Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Особенности биохимических нарушений при аллоксановом диабете 12
1.1.1. Понятие об аллоксановом диабете 12
1.1.2. Ультраструктурные изменения клеток животных при диабете и голодании 14
1.1.2.1. Гликоген как основной энергетический субстрат клеток при стрессовых условиях 14
1.1.2.2. Функционирование глиоксилатного цикла в тканях животных и человека 15
1.1.2.3. Процессы гликолиза и глюконеогенеза в тканях высших животных 18
1.2. Роль малатдегидрогеназы в регуляции метаболических процессов 22
1.2.1. Общая характеристика малатдегидрогеназной активности 22
1.2.2. Участие малатдегидрогеназы в метаболических процессах 23
1.2.3. Молекулярная масса и субъединичное строение 24
1.2.4. Каталитические свойства малатдегидрогеназы 25
1.2.4.1. Общая характеристика каталитического действия 25
1.2.4.2. Кинетические параметры 26
1.2.5. Влияние концентрации ионов водорода на активность малатдегидрогеназы 27
1.2.6. Влияние температуры на активность малатдегидрогеназы 28
1.2.7. Влияние интермедиатов и ионов на активность малатдегидрогеназы 28
1.2.8. Изоферментный состав малатдегидрогеназы 31
1.3. Механизмы адаптации животных к диабету 31
1.3.1. Ультраструктурные изменения клеток животных при диабете и голодании 31
1.3.2. Гормональная регуляция энергетического метаболизма у высших животных при пищевой депривации 36
1.3.3. Биохимические сведения о конверсии жирных кислот в углеводы в клетках высших животных 49
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 50
2.1. Объект и методы исследования 50
2.1.1. Объект исследования 50
2.1.2. Методы исследования 50
2.1.2.1. Контроль за индукцией диабета 50
2.1.2.2. Получение материала для исследования 51
2.1.2.3. Определение активности ферментов 51
2.1.2.4. Определение количества метаболитов 53
2.1.2.5. Определение количества белка 54
2.1.2.6. Методы хроматографического разделения изоформ малатдегидрогеназы 55
2.1.2.7. Электрофоретические исследования 56
2.1.2.7.1. Определение гомогенности ферментов 56
2.1.2.7.2. Специфическое проявление МДГ 56
2.1.2.7.3. Определение молекулярной массы субъединиц фермента методом Ds-Na ПААГ-электрофореза 57
2.1.2.8. Определение молекулярной массы нативного фермента 58
2.1.2.9. Исследование кинетических характеристик и регуляторнои активности изоформ фермента 59
2.2.3. Статистическая обработка данных 59
2.3. Полученные результаты и их обсуждение 61
2.3.1. Доказательство индукции аллоксанового диабета 61
2.3.2. Изменение активности некоторых метаболических путей
в печени крыс 61
2.3.3. Динамика содержания углеводов в тканях печени крыс с аллоксановым диабетом 64
2.3.4. Доказательство наличия трёх изоформ малатдегидрогеназы в печени крыс с аллоксановым диабетом 66
2.3.5. Очистка изоформ малатдегидрогеназы из печени крыс с аллоксановым диабетом 67
2.3.6. Электрофоретические исследования 69
2.3.6.1. Определение гомогенности фермента 69
2.3.6.2. Определение молекулярной массы субъединиц ферментов методом DS-Na ПААГ-электрофореза 71
2.3.7. Определение молекулярной массы малатдегидрогеназы 76
2.3.8. Кинетические и регуляторные характеристики изоформ малатдегидрогеназы 77
2.3.8.1. Отношение изоформ малатдегидрогеназы к концентрации субстрата 77
2.3.8.2. Определение константы Михаэлиса 79
2.3.9. Влияние концентрации ионов водорода 83
2.3.10. Влияние концентрации ионов магния 85
2.4. Влияние температуры на активность МДГ, выделенной из различных органоидов гепатоцитов крыс с аллоксановым диабетом 86
2.4.1. Термостабильность изоформ МДГ из гепатоцитов крыс 86
2.4.2. Температурный оптимум изоформ МДГ из гепатоцитов крыс 87
2.5. Строение и механизм действия активного центра малатдегидрогеназы 91
Заключение 102
Выводы 104
Список использованных источников 106
- Функционирование глиоксилатного цикла в тканях животных и человека
- Влияние интермедиатов и ионов на активность малатдегидрогеназы
- Определение молекулярной массы субъединиц ферментов методом DS-Na ПААГ-электрофореза
- Температурный оптимум изоформ МДГ из гепатоцитов крыс
Введение к работе
Актуальность проблемы. Диабет - хроническое заболевание, приводящее к нарушениям углеводного, белкового и жирового обменов в результате недостатка гормона инсулина.
