Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1. Строение и функции металлотионеинов (общие сведения) 11
1.2. Металлотионеины и металлотионеин-подобные белки у рыб (влияние тяжелых металлов и других факторов) 14
1.3. Металлотионеин и металлотионеин-подобные белки у беспозвоночных гидробионтов (влияние тяжелых металлов и других факторов) 29
1.4. Неметаллотионеиновые металлсвязывающие лиганды у гидробионтов 40
Глава II. Материал 44
2.1. Объекты исследования 44
2.2. Полевые и лабораторные исследования 44
2.3. Сбор и хранение материала , 46
Глава III. Методы исследования 46
3.1. Разрушение клеток и экстракция 46
3.2. Ультрафильтрация 47
3.3.Хроматография 47
3.4. Определение числа сульфгидрильных групп с помощью реактива Эллмана 53
Глава IV. Результаты исследований 54
4.1. Применения спектрофотометрии при 250 нм для выявления сульфгидрильных групп в пептидах вместо метода Эллмана 54
4.2, Влияние разных концентраций ртути на состав низко молекулярных пептидов печени и мускулатуры позвоночных животных в экспериментальных условиях 58
4.2.1. Качественные и количественные вариации состава низкомолекулярных пептидов мускулатуры окуня при аккумуляции разных концентраций ртути 58
4.2.2. Качественные и количественные вариации состава ИМ пептидов тканей карася при аккумуляции разных концентраций ртути 63
4.2.2.1. Вариации состава низкомолекулярных пептидов мускулатуры карася при аккумуляции разных концентраций ртути 63
4.2.2.2. Вариации состава низкомолекулярных пептидов гепатопанкреаса карася при аккумуляции разных концентраций ртути 66
4.2.2.3. Сравнительный анализ реакции состава низкомолекулярных пептидов мускулатуры окуня и карася на интоксикацию ртутью 69
4.2.3. Качественные и количественные вариации состава низкомолекулярных пептидов тканей крыс при аккумуляции ртути 73
4.2.3.1. Влияние нитрата ртути на состав низкомолекулярных пептидов мускулатуры крыс 73
4.2.3.2, Влияние нитрата ртути на состав низкомолекулярных пептидов печени крыс 76
4.2.3.3. Влияние нитрата ртути на состав низкомолекулярных пептидов почек крыс , 78
4.2.4. Половые различия состава низкомолекулярных пептидов тканей крыс при влиянии нитрата ртути 82
4.2.4.1. Фракционный состав пептидов мышц самцов 82
4.2.4.2. Фракционный состав пептидов мышц самок 84
4.2.4.3. Фракционный состав пептидов печени самцов 86
4.2.4.4. Фракционный состав пептидов печени самок 88
4.2.4.5. Динамика изменений концентрации пептидов во фракциях мускулатуры и печени крыс разного пола 90
4.2.5. Сравнительный анализ динамики изменений фракционного состава низкомолекулярных тканевых пептидов животных разных видов 92
4.3. Влияние разных факторов окружающей среды на состав низкомолекулярных пептидов тканей рыб из естественных условий 97
4.3.1. Возрастные и половые вариации состава низкомолекулярных пептидов мускулатуры окуней из озер Чучъярви и Вуонтеленъярви 98
4.3.1.1. Возрастные изменения состава низкомолекулярных пептидов в мускулатуре самцов 99
4.3.1.2. Возрастные изменения состава низкомолекулярных пептидов в мускулатуре самок 101
4.3.2. Количественные вариации состава низкомолекулярных пептидов печени окуней из озер Чучъярви и Вуонтеленъярви 104
4.3.2.1. Влияние экологических условий на пептиды печени самцов двухлетнего возраста 105
4.3.2.2. Возрастные изменения состава низкомолекулярных пептидов в печени самок окуней из озер Чучъярви и Вуонтеленъярви 106
4.3.2.3. Динамика изменения состава низкомолекулярных пептидов печени самцов и самок в возрасте 2+ из оз. Чучъярви и Вуонтеленъярви 110
4.3.3. Фракционный состав пептидов мускулатуры окуней из разных по экологии озер Дарвиновского заповедника 112
4.3.3.1. Пептиды мускулатуры окуней из разных по экологии озер Дарвиновского заповедника и Карелии 115
4.3.4. Влияние техногенных вод горно-обогатительного комбината на состав низкомолекулярных пептидов мускулатуры некоторых видов рыб 117
4.3.4.1. Сравнительный анализ фракционного состава низкомолекулярных пептидов мускулатуры плотвы из Каскесозера и хвостохранилища Костомукшского ГОКа 118
4.3.4.2, Сравнительный анализ фракционного состава низкомолекулярных пептидов мускулатуры щуки из Каскесозера и хвостохранилища Костомукшского ГОКа 120
Глава V. Обсуждение результатов 124
Выводы 141
Список литературы 143
- Металлотионеины и металлотионеин-подобные белки у рыб (влияние тяжелых металлов и других факторов)
