Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II
1.1. Общие механизмы действия стероидных гормонов как ин
дукторов синтеза белка в тканях-мишенях II
Ферментативная индукция как механизм регуляции жизнедеятельности организмов 12
Механизмы рецепции стероидных гормонов в клетках-мишенях животных 18
Механизмы гормональном индукции ферментов в тканях-мишенях. Использование специфических комплементарных ДНК (кДНК) для исследования синтеза и деградации матричных РНК при гормональной индукции... 24
1.2. Влияние глюкокортикоидов на состояние белок-синтезиру-
ющего аппарата 31
Действие глюкокортикоидов на содержание различных видов РНК в клетках-мишенях и на процесс транскрипции 32
Влияние глюкокортикоидов на посттранскрипционную модификацию РІЖ и на полисомный аппарат кле-тск.-мишеней 36
Действие глюкокортикоидов на процессы деградации мРНК 40 '
1.3. Тирозинаминотрансфераза (ТАТ) печени крыс как модель
для исследования механизмов глюкокортикоиднои индукции
ферментов 43
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 49
Материалы и реактивы, использованные в экспериментах... 49
Характеристика подопытных, животных. Введение гормонального индуктора 50
Хроматографические методы фракционирования белков из печени крыс 50
Определение активности ТАТ 53
Аналитический электрофорез белков в полиакриламидном Стр. геле (ПААГ) 55
Получение моноспецифических антител к ТАТ 56
Иммунизация кроликов очищенной тирозинамино-траысферазой 5g
Выделение суммарной ^ -глобулиновой фращии
из сыворотки кроликов, иммунизированных ТАТ... 56
Приготовление "вторых" антител ( Ц козла против 1а кролика) 57
Методы иммунохимического анализа антител и очищенных белков 58
Двойная иммунодиффузия в агаровом геле по Оуктерлони 58
Аналитический иммуноэлектрофорез в агаровом
геле 58
Выявление специфической активности ТАТ в имму-нопреципитатах 60
Радиоактивное мечение jf -глобулинов кролика, специфичных к ТАТ 61
2.9. Получение иммуносорбентов для фракционирования поли
рибосом 62
Выделение суммарных полирибосом из печени крыс 63
Седиментационный анализ полирибосом 65
Приготовление поли- У сефарозы 4В 68
Выделение поли-А содержащей мРНК из полирибосом печени крыс путем аффинной хроматографии на поли-У сефарозе 4В 69
Определение удельной радиоактивности полисомной поли-А содержащей РЖ 70
Определение удельной радиоактивности пула уридиновых нуклеотидов в печени крыс 71
Седиментационный анализ РНК в градиенте плотности сахарозы 73
_ 4 -
Электрофоретический анализ препаратов РНК в агароз- Стр. ных гелях 73
Получение бесклеточной белок-синтезирующей системы (экстракта S 30) из зародышей пшеницы 74
Трансляция полисомной поли-А содержащей РНК в бесклеточной системе из зародышей тпеницы 75
Электрофоретический анализ продуктов трансляции 76
Иммупоцреципитация продуктов трансляции .... 77
Выделение специфической мРНК ТАТ из печени крыс .... 78
Синтез комплементарной ДНК на мРНК ТАТ 80
Центрифугирование кДНК в щелочном градиенте плотности сахарозы 81
Электрофорез препаратов кДНК в агарозных гелях с мочевиной 82
Гибридизация кДНК ТАТ с суммарной поли-А содержащей
РНК, выделенной из полирибосом печени крыс 82
ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРШЖНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ 84
Выделение и очистка анодного изофюрмента ТАТ из печени крыс 84
Получение специфических гипершлмунных сывороток к анодному изоферменту ТАТ; очистка % -глобулинов .... 89
Влияние гидрокортизона на метаболизм и матричную активность полисомной поли-А содержащей РНК в печени
крыс 92
Результаты седиментационного анализа полирибосом, выделенных, из печени интактных и индуцированных гидрокортизоном крыс 92
Выделение суммарной поли-А содержащей РНК из полирибосом печени крыс. Изменение содержания меченой поли-А содержащей РНК в полирибосомах печени при введении гидрокортизона 100
Стр.