Известно, что основным энергетическим субстратом в клетках и тканях организма выступают углеводы. Постоянное поступление глюкозы в качестве источника энергии особенно необходимо для нервной ткани и эритроцитов. При экспериментальном диабете ткани испытывают недостаток в глюкозе. В качестве механизма адаптации к данному процессу выступает глюконеогенез. Он имеет особенно важное значение в печени, которая является главным метаболически активным органом, участвующим в поддержании гомеостаза глюкозы. Соотношение между процессами катаболизма и анаболизма глюкозы в клетках печени находится под контролем целого ряда факторов регуляции, включая концентрацию метаболитов, нуклеотидов, а также воздействие гормонов. В нормальных условиях глюконеогенетические трансформации в печени млекопитающих протекают с относительно низкой скоростью. Интенсификация данного процесса наблюдается при дефиците углеводов, в частности при диабете [Епринцев А.Т. и др., 2005].
Кроме того, при адаптации клеточного метаболизма к изменениям условий среды организм использует стратегию регуляции активности ферментного аппарата клетки. Важная роль в осуществлении адаптивных реакций организма принадлежит малатдегидрогеназной системе [Епринцев А.Т. и др., 2006]. Малатдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.37), являясь полифункциональным ферментным комплексом, обеспечивает протекание конструктивного и энергетического обменов. В последнее время малатдегидрогеназа (МДГ) является объектом значительного количества исследований, что обусловлено ее полифункциональностью. Малатдегидрогеназный комплекс обеспечивает функционирование важнейших метаболических процессов, обеспечивающих нормальное функционирование клетки. Особенностью малатдегидрогеназы является участие в глюконеогенезе при мобилизации запасных жиров, то есть данный фермент относится к биокатализаторам глиоксилатного цикла. Наличие в клетке различных процессов, связанных с функционированием одного
фермента малатдегидрогеназы требует сложной многоуровневой регуляции его активности. К механизмам такой регуляции причисляют пространственно разделенные изоформы, имеющие различные кинетические характеристики и структуру молекул данного фермента. По мнению некоторых исследователей, МДГ может быть представлена в виде димерной или тетрамерной формы, которые участвуют в анаболическом и катаболическом метаболизме. По данным современных исследователей димерная изоформа имеет митохондриальную локализацию и участвует в энергетическом обмене (ЦТК), а тетрамерная МДГ, локализованная в цитоплазме или этиопластах, функционирует в анаболических процессах клетки.
В связи с этим большой интерес представляет изучение действия экспериментального диабета на структурно-функциональные трансформации малатдегидрогеназы в гепатоцитах крыс. Кроме того, мало известно о их роли в адаптивных реакциях, обеспечивающих переключение метаболизма на утилизацию жирных кислот и их превращение в водорастворимые углеводы.