- Неметаллотионеиновые металлсвязывающие лиганды у гидробионтов
- Применения спектрофотометрии при 250 нм для выявления сульфгидрильных групп в пептидах вместо метода Эллмана
- Возрастные изменения состава низкомолекулярных пептидов в мускулатуре самок
Введение к работе
Актуальность проблемы. Для понимания механизмов биохимических адаптации животных к изменяющимся экологическим факторам важное значение имеет изучение особенностей отдельных.сторон метаболизма клеток. Как известно (Мецлер, 1980; Замятнин, 2003), низкомолекулярные пептиды характеризуются чрезвычайно широким функциональным разнообразием. Они участвуют в функционировании нервной, иммунной, эндокринной систем, морфогенезе. А такие пептиды как глутатион и металлотионеины являются неотъемлемой частью защитных реакций от разного рода ксенобиотиков. Тем не менее, исследованию роли низкомолекулярных пептидов в развитии ответных реакций организма на влияние внешних, в том числе антропогенных, факторов уделяется недостаточно внимания, хотя это еще один важный аспект изучения биохимических адаптации. Особенно отчетливо эту взаимосвязь можно проследить у водных организмов, в частности у рыб, что связано с большей зависимостью холоднокровных животных от условий среды обитания. Актуальность этих исследований определяется не только возможностью получения данных о специфике биохимической организации разных видов животных и особенностях их адаптации в пределах нормы реакции (Сло-ним,1971; Шварц, 1980), но и сведений, указывающих на возникновение предлагалогий и в дальнейшем патологий в условиях.техногенного давления на природу. Такие знания очень важны как для понимания закономерностей эволюции живых организмов, так и для решения обширного круга задач, связанных с тестированием и мониторингом природных сред, необходимых для решения проблем охраны природы и рационального природопользования (Шульман, 1972; Лав, 1976; Шатуновский, 1980; Сидоров, 1983; Лукьяненко, 1987; Флеров, 1989; Хоружая, 1989; Телитченко, Остроумов, 1990; Израэль, 2002).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование качественного фракционного состава низкомолекулярных (НМ) пептидов в органах некоторых видов пресноводных рыб и выявление их количественных изменений под действием, некоторых факторов среды, главным образом, антропогенного происхождения.
Основные задачи настоящей работы заключались в следующем:
изучить влияние ртути на качественный и количественный состав НМ пептидов тканей окуня и карася в аквариальном эксперименте;
провести сравнительный анализ качественных и количественных изменений в составе НМ пептидов тканей рыб и крыс, как представителей экто- и эндотермных животных, под действием ртути в модельном эксперименте;
исследовать влияние некоторых факторов среды обитания на состав НМ пептидов тканей рыб.
Научная новизна. Впервые исследован фракционный состав пептидов с молекулярными массами (Мм) 10 кДа и нюьКб'1КДННА нслишрых видов
БИБЛИОТЕКА СПетербмг /-о I
рыб методом жидкостной хроматографии на гелях TSK Toyopearl HW-40 S. Показана видовая специфика состава НМ пептидов. Выявлена количественная вариабельность фракций,- возникающая при изменении различных параметров водной среды. Впервые проведен сравнительный анализ изменения фракционного состава пептидов у рыб и теплокровных (крыс) позвоночных под действием ртутной интоксикации. Практическое значение работы. Работа является частью многолетних исследований, проводимых в лаборатории экологической биохимии Института биологии Карельского научного центра РАН в рамках основных направлений исследований биологических наук РАН (5.15, 5.21) и гранта Президента РФ «Ведущие научные школы» (НШ-894.2003.4). Полученные в ходе работы результаты могут быть использованы при разработке систем эколого-биохимического мониторинга и тестирования экологической обстановки в водоемах. Материал может быть использован при чтении курса лекций «Экологическая биохимия животных» для студентов биологических факультетов ВУЗов. Положения выносимые на защиту.
-
Фракционный состав пептидов с Мм до 10 кДа, выделенных из разных тканей рыб и крыс, отличается тканевой и видовой спецификой.
-
Пептиды тканей рыб отличаются качественным постоянством, но подвержены количественным вариациям под действием различных факторов среды.
