Введение к работе
^!<2253ьность_проблемы2 Количество исследований, посвященных изучения пептидергической регуляции функций организма, в последнее время стремительно увеличивается. Отчасти это вызвано тем, что уже сейчас число известных природных олигопептидов и их синтетических аналогов составляет несколько тысяч соединений. В отношении биологического действия пептиды полифункциональиы, т.е. способны влиять не на одну, а на несколько функций организма. Установлено, что они действуют через клеточные рецепторы и способны скорее модулировать функцию, а не включать и выключать ее, как классические гормоны, медиаторы я . нейротрансмиттеры.
В 1981 году опубликована структура пептидного морфогена гидры pGlu-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lya-Val-Ile-Leu-Phe ( Schaller Н.С., Bodeorauller Н. 1961 ), обладающего способностью активирогать процессы роста и дифференцировки клеток в головном участке тела пресноводной гидры Hydra attenuate, а тактсе стимулировать процесс почко-образования. Получены данные о влиянии пептидного морфогена гидры (ПМГ) на других беспозвоночных животных - морских гидроидных полипов и плоских червей планарий, у которых этот пептид влияет на морфогенез и стимулирует регенерацию утраченных органов (Тияао Х.П., I9G5). С помощью хроматографических и иммунохими"ЄСКих методов ПМГ обняру-жен в организме млекопитающих животных и человека, примем наиболее высокие концентрации пептида зарегистрированы в гипоталамусе и желудочно-кишечном тракте. Функции пептидного морфогена гидрн в организме млекопитающих животных неизвестны. Естественно, однако, предположить, что они могут оказаться сходными с теми, которые атот пептид имеет в организме беспозвоночных животных.
Настоящее исследование, также, затрагивает круг вопросов, относящихся к важной медико-биологической проблеме компенсации функций органа или ткани после повреждения. 3 основе компенсации функций органа после повреждения лежат анаболические (биосинтетичеекие) процессы, ведущие к восстановлению объема и количества клеточных элементов.В настоящее время выявлены гуморальные факторы, некоторые ростогые Факторы (гормоны, природные и синтетические антиокси-данты), влиявшие на интенсивность анаболических процессов, происходящих после повреждения органа. Перспективным для изучения в этой связи, представляется пептидный морФоген гидрн, способный активировать процессы биосинтеза макромолекул, влияющий нп митоти»ескуп активность клеток беепотроночных. С теоретической и практической точек зрния интепео представляет вопрос о том, способе;! ли
ПМГ влиять на рост, дифференцировку и регенерацию клеток и тканей млекопитающих.
Цель и задачи исследования: Изучение влияния пептидного морфогена гидры на анаболические процессы в интактной и регенерирующей печени крыс и выявление некоторых этапов молекулярного механизма действия пептида. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Определение динамики активации орнитиндекарбоксилазы - фермента, лимитирующего скорость синтеза клеточных полиаминов и служащего маркером интенсивности синтетических процессов в ткани, в интактной и регенерирующей печени крыс под влиянием ПМГ.
-
Изучение дозовой зависимости активации орнитиндекарбоксилазы в интактной и регенерирующей печени крыс под влиянием низких доз пептидного морфогена, а также выявление оптимальной дозы пептида.
-
Исследование включения Н-лейцина в белки интактной и регенерирующей печени крыс под влиянием оптимальной дозы пептида.
-
Определение содержания альбумина в сыворотке крови частично гепат-эктомированных крыс пол влиянием ПМГ.
-
Исследование включения Н-тимидина в ДНК регенерирующей печени под влиянием ПМГ и его синтетических аналогов.
-
Определение содержания цАМФ в ранние послеоперационные сроки в регенерирующей печени крыс под влиянием оптимальной дозы пептида.
-
Изучение связывания ПМГ с препаратом мембран интактной и регенерирующей печени крыс и определение параметров этого процесса.
-
Определение индукции эндогенного ПМГ в ЦНС под влиянием частичной гепатэктомии.