Таким образом, целесообразно изучить структуру адаптивного ответа клеточной энергетики печени, оценить особенности различных метаболических путей крыс при аллоксановом диабете, а также рассмотреть возможность участия малатдегидрогеназной системы в адаптивной реакции организма лабораторных крыс к экспериментальному диабету.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение особенностей глюконеогенетических трансформаций в печени крыс с индуцированным аллоксановым диабетом; получение гомогенных препаратов изоформ малатдегидрогеназы из печени крыс с индуцированным аллоксановым диабетом и сравнение их физико-химических, каталитических и регуляторных свойств. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1) изучить концентрацию интермедиатов основных метаболических
процессов в печени крыс при экспериментальном диабете;
2) определить динамику ключевых ферментов основных
метаболических путей в печени крыс при индукции аллоксаном
экспериментального диабета;
3) установить возможность индукции малатдегидрогеназной активности
в гепатоцитах крыс в условиях экспериментального диабета и определить
наличие множественных молекулярных форм изучаемого энзима;
получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты изоформ МДГ из органоидов гепатоцитов крыс;
исследовать физико-химические, кинетические и регуляторные свойства цитоплазматической, митохондриальной и пероксисомальной форм МДГ из гепатоцитов крыс в условиях экспериментального диабета;
исследовать особенности регуляции изоформ малатдегидрогеназы интермедиатами основных метаболических путей;
установить действие различных ионов и температуры на активность исследуемых форм малатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс.
Научная новизна. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о способах трансформации метаболических потоков в животной клетке с помощью изоферментов малатдегидрогеназной системы в условиях экспериментального диабета. Показано появление дополительной пероксисомальной изоформы фермента, обуславливающей функционирование глиоксилатного цикла, как этапа глюконеогенеза. Выделение изоформ малатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс в условиях экспериментального диабета позволило получить новые данные о физико-химических характеристиках, особенностях структурной организации и регуляции метаболитами. Сравнительный анализ указывает на значительное сходство по большинству характеристик (Rf, четвертичной структуре, рН-оптимуму, сродству к субстрату, активации ионами и др.) пероксисомальной и цитоплазматической форм изучаемого фермента. Структурно-функциональная трансформация малатдегидрогеназной системы может иметь важное значение в реализации механизмов адаптивных реакций гепатоцитов крыс в условиях экспериментального диабета.
Практическая значимость. Научные положения диссертационной
работы позволяют расширить и углубить наши представления о роли разных
изоформ малатдегидрогеназы в животной клетке в механизмах реализации
адаптивных реакций к повышенным концентрациям глюкозы.
Высокоочищенные изоформы МДГ могут быть использованы для количественного определения малата в клеточном соке клеток. Получение препаратов множественных молекулярных форм исследуемого фермента открывает перспективы его применения в научно-исследовательских изысканиях, связанных с исследованием ферментативной кинетики и
моделированием сопряженных ферментных систем при патологиях, а также для биохимических анализов в лабораторной практике.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, спецкурсах по энзимологии, кроме того, они используются при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы
докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях и были представлены на 12 международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2008,2009,2010), ежегодных научных секциях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета.
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 5 публикациях.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (148 источников). Иллюстрационный материал включает 21 рисунок, 7 таблиц.
Функционирование глиоксилатного цикла в тканях животных и человека
Глиоксилатный цикл был впервые описан в 1953 году для микроорганизмов, выращиваемых на Сз субстратах [113]. Основной его функцией является конденсация двух молекул ацетил-кофермента А в четырехуглеродную органическую кислоту сукцинат. Источниками ацетил-СоА могут являться Сі-соединения, например, ацетат, а также 0-окисление жирных кислот. Кроме бактерий, присутствие глиоксилатного цикла обнаружено у всех таксономических групп растений и грибов. Для грибов данный цикл служит приспособление для роста на различных питательных средах. У высших растений роль глиоксилатного цикла сводится, как правило, к утилизации запасных жиров при прорастании семян и спор [85]. На сегодняшний день имеются данные о присутствии данного цикла у нематод на ранней личиночной стадии [74, 121]. Активность ключевого фермента цикла изоцитратлиазы гистохимически обнаруживалась в почечных канальцах жабы Bufo marinns, в печени морских свинок и цыплят [89, 100, 144].
Вопрос о превращении липидов в углеводы, и в частности, в гликоген, в тканях животных и человека до настоящего времени является дискуссионным. Считается, что в нормальных условиях ключевые ферменты глиоксилатного цикла отсутствуют в тканях высших животных. Однако в недавних исследованиях было показано, что у крыс при патологических состояниях, к которым можно отнести голодание и диабет, наблюдается индукция изоцитратлиазной и малатсинтазной активностей [5, 58, 136, 138].