-
Длительное накопление ионов ртути в организме рыб и крыс вызывает количественное перераспределение пептидов по фракциям. Индивидуальные особенности этого явления зависят от возраста и пола животных.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на: IV Молодежной научной конференции "Актуальные проблемы биологии и экологии" (Сыктывкар, 1999); 3rd international Lake Ladoga symposium. Monitoring and sustainable management of Lake Ladoga and other large lakes (Petrozavodsk, 1999); Биологические основы изучения, освоения и охраны жив. и раст. мира, почв, покрова Восточной Фенноскандии (Петрозаводск, 1999); IX Всероссийской конф. по экологической физиологии и биохимии рыб (Ярославль, 2000); Международной конференции: Биоразнообразие Европейского Севера (Петрозаводск, 2001); Int. Conf. "Biodiversity ofthe European North" (Petrozavodsk, 2001); 3rd. International Symposium on Trace Elements in Human: New Perspectives (Афины. 2001); III Съезде биохимического общества. (Санкт-Петербург, 2002); 11th International Symposium on Trace Elements in Man and Animals (Berkeley, California USA, 2002); 21st Workshope "Essentialy and Toxicity of Macro, Trace and Ultratrace Elements" (Germany, 2002); III Республиканской молодежной конференции «XXI век: экологическая наука в Армении» (Ереван, 2002); XI Международном симпозиуме по биоиндикаторам «Современные проблемы биоиндикации и биомониторинга» (Сыктывкар, 2003); Российском симпозиуме по химии и биологии пептидрв, (Москва, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 статьи.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, включая 37 рисунков и 21 таблицу. Список литературы включает 280 источников, из них 45 отечественные.. Благодарности. Выражаю благодарность д.б.н. В.Т. Комову за постановку аквариальных экспериментов и определение ртути в рыбе на базе ИБВВ РАН. Благодарю за помощь в работе над рукописью и ценные рекомендации к.б.н. Л.П. Смирнова. Искренне признательна всем сотрудникам лаборатории экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАН за постоянную поддержку.
Металлотионеины и металлотионеин-подобные белки у рыб (влияние тяжелых металлов и других факторов)
В последние годы в результате сильного воздействия антропогенного фактора на окружающую среду, в том числе и на водоемы, проявляется значительный интерес к проблеме существования и выживания гидробионтов в условиях загрязнения (Алабастер, Лойд, 1984; Евтушенко и др., 1985; Колупаев, 1991). Большее значение приобретает изучение возможных последствий этой антропогенной деятельности на живую природу (IPCS, 1992).
Загрязнение водоемов тяжелыми металлами, такими как: ртуть, кадмий, свинец, стронций, никель, алюминий и другими - один из самых распространенных видов антропогенного воздействия и одна из наиболее распространенных групп ядов для гидробионтов (Лукъяненко, 1983; Флеров, 1989).
Патологические изменения, возникающие на уровне макромолекул и органоидов клетки, в результате воздействия тяжелых металлов на живые орга 15, низмы, могут передаваться по цепочке до самых "высоких" структур организации живого: популяций и целых биогеоценозов, поэтому возникает потребность понимания природных механизмов защиты против повреждающих агентов (Мур, 1987).
С начала 80-х годов прошлого столетия многие исследователи, изучавшие проблемы загрязнения водных экосистем, опираясь на большой фактический материал, полученный при изучении МТ теплокровных позвоночных, попытались выявить эту группу низкомолекулярных пептидов в органах рыб и других гидробионтов и применить полученные данные для оценки степени повреждающего действия загрязнений, в том числе и тяжелых металлов, используя при этом те же методические подходы, например гель-хроматографию. Так, в печени солнечных рыб, подвергнутых действию растворов меди различной концентрации, методом жидкостной хроматографии Cu-протеины разделяли на низкомолекулярные, промежуточного веса и высокомолекулярные (Harrison, Lam, 1986). Из цитоплазмы печени зимней камбалы {Pleuronectes platessa), которой предварительно вводили цинк или кадмий, выделили богатый цистеином белок, способный связывать металлы. Его молекулярная масса, установленная методом гель-фильтрации, составила 14,5 - 14,6 кДа (Shears, Fletcher, 1985). По своему аминокислотному составу он проявил сходство с аналогичным белком из слизистой оболочки кишечника, а также с металлотионеином из печени других видов рыб и млекопитающих. Из печени рыб, не получавших тяжелых металлов, также выделен цинк-связывающий белок с низкой молекулярной массой, который, однако, отличается от металлотионеина по аминокислотному составу. Ми-кросомально-цитоплазматическая фракция печени полосатого тунца гельфильт-рацией на сефадексе G-75 разделялась на 3 фракции (60 кДа и выше, 10 кДа и 5 кДа и ниже). Во фракции 10 кДа найдена большая часть (60-80%) Cd и Си, а также значительное количество Zn. Однако Zn содержался в основном во фракции 60 кДа и выше (Takeda, Shimizu, 1982). Аналогичную молекулярную массу (10 кДа), определенную гель фильтрацией, демонстрировал на сефадексе G-50 тионеинподобный полипептид из тканей тиляпии {Oreochromis rhossambicus) (Петухов и др., 1983) и МТ из гепатопанкреаса карпа на сефадексе G-75 (Yama-moto et al., 1978), Последний имеет высокое поглощение при 254 нм за счет Ме-меркаптидных связей и низкое при 280 нм (в составе молекулы нет ароматических аминокислот) (Kito et al., 1982а). Показано, что у карпов Cd и Zn накапливаются сначала в МТ гепатопанкреаса, а затем обнаруживаются в МТ почек, жабр и желудочно-кишечного тракта (Kito et al., 1982b). 80% Cd в цитозоле печени рыб вида Zosterisessor ophiocephalus связывалось белковой фракцией с Мм 10 кДа, а 20% полипептидами с Мм 5 кДа (Tallandini et al., 1989). У некоторых видов рыб обнаружены половые различия в ответной реакции тканей на поступление в организм Cd2+, Cu2+ и Zn2+. Так, в печени самок камбалы-ершоватки {Limanda limanda) уровень МТ четко коррелировал с таковым Zn, а в печень самцов максимально реагировала на смесь Си и Cd (Hylland et ah, 1992).