Научная новизна работы: В результате выполнения настоящего исследования впервые определена роль, ПМГ у млекопитающих (крыс) как активатора биосинтетических процессов, происходящих в ходе регенерации печени. В работе впервые показано, что ПМГ способен вызывать дополнительную активацию орнитиндекарбоксилазы - ключевого фермента обмена полиаминов, способного служить маркером анаболических процессов в регенерирующей печени крыс при интраперитонеальном введении пептида в низких дозах. Выявлена оптимальная доза ПМГ ( и нормализует содержание этого белка в более ранние сроки. Вместе с тем, пептид, вводимый интактным животным в указанной дозе, не способен активировать орнитиндекарбоксилазу и влиять на включение Н-лейцина в белки органа. Предпринята попытка экспериментального изучения причин наблюдаемого феномена. Так, впервые показано наличие обратимого и насыщаемого специфического связывания Н-ПМГ с препаратом мембран регенерирующей печени. Мембранные препараты ин-тактных тканей печени, почек, сердца и головного мозга не способны связывать пептид. Впервые определено содержание ГМГ в гипоталамусе крыс и показано, что снижение его содеряания рьганрает операция частичной гепат-эктомии. Практическая ценность исследования: Полученные результаты имеют определенное теоретическое значение для понимания молекулярного механизма действия ПМГ. В связи с присутствием эндогенного ПМГ в организме человека материалы исследования возможно могут найти применение в клинике для лечения заболеваний, связанных с нарушением функций печени, вызванных поражением ткани этого органа. К числу практически ценных результатов можно отнести выявление биологически активных синтетических аналогов ПМГ, которые способны как активировать,так и ингибировать синтез ДНК в регенерирующей печени крыс. Ети результаты опровергают ранее опубликованные данные, согласно которым структура пептида уникальна э отношении прояадения биологического эффекта и внутримолекулярные замены аминокислот вызывают исчезновение биологической активности. Полученные результаты создают возможность для направленного химического синтеза новых синтетических аналогов пептидного морфогена, обладающих теми же биологическими эффектами как природный олигопеп-тид, способных стать новыми лекарственными препаратами. Апробация работы: Материалы работы были представлены на I Всесосзной конференции "Нейропелтиды: их роль в физиологии и патологии" (Томск, 19Во); I Всероссийской конференции "Гомеостаз - его механизмы и коррекция" (Москва, 1986); Всероссийской конференции "Олигопептиды, как регуляторы функций организма" (Москва, ІУЙ7); Республиканской научной конференции "байкальские встречи-8;}" по проблеме "Управление морфогенезом органов и тканей в процессах адаптации" (Иркутск, 1989). Публикации.:_ По темэ диссертация опубликовано 6 научных работ. ^щкт^2а_и_обьеіл_диссертапионноЯ_работк Работа состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов исследования, семи разделов собственных исследований с их обсуждениями, заключения и выводов. Диссертационная работа изложена на русском языке на 142 страницах машинописного текста и включает 2 таблицы, 19 рисунков и список цитированной литературы из 215 источников. ' МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Все эксперименты выполнены на крысах-самцах линии Вистар, массой тела 160-180 гр. Объектом исследования являлись интактная печень и регенерирующая печень крыс, подвергнутых операции частичной гепат-эктонии (Higgina G.M., AnOesson R.M. »93>1.), ходе котороЯ эвцашяши 70. массы органа^ В части экспериментов иссяедошкив подвергали мембранные препараты интактной и регенерирующей печени, толовноето игоз-га, сердца и почек, а также экстракты гипоталамуса. Лептиды растворяли в физиологическом растворе и вводили интакт-«ым или частично гепатэктомированным животным интраперитонеально» Контрольные животные получали инъекцию эквимолярной смеси аминеташавлг. В работе использовали ПМГ, его аналоги - ПМГ-І и ПМГ-І7, синтезированные А.