Введение к работе
диссертационного совета Русских Г.С.
Актуальность темы
В настоящий момент повышенный интерес исследователей во всем мире вызывают аденозин и аденозиновые рецепторы (АР), как ключевые регуляторы множества тканевых функций.
Аденозин – эндогенный нуклеозид, продукт метаболизма АТФ (Kunapuli, S. P., Daniel, J. L., 1998), в повышенных количествах высвобождается из клеток в различных ситуациях, включая гипоксию, воспаление и повреждение клеток (Fredholm B.B., 2007). Действуя паракринно на АР типов A1, A2A, A2B, A3 окружающих клеток, аденозин вызывает ряд эффектов, как про-, так и противовоспалительного характера (выброс медиаторов воспаления, изменение направления дифференцировки клеток). Тем самым, аденозин является своего рода «сигнализацией», сообщающей окружающим клеткам о патологическом состоянии ткани. В ответ на сигнал клетки развивают приспособительные реакции (Hasko G., 2008).
Дисбаланс в системе взаимоотношений аденозин – АР может способствовать возникновению и развитию ряда различных заболеваний с резко выраженным воспалительным компонентом в патогенезе: бронхиальной астме (Spicuzza L, 2006), ревматоидному артриту (Montesinos, M.C., 2007), болезни Крона (Kolachala V.L., 2008; Hasko G., 2008).
Для установления механизмов развития процесса воспаления одним из центральных звеньев является рецепторная передача сигнала. Важным моментом является установление связи между активностью тех или иных рецепторов на клетках иммунной системы с их дифференцировкой, а также секрецией ими про- и противовоспалительных медиаторов. Важнейшими клетками при развитии воспалительных реакций, наряду с нейтрофилами, макрофагами, лимфоцитами и прочими клетками иммунной системы, являются дендритные клетки (ДК) (Duez C, 2006; Fransen JH, 2010). Данные клетки для исследований in vitro получают главным образом из моноцитов путем культивирования с интерлейкином 4 (ИЛ-4) и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ), что соответствует происходящему in vivo процессу. На животных моделях было показано, что провоспалительным действием обладают главным образом ДК именно моноцитарного происхождения (Peters JH, 1993; Yona S, 2010; Clark G, 2010).
Влияние активации АР на дифференцировку моноцитов в ДК (в том числе: изменение уровней мРНК АР разных типов, мРНК цитокинов, поверхностной экспрессии рецепторов, секреции цитокинов в окружающие клетки среду) на данный момент изучено слабо (Hasko G., 2008; Novitskiy SV, 2008).
ДК моноцитарного происхождения, дифференцированные в присутствии аденозина, никогда ранее не изучались на начальном этапе их дифференцировки (38 часов), тогда как именно этот этап характеризуется высокой синтетической активностью (Novitskiy SV, 2008). Вместе с тем, было показано, что действие высоких концентраций аденозина (30 М) на АР типа A2B при дифференцировке моноцитов в ДК приводит к формированию на шестые сутки клеток, характеризующихся одновременным присутствием как рецепторов, свойственных для ДК, так и рецепторов, свойственных для моноцитов. Также для этих клеток была характерна высокая продукция интерлейкина 6 (ИЛ-6), интерлейкина 8 (ИЛ-8) и фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) (значительно более высокая, по сравнению как с «обычными» ДК, дифференцированными в отсутствие аденозина, так и по сравнению с моноцитами) (Novitskiy SV, 2008). Перечисленные цитокины обладают провоспалительным и фибротическим действием, способны поддерживать воспаление и вызывать ремоделирование (Eddahibi S, Chaouat A, 2006; Papaioannou AI, 2006; Tuder RM, 2008; Геренг Е.А., 2011). Таким образом, дифференцированные в присутствии высоких концентраций аденозина ДК могут в значительной степени опосредовать развитие и поддержание воспаления, и приводить к наиболее тяжелому течению бронхиальной астмы, характеризующемуся ремоделированием, устойчивой обструкцией, нейтрофильной инфильтрацией.
Для изучения процесса воспаления используют экспериментальные модели, реализованные на животных (Doganci A, 2005; Zaynagetdinov R, 2010; Alcorn JL, 2011). В то же время, данные, полученные на таких моделях, нельзя переносить на человека, так как иммунная система человека имеет существенные отличия от иммунной системы любого животного (Hasko G., 2008). Течение воспалительных процессов у человека изучают в рамках заболеваний, в которых воспалительный компонент является ведущим: хронической обструктивной болезни легких, бронхиальной астмы, ревматоидного артрита, болезни Крона.
Участие аденозина в патологических процессах при бронхиальной астме не вызывает сомнений в силу ряда фактов. Повышенный уровень аденозина обнаружен в жидкости бронхоальвеолярного лаважа и конденсате выдыхаемого воздуха у больных БА (Driver et al, 1993; Huszar et al, 2002; Csoma et al, 2005). Аденозин провоцирует бронхоконстрикцию только у астматиков, но не у здоровых людей (R. Polosa, S. T. Holgate, 2006). Действие аденозина на АР типа A2B легочных фибробластов способствует их дифференцировке в миофибробласты, которые продуцируют избыточное количество внеклеточного матрикса, приводя в конечном итоге к фиброзу и ремоделированию ткани легких при астме и ХОБЛ (Zhong H., 2005).
Изучение связи активации аденозиновых рецепторов на дендритных клетках человека и секреции плейотропных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8 и ФРЭС) этими клетками поможет раскрыть фундаментальные механизмы развития воспаления и обозначить критические точки механизмов, необходимых для разработки лекарственных препаратов, в том числе для терапии БА. Такое исследование будет иметь большое значение для медико-биологической науки.