Характеристика удельной радиоактивности пула уридиновых нуклеотидов в печени крыс при введении гидрокортизона 105
Изменения удельной радиоактивности полисомной поли-А+ РЫК в динамике индукции гидрокортизоном 108
Включение предшественников в полисомную по-ли-А содержащую РНК печени в норме и при индукции гидрокортизоном 108
Изменения трансляционной активности полисомной поли-А содержащей РНК под действием гидрокортизона НО
3.4. Определение синтеза специфического продукта, осажда
емого антителаг.ш к ТАТ, при трансляции in vitro по
ли-А содержащей РНК из полирибосом печени интактных
и индуцированных животных 112
3.5. Выделение специфической мРНК ТАТ из печени крыс и
исследование полученного препарата 121
Выявление фракции полирибосом печени, синтезирующих ТАТ 121
Вьщеление специфической мРНК ТАТ из полирибосом печени крыс 123
Определение размеров мРНК ТАТ методом центрифугирования в градиенте плотности сахарозы .. -j-gQ
Измерение матричной активности препаратов
мРНК ТАТ в бесклеточной системе синтеза белка 130
3.5.5. Исследование матричных свойств мРНК ТАТ в
системе обратной транскрипции. Анализ разме
ров полученной комплементарной ДНК 133
3.6. Сравнение концентрации мРНК ТАТ в клетках печени крыс
в динамике индукции гидрокортизоном методом гибриди
зации суммарной поли-А содержащей РНК с высокомеченой
кДНК ТАТ 139
ГЛАВА 17. ОБОТДЕВИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 142
Выводы 164
Список литературы 166
Введение к работе
Молекулярные механизмы действия стероидных гормонов являются одной из актуальных проблем биохимии и молекулярной биологии. Известно, что в клетках-мишенях стероидные гормоны изменяют актив -ность ферментов, катализирующих определенные, часто - ключевые реакции обмена веществ, влияют также на синтез неферментных белков и, в результате, на развитие и дифференцировку тканей. Текущая (повседневная) реализация функций клеток и тканей находится под гормональным контролем.
В реализации эффектов многих гормонов необходимыми звеньями являются процессы транскрипции и трансляции. Так, показано, что половые стероиды осуществляют свой физиологический эффект, резко (в сотни и даже тысячи раз) увеличивая концентрацию специфических матричных РНК (мРНК) в цитоплазме клеток тканей-мишеней, что приводит к преобладающему синтезу ряда белков Де notfo(Tsai et. al. , 1978; burns ei.al. Д978). Видимо,такой высокий уровень генетической индукции, сопровождающийся значительными морфологическими изменениями организма,отчасти объясняет прогресс, достигнутый в изуче -нии механизмов действия половых стероидов. Что же касается глюко-кортикоидных гормонов, то здесь прогресс в исследованиях не носит столь бурного характера, хотя каждый новый шаг приближает к цели. Действие глюкокортикоидов на индукцию ферментов хорошо изучено по динамике изменения активности соответствующих ферментов в тканях-мишенях ( Schimke , 1963; Протасова, 1975; muradian. ,1977). Влияние глюкоксртикоидных гормонов на накопление мРНК в полирибосомах, синтез и распад.функциональную активность этих РНК практи -чески не изучено. Ферменты, синтезируемые в ответ на введение глюкокортикоидов, как правило, немногочисленны, содержание их специфических мРНК в цитоплазме не превышает нескольких процентов (Гайц-
- 7 -хоки, 1980). Даже после индукции такие мРНК не становятся преобладающими в цитоплазме, что сильно затрудняет изучение механизма действия ГЛЮКОКОрТИКОЙДОВ.
Целью настоящей работы было изучение влияния глюкокортикоид -ного гормона гидрокортизона на накопление в полирибосомах мРНК для тирозинаминотрансферазы (TAT, L- тирозин: 2 - оксоглутаратамино -трансфераза, КФ 2.6.1.5); ее метаболизм и функциональную активность. ТАТ является удобной и перспективной моделью для исследования закономерностей индукции адаптивных изоферментов. Индивидуальная мРНК для ТАТ относится к типу "минорных" матричных РНК, поскольку кодирует белок, содержание которого даже после индукции не превышает 0,1% (Мертвецов и др.,1978 в ).
Ранее было показано, что через 5 часов после введения крысам гидрокортизона активность ТАТ возрастает в 5-Ю раз,гормон также индуцирует ДНК - зависимый синтез РНК. Когда избыточная концентрация введенного извне гормона понижается, активность ТАТ также возвращается к исходному уровню (Мертвецов, 1981).
Возрастает ли при индукции в клетках-мишенях содержание специфической мРНК, кодирующей синтез ТАТ, или усиливается трансляция предшествующих мРНК ?
Вызываемое гидрокортизоном усиление синтеза РНК в гормонально-чувствительных тканях ( Scbrrud , Sekeris , 1972), а также увеличение активности ДНК-зависимой РНК-полимеразы ( Todbunier et.al. , 1978) позволило предположить, что гормональный контроль осущест -вляется на стадии транскрипции. Данные, полученные в нашей работе, подтверждают это предположение.
В работе ставились следующие конкретные задачи:
I) определить влияние гормонального индуктора-гидрокортизона на метаболизм и матричную активность поли-А содержащей матричной РНК в полирибосомах печени крыс;
изучить распределение полирибосом печени крыс по размерам в динамике индукции гидрокортизоном;
сравнить содержание матричной РНК для ТАТ в полирибосомах печени интактных и индуцированных гидрокортизоном крыс методом тестирования продуктов трансляции в бесклеточной белок-синтезирующей системе;
провести прямое сравнение содержания мРНК ТАТ в печени нормальных и индуцированных гидрокортизоном крыс с помощью молекулярной гибридизации'с использованием "і^ІЩ-зонда".
