов. Из микросом печени кролика, например, выделено 6
- 14 -высокоочищенных форм цитохрома Р-450. Их анализ показал, что все они участвуют в гидроксилировании прогестерона по 6оС - и 6^5 -положениям, и лишь одна из них (форма I) с заметной скоростью катализирует образование дезоксикортикостероида из прогестерона (63).
В настоящее время для исследования функционального значения белковых и липидных составляющих микросомальной гидроксилазной системы широко используется метод реконструкции микросомальных мембран (22,29, 118). Так, негигкаг И соавторы применили метод реконструкции микросомальных оксидаз со смешанными функциями для выявления компонента системы, ответственного за угнетающий эффект, возникающий в результате кормления крыс малобелковыми рационами. В результате проведенного исследования было показано, что активность гидроксилазной системы микросом в слзг чае алиментарного воздействия регулируется не уровнем цитохрома Р-450 или цитохром с-редуктазы, а их взаимодействием (118).