При высоких концентрациях аденозина, наблюдаемых в очаге воспаления (до ~30-100 M), свою активность проявляют не только высокоаффинные рецепторы типов А1, А2А, А3, но и низкоаффинные – типа A2B. Интерес представляют многие аспекты функционирования данных рецепторов, в том числе механизмы взаимодействия аденозина и других известных лигандов с лиганд-связывающим центром АР A2B. Расчеты лиганд-рецепторных взаимодействий удобно производить при помощи компьютерного моделирования (Baxevanis, A.D., 2001). Наименее затратными и в то же время качественными методами расчетов являются молекулярно-механические методы (Беленикин М. С., 2002). Построение моделей АР типа A2B возможно сделать на основании моделирования по гомологии с рецептором типа A2A (существует точная компьютерная модель последнего, полученная при помощи рентгеноструктурной кристаллографии) (Jaakola V. P., 2008).
В связи с перечисленными выше фактами была поставлена цель исследования.
Цель исследования
Изучить роль аналога аденозина в изменении фенотипических свойств дендритных клеток человека моноцитарного происхождения при бронхиальной астме.
Задачи исследования
1. Оценить количества CD1a, CD14, CD209 на мембранах дендритных клеток моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки при стимуляции клеток аналогом аденозина.
2. Исследовать уровни мРНК аденозиновых рецепторов (A1, A2A, A2B, A3) в дендритных клетках моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки при стимуляции аналогом аденозина.
3. Изучить уровни мРНК интерлейкина 6, интерлейкина 8, фактора роста эндотелия сосудов в дендритных клетках моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки при стимуляции аналогом аденозина, а также концентрации данных цитокинов в культуральной среде дендритных клеток.
4. Оценить взаимосвязи между фенотипом (экспрессия CD1a, CD14, CD209, аденозиновых рецепторов типов A1, A2A, A2B, A3), функциональными характеристиками дендритных клеток (уровни продукции мРНК и белка интерлейкина 6, интерлейкина 8, фактора роста эндотелия сосудов) и интенсивностью воспалительного процесса у больных бронхиальной астмой.
5. При помощи компьютерного моделирования изучить взаимодействие аминокислотных остатков, образующих лиганд-связывающий центр аденозинового рецептора A2B, с известными активаторами и ингибиторами аденозиновых рецепторов.
Научная новизна работы
Впервые дана функциональная характеристика дифференцированных в присутствии аденозина дендритных клеток моноцитарного происхождения человека на начальной стадии дифференцировки.
Получены данные об уровнях экспрессии поверхностных маркеров (CD1a, CD14, CD209), об уровнях экспрессии аденозиновых рецепторов всех четырех типов (A1, A2A, A2B, A3) и цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8, ФРЭС), а также об уровнях продукции этих цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8, ФРЭС).
Установлены взаимосвязи между интенсивностью воспалительного процесса при бронхиальной астме и вышеперечисленными показателями.
Впервые обнаружены межиндивидуальные различия в степени чувствительности дендритных клеток к действию аденозина. Чувствительность к аденозину выражается в аденозин-зависимом увеличении накопления клеток с сочетанием рецепторов CD1a-/lowCD14+CD209+. Частота встречаемости лиц с высокой чувствительностью ДК к аденозину зависит от степени тяжести бронхиальной астмы.
Повышение уровня мРНК АР типа А2А у больных БА под действием аналога аденозина NECA в научной литературе ранее не встречалось.
При помощи компьютерного моделирования установлено. что активаторы образуют водородные связи с остатками аминокислот Ile67, Phe173 и Glu174 чаще, чем ингибиторы. Взаимодействие этих аминокислотных остатков преимущественно с активаторами обнаружено впервые. Возможно, именно они в первую очередь ответственны за активацию АР типа A2B.
Научно-практическая значимость работы
Полученные сведения о фенотипических и функциональных характеристиках дендритных клеток моноцитарного происхождения человека на ранней стадии дифференцировки могут быть использованы при разработке новых противовоспалительных средств – блокаторов аденозиновых рецепторов, а также при разработке новых схем лечения на основании таких средств-блокаторов.
Положения, выносимые на защиту
1. Дендритные клетки человека моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки обладают различной способностью к изменению фенотипа под действием аналога аденозина – NECA, зависящей от наличия или отсутствия БА, степени тяжести БА и индивидуальных особенностей. Изменение фенотипа под действием NECA у больных БА отличается от такового у практически здоровых людей повышением количества мРНК аденозинового рецептора типа А2А; у больных БА легкой и средней степеней тяжести – повышением количества мРНК интерлейкина 8, у практически здоровых людей – понижением секреции интерлейкина 8.
2. Аминокислотные остатки Ile67, Phe173 и Glu174 лиганд-связывающего центра аденозинового рецептора типа A2B образуют водородные связи с активаторами аденозиновых рецепторов, в то время как для ингибиторов не удается выделить специфичные к ним аминокислотных остатков.
Апробация работы
Материалы данного исследования доложены и обсуждены на научных семинарах кафедры биохимии и молекулярной биологии СибГМУ (2011 г.); на научных семинарах центральной научно-исследовательской лаборатории СибГМУ (2009 – 2011 гг.); на XI и XII научных конференциях (2010 и 2011 гг.) «Конгресс Молодых ученых с международным участием «Науки о человеке»»; на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (2011); на III Международной Студенческой Научной Конференции с участием молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины", посвященной 50-летию Медицинского Факультета РУДН (2011).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 7 работ в центральной и местной печати, из них 2 – в журналах из списка ВАК.
Объем и структура диссертации.
Диссертация содержит 191 страницу машинописного текста, иллюстрирована 31 таблицей и 9 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Указатель литературы содержит 173 работы, из которых 157 принадлежат зарубежным авторам.