Интересно отметить, что относительно недавно появились сведения о причастности гидролитических ферментов лизосом и микротелец к окислению жирных кислот и других веществ липидного ряда у различных животных и человека. Так, например, биохимические исследования бурого жира, взятого у медведей, находящихся в зимней спячке, показали, что эта ткань может вызывать цианид-нечувствительное окисление жирных кислот. Показано, что в этом процессе основную роль играют пероксисомы. Установлена важная роль пероксисом в /3-окислении жирных кислот, ранее связываемом исключительно с митохондриями [55]. Кроме того, в пероксисомах кроме ферментов окисления жирных кислот, авторы обнаружили ключевые ферменты глиоксилатного цикла ИЦЛ и МС. Активность этих ферментов по сравнению с контролем возрастала в 8,2 и 5,3 раза соответственно. Авторы также отмечают, что инкубация тканей бурого жира в течение 4 часов в присутствии пальмитата вызывает резкое увеличение содержания гликогена по сравнению с контролем. На основании этих данных делается заключение о возможности превращения ацетил-КоА, образованного из липидов, в глюкозу [91, 108]. Используя глиоксилатный цикл, можно миновать два декарбоксилирующих цикла трикарбоновых кислот и два атома углерода (ацетил-КоА) могут быть превращены в четырёхуглеродные соединения, такие как сукцинат, вместо окисления до С02.
Существуют данные об обнаружении активности ИЦЛ и МС в гепатоцитах человека [92]. Печень человека также может осуществлять цианид-нечувствительое окисление жирных кислот. Используя световую микроскопическую иммуноцитохимию с антителами, образованными на МС и ИЦЛ эвглены, авторы выявили, что эти ферменты локализуются в пероксисомальной фракции гепатоцитов, маркерным ферментом которой является каталаза. Иммуноцитохимия с антителами на ацетил-КоА оксидазу крыс также показала, что этот фермент локализуется в пероксисомах. Присутствие МС и ИЦЛ в гомогенате печени человека далее подтверждалось анализом Western blot. По мнению авторов, эти данные свидетельствуют о том, что печень человека может быть способна к использованию углеродного скелета жирных кислот для углеводного синтеза жирных кислот для углеводного синтеза, поскольку в низших организмах глиоксилатный цикл способствует этой анаболической функции.
Влияние интермедиатов и ионов на активность малатдегидрогеназы
Глиоксилатный цикл был впервые описан в 1953 году для микроорганизмов, выращиваемых на Сз субстратах [113]. Основной его функцией является конденсация двух молекул ацетил-кофермента А в четырехуглеродную органическую кислоту сукцинат. Источниками ацетил-СоА могут являться Сі-соединения, например, ацетат, а также 0-окисление жирных кислот. Кроме бактерий, присутствие глиоксилатного цикла обнаружено у всех таксономических групп растений и грибов. Для грибов данный цикл служит приспособление для роста на различных питательных средах. У высших растений роль глиоксилатного цикла сводится, как правило, к утилизации запасных жиров при прорастании семян и спор [85]. На сегодняшний день имеются данные о присутствии данного цикла у нематод на ранней личиночной стадии [74, 121]. Активность ключевого фермента цикла изоцитратлиазы гистохимически обнаруживалась в почечных канальцах жабы Bufo marinns, в печени морских свинок и цыплят [89, 100, 144].
Вопрос о превращении липидов в углеводы, и в частности, в гликоген, в тканях животных и человека до настоящего времени является дискуссионным. Считается, что в нормальных условиях ключевые ферменты глиоксилатного цикла отсутствуют в тканях высших животных. Однако в недавних исследованиях было показано, что у крыс при патологических состояниях, к которым можно отнести голодание и диабет, наблюдается индукция изоцитратлиазной и малатсинтазной активностей [5, 58, 136, 138].