Выделение и сравнение суммарной поли-А содержащей мРНК (поли-А+ РНК) из полирибосом печени интактных и индуцированных гидрокортизоном крыс показало, что удельная радиоактивность полисомной поли-А содержащей РНК закономерно изменяется в зависимости от времени индукции гидрокортизоном. При исследовании содержания меченой поли-А+ РНК в полирибосомах печени крыс в зависимости от времени индукции гидрокортизоном обнаружено, что количество этой РНК в полирибосомах увеличивается черев 3-5 часов после введения животным гормона. Эти результаты свидетельствуют об обогащении полирибосом печени вновь синтезированными молекулами мРНК. При исследовании распределения полирибосом печени по размерам в разные сроки после введения гидрокортизона установлено, что уже через 2 часа после введения гормона наблюдается увеличение относительного содержания тяжелых полирибосом. Сравнительное изучение эффективности трансляции поли-А+ мРНК, выделенных из полирибосом печени интактных и индуцированных гидрокортизоном крыс, по включению [с1 J лизина в общий белок и по способности таких поли-А+ РНК программировать синтез индуцируемого гидрокортизоном изофермента ТАТ позволило обнаружить, что удельная трансляционная активность полисомной поли-А+ РНК печени значительно (в 2 - 2,5 раза) повышается через 2-4 часа после введения гидро-
кортизона. При трансляции in vitro суммарной полисомной поли-А+ РНК из печени крыс, индуцированных гидрокортизоном, наблюдается резко усиленный по сравнению с контролем синтез индуцибелыюго изофер-мента ТАТ. Эти результаты можно рассматривать как свидетельство того, что через 4 часа после введения гидрокортизона происходит обогащение популяции полисомной поли-А содержащей РНК молекулами индивидуальной мРНК, кодирующей индуцируемый анодный изофермент ТАТ. Однако, повышение содержания продукта трансляции мРНК ТАТ при индукции может быть результатом не только усиленной транскрипции генов и накопления мРНК ТАТ в цитоплазме, но и следствием возрастания трансляционной активности предсуществующих мРНК в клетках печени.
Для того, чтобы сделать окончательный вывод, было проведено прямое измерение концентраций специфических мРНК для ТАТ в клетках печени в норме и при индукции гидрокортизоном. Для этого из печени индуцированных гидрокортизоном крыс был выделен и очищен в 5500 раз анодный изофермент ТАТ и к нему были получены специфические кроличьи антитела. На основе этих антител был изготовлен специфический иммуносорбент, обладающий высокой емкостью по избирательному связыванию ТАТ. Методом фракционирования на иммуносорбенте, из суммарных полирибосом печени крыс, индуцированных гидрокортизоном, получена фракция полирибосом, синтезирующих ТАТ. С помощью аффинной хроматографии на поли-У сефарозе 4В из этой фракции выделена поли-А содержащая мРНК, обладающая матричной активностью в бесклеточной белок-синтезирующей системе и имеющая константы седиментации в пределах 15-16 S . На этой ТАТ мРНК в сіте теме обратной транс-криптазы из вируса миелобластоза птиц синтезирована комплементарная ДНК (кДНК), которая использовалась в качестве "зонда" для сравнения содержания мРНК ТАТ в препаратах суммарной поли-А+ РІЖ из полирибосом печени интактных и индуцированных гидрокортизоном крыс. Впер-
вые, методом молекулярной гибридизации показано, что через 4 часа после индукции гидрокортизоном в клетках печени крыс содержание мРНК ТАТ возрастает в 3-4 раза, а через 16 часов возвращается к исходному уровню.
Таким образом, в настоящей работе впервые проведено прямое сравнение содержания индивидуальной минорной матрицы в разные сроки после введения гидрокортизона и получены новые данные, прямо доказывающие, что влияние глюкокортикоидов на биосинтез ферментов осуществляется на стадии транскрипции; под действием гормона происходит усиление биосинтеза специфических мРНК в клетках-мишенях. Показано также, что при индукции гидрокортизоном не только возрастает концентрация мРНК, но и увеличивается удельная трансляционная активность поли-А+ мРНК, выделяемой из полирибосом печени. Такое повышение трансляционной активности мРНК может быть связано с особыми структурными свойствами индуцируемых мРНК. Полученные данные расширяют наши представления о механизмах глюкокортикоидной индукции.
В раооте усовехшшствован метод шщунохимического выделения "минорной" матричной РНК для индуцируемого изофермента тирозина-минотрансферазы из печени крыс. Этот метод можно использовать для получения препаратов функционально активных минорных мРНК. Такие специфические мРНК могут быть использованы для синтеза кДБК путем обратной транскрипции и последующей амплификации кДНК в векторных молекулах. Использование кДНК в качестве "зондов" открывает широкие возможности для изучения тонкой структуры и функционирования генома эукариот.
Методические подходы к изучению молекулярных механизмов гормональной индукции, изложенные в настоящей работе, могут быть использованы при проведении соответствующих исследований на иных гормонах и иных ферментных системах.
- II -