Первичная структура МТ эволюционно консервативна, особенно по расположению остатков цистеина (Kille et al., 1992а; Hylland et al., 1995), поэтому МТ рыб по своим физико-химическим характеристикам сходны с МТ млекопитающих. В частности, МТ, выделенный из печени морской камбалы (Pleuroneces platessa), представляет собой одноцепочечную молекулу с Мм 7 кДа, содержащую 31% цистеина, в составе которой отсутствуют арома-тические аминокислоты (Overnell, Coombs, 1979). Тиоловые группы остатков цистеина комплексуются с Cd в молярном соотношении 3:1 при этом наблюдается характерный максимум поглощения при 250 нм. В печени камбаловых рыб разных видов, например, тюрбо {Scophtalmus maximus), трески {Gadus morhua), а также щуки и обыкновенного гольца {Nemachilus barbatulus) выявлена одна форма ме-таллотионеина (Shears, Fletcher, 1985; Duquesne et al., 1991; Killer et al., 1991; George et al., 1992; Hylland et al., 1994), в печени радужной форели {Oncorhyn chus mykiss), красного морского леща (Pagrus major), канального сома (Jctalurus punctatus) и гепатопанкреасе золотой рыбки (Carassius auratus) - 2 изоформы (Carpene, Vasak, 1989; КШе et al, 1991; Kuroshima, 1995; Zhang, Schlenk, 1995). Из гепатопанкреаса карпа {Cyprinus carpid) на ДЭАЭ-сефадексе также выделены 2 изоформы металотионеинов, соответствующие классам МТ-1 и МТ-2 и содержащие 34,24 и 31,90% остатков цистеина, молекулярные массы которых равны 6227 и 6435 Да для MT-I и МТ-П соответственно (Klto et al., 1982а). Ме-таллотионеин, выделенный из печени камбалы-тюрбо (Scophtalmus maximus), имел аминокислотный состав, спектральные характеристики и стехиометриче-ские свойства, харатерные для MT-I (George et al., 1992). Однако, несмотря на существенное структурное сходство МТ рыб с МТ млекопитающих и птиц, между ними существуют различия, связанные с отсутствием у рыб в N-концевой части МТ аспарагина в положении 4, а также, вероятно, с расположением антигенных эпитопов (КШе et al., 1992а; Hylland et al., 1994; Hylland et al., 1995). Например, кроличья антисыворотка к МТ окуня (Perca jluviatilis) давала перекрестную реакцию с МТ радужной форели (Oncorhynchus mykiss) и практически не связывалась с МТ лошади (Hogstrand, Haux, 1990). Этот феномен, как предполагается, связан со стереометрией остатков цистеина в А и В доменах (КШе et al., 1992b). Тем не менее, отличия по этому параметру зарегистрированы и между разными видами рыб, например между щукой и гольцом (КШе et al., 1995), но что удивительно, они проявлялись в большей степени внутри семейств, а не на уровне более крупных таксонов (Hylland etal., 1995).
Неметаллотионеиновые металлсвязывающие лиганды у гидробионтов
Экспозиция морской звезды Asterias rubens в течение 4 месяцев в воде, содержавшей 50 мкг Сс12+/л, приводила к индукции в цитозоле клеток пилориче-ского отростка Cd-МТПБ с молекулярной массой 10,8 кДа, концентрация которого достигала постоянного уровня через 8 недель после начала интоксикации (Besten et al., 1989; 1990). В цитозоле семенников или яичников этот белок не выявлен, а кадмий связывался с высокомолекулярными белками.