Ю.Рубиной в НИИ экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР под руководством профессора М.И.Титова. В экспериментах по связыванию использовали Н-ПЫГ (63 Ки/ммоль). Тритирование пептида осуществлено в Институте молекулярной генетики АН СССР. В экспериментах по радиоиммунологическому определению ПМГ применяли 12!5.1-производное .пептида. 'Определение активности орнитиндекарбоксилазы проводили по скорости образования COg при декарбоксилировании ь-^С-орнитина, применяя L-(I- С)-орнитин хлорид (55 мкКи/ммоль, "Amercham"). Для изучения включения предшественников в белки и ДНК использовали ^-лей-цин (49 Ки/ммоль) и "%-тимкдин (5,4 Ки/ммоль). Белок и ДНК в пробах определяли методами Седмак (Sedmak J.J., Qrossberg S.E. 1977) и ^аР~ тона (Burton К. 1956) соответственно. Определение содержания цАЫФ т ткани проводили с помощью набора реактивов "Amercham". Счет радиоактивности осуществляли на жидкостном сциниилляционном счетчике Rackbeta-1215 "1KB", Швеция, используя сцинциллятор следующего -оое-тава:Р0Р0Р - 0,2 г, РРО - 4 г, нафталин- 60 г, метанол - 100 млч этиленгликоль - 20 мл, 1,4-диоксан - до I литра. Электрофорез белков сыворотки крови в полиакриламидном ігеяє проводили в денатурирующих условиях, используя буферную систему Лем-мли (Laemmli U.K. 1970) 'в приборе для вертикального электоойорезв. "Blo-Rad" США. После отмывания избытка красителя Кумасси R-.:50 гели сканировали с помощью лазерного денситометра 2202 Uitroscan "LKB" Швеция. В качестве маркера и количественного стандарта использовали бычий сывороточный алобумин. В экспериментах по связванию использовали ПМГ, Н-ПМГ, 50мМ Трис-НСІ, рН - 7,4. Для снижения уровня неспецифического связывания в пробы добавляли 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Реакцию запускали добавлением препарата мембран в пробы. Разделение свободного и связанного пептида проводили методом вакуумного фильтрования через стеклянные фильтры "whatnan GP/B" под давлением 20 атм. Количество связанного с мембранами Н-ІМГ определяли по уровню радиоактивности фильтров. За неспецифическое связывание принимали связывание меченого пептида в присутствии 1000-йООО-кратного избытка немеченного ПМГ. Счет радиоактивности фильтров проводили в сцинцилляционной смеси следующего состава: 3 л толуола, 1,5 л тритона Х-100, 0,45 л 0,5 н раствора аммиака в воде, 22^5 г РРО, 2,25 г РОРОР. Белок мембран определяли по Лоури (Lowry О.Н. 1951 ). Радноиммунологическое определение пептидного морфогена гидры (Кривошеав О.Г. и соавт., 1986) проводили, используя специфические антитела (титр 1:16000), полученные при иммунизации кроликов коныога-тами ПМГ с гемоцианином. Экстракт гипоталамуса получали сочетая гомогенизацию ткани в 3% уксусной кислота с последующей ацетоновой* экстрацией супернатанта. Ацетоновый экстракт лиофилиэировали и использовали для определения. Пептидный стандарт или неизвестный образец растворяли в натрий-фосфатном буфере (50 мМ, р.4 - 7,5) инкубировали с антисывороткой, содержащей известное количество меченого пептида. Затем к инкубированной среде добавляли ослиные антитела против гамма-глобулинов кролика и, посла повторной инкубации, 15 раствор поли-эгиленгликоля. После фракционирования определяли радиоактивность осадка на счетчике Rack Ganna "LKB", Швеция. Результаты экспериментов обрабатывали, используяt-критерий Стьюдента на &БМ І5-ВУМС. Представляя экспериментальные данные, указывали вероятность отличия опытных данных от соответствующих контрольных значений. При р 0,95, р<0,99 и р «0,999 опытные данные обозначали (к), (к*), (*«) соответственно.Похожие диссертации на Влияние пептидного морфогена гидры на анаболические процессы в нормальной и регенерирующей печени крыс