Интересно отметить, что относительно недавно появились сведения о причастности гидролитических ферментов лизосом и микротелец к окислению жирных кислот и других веществ липидного ряда у различных животных и человека. Так, например, биохимические исследования бурого жира, взятого у медведей, находящихся в зимней спячке, показали, что эта ткань может вызывать цианид-нечувствительное окисление жирных кислот. Показано, что в этом процессе основную роль играют пероксисомы. Установлена важная роль пероксисом в /3-окислении жирных кислот, ранее связываемом исключительно с митохондриями [55]. Кроме того, в пероксисомах кроме ферментов окисления жирных кислот, авторы обнаружили ключевые ферменты глиоксилатного цикла ИЦЛ и МС. Активность этих ферментов по сравнению с контролем возрастала в 8,2 и 5,3 раза соответственно. Авторы также отмечают, что инкубация тканей бурого жира в течение 4 часов в присутствии пальмитата вызывает резкое увеличение содержания гликогена по сравнению с контролем. На основании этих данных делается заключение о возможности превращения ацетил-КоА, образованного из липидов, в глюкозу [91, 108]. Используя глиоксилатный цикл, можно миновать два декарбоксилирующих цикла трикарбоновых кислот и два атома углерода (ацетил-КоА) могут быть превращены в четырёхуглеродные соединения, такие как сукцинат, вместо окисления до С02.
Существуют данные об обнаружении активности ИЦЛ и МС в гепатоцитах человека [92]. Печень человека также может осуществлять цианид-нечувствительое окисление жирных кислот. Используя световую микроскопическую иммуноцитохимию с антителами, образованными на МС и ИЦЛ эвглены, авторы выявили, что эти ферменты локализуются в пероксисомальной фракции гепатоцитов, маркерным ферментом которой является каталаза. Иммуноцитохимия с антителами на ацетил-КоА оксидазу крыс также показала, что этот фермент локализуется в пероксисомах. Присутствие МС и ИЦЛ в гомогенате печени человека далее подтверждалось анализом Western blot. По мнению авторов, эти данные свидетельствуют о том, что печень человека может быть способна к использованию углеродного скелета жирных кислот для углеводного синтеза жирных кислот для углеводного синтеза, поскольку в низших организмах глиоксилатный цикл способствует этой анаболической функции.
Определение молекулярной массы субъединиц ферментов методом DS-Na ПААГ-электрофореза
Кроме обнаруженных нами ионогенных групп в активном центре митохондриальных изоферментов из сердца свиньи и быка присутствует по одному функциональному остатку цистеина. Так, в активном центре МДГ обнаружено по два остатка аргинина и гистидина и по одному радикалу лизина и цистеина, последний присутствует только в молекулах митохондриальных белков.
На основе существующих сведений и полученных нами экспериментальных данных разработана гипотетическая схема структуры и каталитического механизма МДГ из растительной клетки. Эта схема не опирается на экспериментальные подтверждения, полученные с помощью методов рентгеноструктурного анализа или избирательного радиоактивного сечения его функциональных остатков, однако ее можно использовать как удобную рабочую гипотезу при дальнейшем исследовании структуры активного центра МДГ растительного происхождения и при изучении процессов, протекающих во время каталитического акта. Структура активного центра изоферментов МДГ из одного и того же или из разных организмов в основном может отличаться по типу аминокислотных остатков, которые образуют микроокружение (дополнительные аминокислоты) и каркас (вспомогательные аминокислоты) данного участка молекул белка. Однако, исследования активного центра МДГ из митохондрий и цитоплазмы сердца свиньи и быка показывают, что ее изоферменты могут также различаться по наличию в нем некоторых ионогенных групп, например, сульфгидрильных групп цистеина. Наряду с этим структура активного центра большинства ферментов, в том числе МДГ, обладает высокой степенью консервативности и практически не поддается процессу эволюции. Поэтому различия в структуре активного центра этих двух групп изоферментов (цитоплазматических и митохондриальных) могут быть связаны с их различным происхождением. К числу высококонсервативных