МТ и МТ-подобные белки у полихет. В донных сообществах морских экосистем в норме на долю многощетинковых червей приходится 70-90% общей биомассы (Ericksen et al., 1989). Многие виды полихет служат пищей для рыб-бентофагов и с этой точки зрения имеют определенное экономическое значение. Тем не менее число исследований, посвященных изучению влияния тяжелых металлов и других антропогенных факторов на биохимический статус этих организмов и, в том числе, на динамику МТ и МТПБ остается весьма незначительным. Показано, что аккумуляция кадмия из среды у вида Neantes аге-naceodentata была прямо пропорциональна концентрации свободных ионов в окружающей среде (Jenkins, 1991). Поглощенный металл был связан в основном с двумя Cd-связывающими МТ-подобными лигандами с молекулярными массами 9,7 и 5 кДа (Mason, Jenkins, 1990). МТПБ выявлены и у других аннелид, причем механизмы связывания тяжелых металлов с разными белковыми фракциями были одинаковы у растительноядных {Chetozone setosa, Pectinaria belgica, Orbinia norvegicd) и хищных (Goniada maculata, Lumbrineris fragilis) видов (Eriksen et al., 1988; 1989; 1990). Интересно, что Zn был ассоциирован, главным образом, с высокомолекулярными белками ( 35 кДа), a Ni - с лигандами очень малой молекулярной массы ( 4кДа). Си и Cd обнаружены во фракции МТПБ (10 кДа). В популяции малощетинкового червя Limnodrilus hoffmeisteri, обитающей в загрязненной металлами зоне, выявлены особи, имевшие генетически детерминированный высокий уровень МТПБ, которые обеспечивали им выживание в среде с повышенным уровнем Cd, Ni, Со (Klerks, Bartolomew, 1991). 1.4. Неметаллотионеиновые металле называющие лиганды у гидробионтов.
Нельзя не отметить того факта, что существует ряд исследований, в которых отмечено, что при воздействии на гидробионтов тяжелых металлов, в их организме обнаруживаются металл связывающие лиганды различной молекулярной массы, отличные от МТ. Так в тканях желтохвоста {Seriola quinqueradiatd) выявлены пептиды с молекулярными массами ниже 5 кДа, содержавшие Си и Zn (Takeda, Shimizu, 1982). В яичниках пятнистого горбыля Cynoscion nebulosus, неоплодотворенной икре и в икре через 12 часов после оплодотворения обнаружен Zn-связывающий белок с молекулярной массой в диапазоне 6-10 кДа, аминокислотный состав которого отличался от такового истинных МТ (Baer, Thomas, 1989), В печени карпа обнаружен неизвестный ранее белок с молекулярной массой 40 кДа, не обладавший свойствами МТ, который образуется после интраперитонеальной инъекции урана в дозе 1,5 мг/кг в течение 6 дней (Lee et al., 1992). Из печени антарктической ледяной рыбы (Chiono-draco hamatus) выделен Zn-связывающий белок, который, в отличие от МТ, характеризовался низким содержанием цистеина и высоким - глутаминовой и ас-парагиновой кислот (Scudiero et al., 1992). Под влиянием загрязнений в тканях некоторых видов пресноводных рыб происходят изменения фракционного состава низкомолекулярных пептидов с молекулярными массами от 500 до 10000 дальтон (Смирнов, Кирилюк, 1994).
Из цитозоля почек мидии Mytilus edulis был выделен низкомолекулярный Zn-связывающий лиганд с молекулярной массой около 1 кДа, с которым было связано наибольшее количество цитозольного цинка у моллюсков не подвергшихся воздействию загрязнений. В цитозоле почек мидий, подвергшихся воздействию Zn, рост концентрации металла был связан с этим низкомолекулярным лигандом (Pavicic et al., 1992). Неметаллотионеиновый белок, индуцированный ртутью, обнаружен в тканях М. edulis (Roesijadi et al., 1988). От MT он отличался тем, что, вероятно, имел димерную форму и необычно высокое со ф держание глицина. Из цитозоля улиток Nassarius reticulatus, добытых из загрязненных ТМ районов, выделен не-МТПБ с молекулярной массой 19 кДа, в составе которого найдены заметные количества ароматических аминокислот и гисти-дина, но было меньше, чем у МТ, цистеина (Andersen et al., 1989). Металл-связывающие свойства этого белка были существенно ниже, чем у МТ.