ионогенных групп активного центра МДГ относятся гистидин, аспарагин и лизин. Гистидин встречается в активном центре всех изученных изоферментов МДГ в количестве одного или двух остатков [56, 119, 124]. Остатки гистидина играют важную роль в транспорте протонов между субстратом и коферментом благодаря наличию имидазольной группы в его структуре. Имидазол имеет величину рК, близкую к 7,0 при 25С. В молекуле фермента значение рК имидазола может быть выше или ниже этой величины в зависимости от аминокислотного окружения. Такая стратегия регуляции состояния имидазольного кольца называется альфастатной и позволяет организму поддержать при физиологических значениях рН гистидин в полупротонированном состоянии (а-имид=0,5). В активном центре МДГ могут участвовать два гистидиновых остатка, один из которых выступает в качестве шиффового основания (депротонирован), другой — как шиффовая кислота (протонирован). По этой причине, с нашей точки зрения, именно остаток(ки) гистидина играет одну из ключевых ролей при отборе и передаче гидрид-ионов между молекулами субстрата и четвертым положением с А-стороной никотинамидного кольца кофермента. Полученные экспериментальные данные показывают, что МДГ представляет собой А-стереохимически специфичный фермент. В активном центре МДГ остаток гистидина, по-видимому, участвует в атаке гидроксильной группы молекулы малата и облегчает разрыв О—Н связи. С другой стороны, остатки аргинина активного центра МДГ образуют его субстрат-связывающий участок. Гуанидиновая группа аргинина в обычных физиологических условиях имеет положительный заряд и может взаимодействовать с карбоксильными группами малата, так как внутри клетки это соединение встречается в анионном состоянии. Итак, остатки аргинина отвечают за связывание, стабилизацию и пространственную ориентацию молекул субстрата для облегчения атаки на их гидроксильную группу. Участие остатков аргинина в субстрат-связывающем участке МДГ позволяет им в равной мере быть защищенными коферментом и субстратом, так как расстояние между точками связывания субстратов в активном центре является небольшим [56, 128, 131]. В активном центре цитоплазматической МДГ из сердца свиньи расстояние между этими точками составляет лишь 20А. Об участии остатков аргинина в субстрат-связывающем участке активного центра МДГ свидетельствует тот факт, что при модификации двух его боковых групп в молекулах изофермента из цитоплазмы сердца свиньи не происходит образование тройного комплекса МДГ-НАДН-оксалоацетат, но формируется двойной комплекс МДГ-НАДН.
Наконец, в активном центре МДГ лизин с помощью группы H2N—СН2, обладающей определенным отрицательным зарядом, вероятно, участвует в поддержании необходимой ориентации НАД4" при формировании фермент-субстратного комплекса. Возникающее перераспределение электронной плотности способствует переносу гидрид-ионов из молекул малата на НАД1". Следовательно, лизин способствует передаче гидрид-ионов к четвертому положению А-стороны никотинамидного кольца НАД1". Роль, выполняемая лизином в активном центре, позволяет объяснить, почему кофермент эффективнее защищает МДГ от инактивации пиридоксаль-5 -фосфатом, чем субстраты. Кроме того, так как функциональная группа лизина заряжена отрицательно, ее взаимодействие с окисленной формой кофермента осуществляется прочнее, чем с НАДН.
Температурный оптимум изоформ МДГ из гепатоцитов крыс
Наконец, в активном центре МДГ лизин с помощью группы H2N—СН2, обладающей определенным отрицательным зарядом, вероятно, участвует в поддержании необходимой ориентации НАД4" при формировании фермент-субстратного комплекса. Возникающее перераспределение электронной плотности способствует переносу гидрид-ионов из молекул малата на НАД1". Следовательно, лизин способствует передаче гидрид-ионов к четвертому положению А-стороны никотинамидного кольца НАД1". Роль, выполняемая лизином в активном центре, позволяет объяснить, почему кофермент эффективнее защищает МДГ от инактивации пиридоксаль-5 -фосфатом, чем субстраты. Кроме того, так как функциональная группа лизина заряжена отрицательно, ее взаимодействие с окисленной формой кофермента осуществляется прочнее, чем с НАДН.