В гепатопанкреасе омара Homarus americanus выявлены неидентифици-рованные металл-связывающие лиганды с молекулярными массами в диапазоне 10-20 кДа, которые аккумулировали до 20% америция-241, поступившего с пищей (Goudard et al., 1991), У многощетинкового червя Neanthes arenaceodentata поступивший с пищей кадмий-109, ассимилировался в цитозоле с двумя Cd-связывающими белками - 9,7 и 5 кДа, первый из которых проявил свойства МТ (Mason, Jenkins, 1990). Тем не менее кинетика накопления и выведения Cd была связана, главным образом, с лигандом меньшей молекулярной массы. Для двух видов анне-лид - бентофага Chaetozone setosa и хищника Goniada maculata показана специфика в захвате разных ТМ белковыми фракциями (Eriksen et al., 1990). Так, Zn ассоциировался, главным образом, с высокомолекуярными белками ( 35 кДа), Ni — с лигандами очень малой молекулярной массы ( 4 кДа), а Си и Cd - с белками 10-20 кДа. Последние проявили очень высокое сродство к кадмию У двух других видов-бентофагов Pectinaria belgica и Orbinia norvegica медь, цинк и никель были ассоциированы как с высокомолекулярными белками, так и с пептидами очень малой молекулярной массы.
Применения спектрофотометрии при 250 нм для выявления сульфгидрильных групп в пептидах вместо метода Эллмана
К концу опыта (30 суток) этот показатель снизился до уровня 91,2 мкг/мл, в 1,4 раза превышавшего контрольное значение. В другой наиболее массивной фракции (Мм 6,8±0,6 кДа) сначала происходил рост концентрации пептидов в 1,7 раза (на 14-е сутки), затем, на 30-й день, уменьшение в 2,8 раза относительно 14-тисуточного варианта и в 1,6 раза относительно контроля. Последовательное нарастание доли пептидов по мере накопления ртути в организме крыс обнаружено в самой тяжелой фракции (Мм 8,3 кДа) — в 1.7 раза на 14-е сутки и в 6,9 раза на 30-е сутки. В других фракциях также за регистрировано существенное возрастание доли пептидов на 14-е сутки по сравнению с контролем (в 9 -12 раз), которые затем оставались практически неизменными до конца эксперимента. В составе НМ пептидов мускулатуры выявлено три фракции, оптически активные при 250 нм, Мм которых определены как 3,2, 4,2 и 6,8 кДа (рис. 11, Б). Наблюдалось полное качественное сходство с результатами, полученными по измерению при 207 нм, как у контрольных, так и у опытных животных. У крыс, подвергнутых воздействию нитрата ртути, на 14-е сутки обнаружено увеличение концентрации пептидов с Мм 3,2 и 6,8 кДа в 13,0 и 2,0 раза соответственно. На 30 сутки произошло снижение доли пептидов с Мм кДа в 1,8 раза относительно контрольных значений и 3,7 раза относительно 14-ти суточного варианта, а уровень пептидов с Мм 3,2 кДа практически не изменился. На протяжении всего эксперимента концентрации пептидов с Мм 4,2 кДа в контрольной и опытных группах оставались практически на одном уровне. Качественный и количественный спектральный анализ, проведенный при длине волны 207 нм, показал, что пептиды, экстрагированные из печени контрольных крыс, в диапазоне Мм 2,0 - 9,0 кДа разделялись на 9 фракций (рис. 12, А). Из рисунка видно, что наибольшее значение экстинкции в контроле приходилось на первую фракцию, которая соответствует молекулярной массе 8,2 кДа.
У крыс в опытных группах при ртутной интоксикации качественных изменений во фракционном составе НМ пептидов по сравнению с контролем не выявлено. Однако обнаружены существенные количественные различия. Так, концентрация пептидов во всех фракциях у опытных крыс на 14 сутки эксперимента снижалась в 2,5- 40 раз (табл. 7). Наиболее существенные различия обнаружены в самых низкомолекулярных фракциях (с Мм 2,7 - 1,6 кДа) - в 28 - 40 раз. Достигнутый уровень пептидов сохранялся фактически до конца эксперимента в большинстве фракций за исключением некоторого снижения концентрации пептидов с Мм 3,5 и 3,2 кДа (в 1,8 - 3 раза) и ее роста в 1,3-5 раз во фракциях с Мм 1,6 - 2,9 кДа по сравнению с 14-ти суточной интоксикацией ртутью.
В составе низкомолекулярных пептидов печени контрольных крыс наивысшая концентрация соединений, оптически активных при 250 нм, зарегистрирована во фракциях с Мм 6,1; 5,6 и 2,7 кДа (рис. 12, Б). В печени опытных животных на протяжении всего эксперимента (30 суток) во фракционном составе НМ пептидов качественных изменений не обнаружено. Динамика количественных изменений этих фракций отличалась от таковой общих пептидов.
На 14-е сутки у опытных крыс наблюдали резкое снижение концентрации пептидов с Мм 6,1; 2,9 и 2,7 кДа (в 2,7; 2 и 2,3 раза соответственно). Во фракции 3,5 кДа отмечен рост в 1,6 раза концентрации соединений, поглощавших при 250 нм. На 30-е сутки концентрация пептидов с Мм 6,1 и 2,9 кДа возросла относительно 14-суточного эксперимента в 1,3 и 2,5 раза соответственно. Кроме этого, уровень пептидов с Мм 2,9 кДа в 1,3 раза превысил контрольные значения.