Таким образом, при осуществлении каталитического акта малат, стабилизированный с помощью остатков аргинина, атакуется имидазольной группой гистидина, которая дестабилизирует связь между кислородом и водородом гидроксильной группы молекулы субстрата. Дестабилизированная связь разрывается в присутствии кофермента, а гидрид-ион передается на четвертое положение А-стороны его никотинамидного кольца. Второй ион водорода, связанный с атомом углерода, по-видимому, непосредственно обменивается с окружающей молекулу фермента средой. Отличия в скоростях и параметрах прямой и обратной реакций могут быть связаны с присутствием в активном центре МДГ второго протежированного остатка гистидина. Он, возможно, участвует в восстановлении оксалоацетата, и его более выгодное пространственное расположение по отношению к связывающему участку активного центра МДГ, по-видимому, не требует тех конформационных сдвигов молекул фермента, которые наблюдаются при окислении малата. Превращение субстратов в активном центре происходит по упорядоченному каталитическому механизму с первичным взаимодействием молекул фермента и кофермента. Процессы, которые протекают в активном центре МДГ, во время каталитического акта, по-видимому, осуществляются лишь после образования тройных комплексов фермента с субстратами.
В стрессовых условиях перед организмом возникают новые метаболические потребности, для удовлетворения которых необходимы количественные и качественные перестройки ферментных систем клетки. Адаптивные изменения включают трансформацию регуляторных механизмов метаболических путей, что ведет либо к изменению изоферментного спектра, либо к новым каталитическим свойствам существующих ферментов, при этом активируются пути, которые в норме функционируют незначительно или вовсе отсутствуют. Поэтому главной задачей метаболизма при диабете остается поддержание достаточного уровня глюкозы в тканях организма и, в первую очередь, в мозге, что достигается интенсификацией метаболизма, гибкостью обмена веществ, строгостью регуляции реакций, катализируемых исследуемыми ферментами [21, 22, 33].
Кроме того, немаловажное значение в адаптивной реакции организма при аллоксановом диабете играет малатдегидрогеназа [125]. Существенный рост активности фермента у животных при индукции аллоксанового диабета, вероятно, связан с процессами утилизации запасных питательных веществ. После мобилизации запасного гликогена наиболее важным ресурсом клетки остаются запасные жиры. Р-окисление жирных кислот интенсивно протекает как в митохондриях, так и в пероксисомах гепатоцитов [118, 129]. Данный факт позволяет предположить, что максимальная индукция малатдегидрогеназной активности была связана с появлением новой изоформы МДГ, выделенной ионообменной хроматографией на ДЭАЭoyopearl, которая имеет, по-видимому, пероксисомальную локализацию. Получение в электрофорётически гомогенном состоянии пероксисомальной, цитозольной и митохондриальной изоформ МДГ открыло перспективу исследования их физико-химических и регуляторных характеристик. Анализ полученных данных в этой работе и опубликованных ранее в научной литературе позволяет считать, что димерная изоформа МДГ из митохондрий обеспечивает протекание реакций цикла Кребса, а тетрамерная цитозольная и индуцированная пероксисомальная малатдегидрогеназа катализируют реакции глюконеогенеза и глиоксилатного цикла соответственно. Обсуждение свойств пероксисомальной изоформы МДГ и цитозольной формы исследуемого фермента показывает их значительное сходство (рН оптимум, Км по субстрату и по ферментам, температурный оптимум и др.). Можно предположить, что именно цитозольная изоформа МДГ претерпевает посттрансляционные трансформации и доставляется в пероксисомы гепатоцитов печени крыс, где принимает участие в осуществлении реакций глиоксилатного цикла. Подобный механизм описан для некоторых пероксисомальных белков [32, 39]. Полученные результаты позволили разработать гипотетическую схему участия изоформ малатдегидрогеназы в трансформации метаболических процессов в гепатоцитах крыс при аллоксановом диабете (рис. 21).
Увеличение активности и появление новой изоформы МДГ в печени крыс при диабете подтверждают возможность участия малатдегидрогеназной системы в адаптивной реакции организма при стрессовых условиях и ее полиморфизм. Роль малатдегидрогеназы в адаптации к изменяющимся условиям среды сводится к интенсификации глюконеогенетических и дыхательных процессов, мобилизации запасного пула малата и ускорению внутриклеточного транспорта углеродных соединений.