Таким образом, проведенные исследования показали, что при хронической интоксикации ртутью продолжительностью до 30-ти суток в печени крыс на фоне неизменного качественного фракционного состава пептидов происходили количественные изменения, варьировавшие в зависимости от длительности воздействия, что особенно четко проявилось на пептидах, оптически активных при 250 нм.
На рис. 13, А представлены реконструкции хроматограмм низкомолекулярных пептидов почек контрольной и опытных групп крыс, построенные по данным экстинкции при 207 нм. По сравнению с другими исследованными тканями в почках контрольных животных в диапазоне Мм 1,5 - 8,0 кДа выявлено максимальное количество фракций - до 14. Качественные измене 79 ния при ртутной интоксикации в течение всего периода наблюдений (30 суток) описанным выше методом ЖХНД не выявлены. На 14-е сутки от начала эксперимента по сравнению с контролем наблюдалось увеличение количества пептидов во всех выявленных фракциях, но наиболее заметным оно было во фракциях с Мм 5,6 (1,4 раза), с Мм 2,4 - 1,4 кДа (3,1 — 4,3 раза) (табл. 8). На 30-е сутки продолжился рост концентрации пептидов практически во всех фракциях, но наиболее существенно увеличилась относительно контрольных значений доля пептидов в зонах 1,4 (5,6 раза); 1,8 (7,9 раза); 2,4 (5,1 раза) и 5,1 (4,4 раза) кДа.
При анализе низкомолекулярных соединений, оптически активных при 250 нм, обнаружено, что наибольшее количество пептидов в почках контрольных крыс находилось в диапазоне Мм 2,5 — 4,2 и 6,1 кДа и выше (рис. 13, Б). Проведенные эксперименты показали, что не происходило качественных изменений фракционного состава соединений, поглощавших при 250 нм, ни в процессе 14-ти суточной интоксикации ртутью, ни через 30 суток. Однако, поступление ртути в организм крыс привело к существенному количественному перераспределению пептидов во фракциях. Так на 14-е сутки эксперимента наблюдался резкий рост концентрации пептидов во фракциях с Мм 6,1; 3,8; 2,7; 2,0 и 1,5 кДа в 1,7 - 6,3 раза. Затем на 30-е сутки уровень пептидов с Мм 6,1; 2,7; 1,5 кДа снизился. Во фракции с Мм 4,2 кДа произошло дальнейшее увеличение концентрации пептидов в 2,6 раза по сравнению с другими вариантами эксперимента, а в зоне Мм 1,8 кДа - в 1,9 раза по сравнению с данными 14-ти суточного опыта ив 13,5 раза по сравнению с контролем.
Возрастные изменения состава низкомолекулярных пептидов в мускулатуре самок
С целью изучения влияния экологических условий на биохимический статус рыб было проведено сравнительное исследование фракционного состава низкомолекулярных пептидов мускулатуры окуней, выловленных из озер Дубровское, Мотыкино и Змеиное, расположенных на территории Дарвиновского заповедника. Имея различный размер и гидрохимическую характеристику (табл. 18) эти озера объединяет то, что все они являются ацидными водоемами, имеющими рН воды ниже 5,0. Дополнительно можно указать, что высокая цветность воды озер Дубровского и Змеиного по сравнению с Мотыкино связана с растворимой органикой (РОВ), основу которой составляют гуминовые и фульвокислоты (Комов, Степанова, 1994), то есть Дубровское и Змеиное это темноводные ацидные озера, а Мотыкино - светловодное ацидное озеро с минимальным по сравнению с первыми двумя уровнем эвтроф икации.
Для анализа количественного распределения пептидов по фракциям в мускулатуре использовали окуней без учета их возраста и половой принадлежности. Как показал анализ содержания ртути, ее уровень во всех трех вариантах был близок и находился в пределах 0,27 — 0,61 мг/кг.
Прежде чем начать описание полученных результатов, необходимо отметить факт сходства фракционного состава мышц окуней, выловленных из вышеописанных озер, с таковыми, использованными в аквариальном эксперименте (выловлены из озер Дарвиновского заповедника).
Выше уже отмечалось различие по этим показателям между окунями из аквариального эксперимента и рыбами, отловленными в водоемах Карелии. Эти данные могут свидетельствовать о наличии межпопуляционной специфики фракционного состава пептидов мускулатуры у окуней.
Обнаружены различия между образцами мускулатуры окуней, выловленных из разных озер (табл. 19). Так, у окуней из оз. Дубровское во фракциях НМ пептидов мышц с Мм 5,7; 2,9 и 2,6 кДа показан самый высокий по сравнению с другими вариантами уровень пептидов. У окуней из оз. Змеиное такой была фракция с Мм 6,8 кДа, у рыб из оз. Мотыкино число таких фракций было максимальным - 5 (Мм соответствовали 5,3; 4,8; 1,8; 1,7 и 1,6 кДа). Но несмотря на то, что по концентрации пептидов во фракциях во всех вариантах есть своя, хоть и незначительная, специфика, тем не менее, на наш взгляд, четко проявляется тенденция на сближение уровней пептидов у окуней из оз. Дубровское и Змеиное и отличие от рыб из оз. Мотыкино. Это заметно в семи фракциях из одиннадцати. Например, концентрация пептидов с молекулярной массой 6,8 кДа в мышцах окуней из озер Дубровское и Змеиное была в 25-85 раз выше таковых рыб оз. Мотыкино, с Мм 5,7 кДа — в 1,3 раза. В остальных пяти фракциях (с Мм 5,3, 4,8, 1,8, 1,7 и 1,6 кДа) уровень пептидов в мускулатуре рыб из светловодного олиготрофного водоема (Мотыкино) был выше, чем в мышцах окуней из темноводных эвтрофицирован-ных водоемов (озера Дубровское и Змеиное). превышала ±5-10 % среднего (М), для минорных фракций достигала ±50 %.
Анализ оптической активности фракций при 250 нм (рис. 32) не показал наличия каких-либо определенных тенденций в распределении пептидов во фракциях мышц окуней ни в одном из вариантов. Тем не менее, ряд особенностей заслуживает, на наш взгляд, некоторого внимания. Так, наивысший уровень экстинкции обнаружен во фракции с Мм 2,9 к Да у окуней из оз. Мотыкино, который у рыб из оз. Дубровское был минимальным. Кроме того для особей из Дубровского характерна существенно более высокая относительно других вариантов оптическая плотность пептидов во фракциях с молекулярными массами 6,8 и 6,0 к Да и более низкая в других фракциях. Причина этого факта остается пока неясной, стоит лишь отметить то обстоятельство, что озеро Дубровское, как видно из табл. , характеризуется более высокими по сравнению другими озерами цветностью, уровнем аммонийных ионов, растворимого органического вещества (РОВ) и очень низким уровнем растворенного кислорода, т.е. по своим гидрохимическим показателем оно наименее пригодно для жизни в нем гидробионтов, что, видимо, и отразилось на уровне низкомолекулярных соединений, оптически активных при 250 нм, в мускулатуре окуней, обитающих в этом озере.
Проведен сравнительный анализ количественных вариаций фракций пептидов в мускулатуре окуней, отловленных в светловодных олиготрофных озерах Чучъярви (Карелия), Мотыкино (Дарвиновский заповедник) и темно-водных мезотрофных озерах Вуонтеленъярви (Карелия) и Дубровское (Дарвиновский заповедник) (рис. 33). На рисунке видно, что исследованные окуни имели как региональные и половые особенности в реакции пептидного пула мускулатуры на процесс эвтрофикации, так и общие тенденции. Региональные различия проявились во фракциях с Мм 6,0; 5,3 и 1,7 кДа. Тенденция в изменении концентрации пептидов у рыб из эвтрофицированных водоемов Дарвиновского заповедника в этих фракциях была противоположной таковой показателей рыб из аналогичных водоемов Карелии, 1 - самцы (Вуонтеленъярви/Чучъярви); 2 - самки (Вуонтеленъярви/Чучъярви); 3 - особи из Дубровского/Мотыкино; 4 - особи из Змеино-го/Мотыкино; по оси ординат - кратность отношения концентрации пептидов в мускулатуре окуней из мезотрофных водоемов к таковой рыб из олиготрофных; по оси абсцисс - молекулярные массы фракций, к Да.
Региональное сходство и одновременно половые различия выявлены во фракциях с Мм 1,8 и 1,6 кДа. В первом случае одинаковая реакция была характерна для самцов из карельских озер и особей из озер Дарвиновского заповедника, а во втором - для самок.
Но наиболее интересным представляется факт однонаправленности вектора изменения соотношений концентраций пептидов в мускулатуре между рыбами из светлых и темных озер вне зависимости от региона вылова, обнаруженный во фракциях с Мм 5,7 и 4,8 кДа. На наш взгляд, эти данные свидетельствуют о том, что сдвиг в экологических условиях водоема, связанный с нарастанием уровня эвтрофикации, вызывает у окуней соответствующую ответную реакцию, биохимических систем, в частности, белкового метаболизма, которая проявляется в вариации концентраций пептидов в разных фракциях, но, общим для данного вида рыб является изменение именно во фракциях с Мм 5,7 и 4,8 кДа. Скорее всего этот процесс носит адаптивный характер.
