Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы
Биологические свойства и функции внеклеточной ДНК человека 12
1.1.1 Концентрация внеклеточной ДНК в биожидкостях 13
1.1.2 Размеры фрагментов внеклеточной ДНК 14
1.1.3 Модификация оснований внеклеточной ДНК 16
1.2 Происхождение фрагментов внеклеточной ДНК в организме 17
1.3 Микроокружение внеклеточной ДНК 1.4 Взаимодействие внеклеточной ДНК с
клетками 22
1.4.1 Белки семейства «toll-like» рецепторов (TLR) 23
1.4.1.1 Лиганды для белков TLR9. 25
1.5 TLR9-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRF-cигнальные пути 27
1.6 Роль цитокинов в организме 36
1.6.1 Провоспалительные цитокины 37
1.6.2 Противовоспалительные цитокины 39
2 Материалы и методы 42
2.1 Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток 42
2.1.2 Исследование экспрессии клетками поверхностных белков 45
2.2 Определение концентрации повторяющейся последовательности ДНК человека в крови 46
2.3 Конструирование плазмиды п(рДНК) 48
2.4 Выделение РНК из мезенхимальных стволовых клеток 49
2.4.1 Обработка выделенной РНК ДНКазой 50
2.4.2 Определение концентрации РНК 50
2.5 Выделение ДНК из мезенхимальных стволовых клеток 50
2.5.1 Определение концентрации ДНК 51
2.6 Постановка полимеразцой цепной реакции .
2.6.1 Проведение реакции обратной транскрипции 51 2.6.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени 52
2.7 Иммуногистохимия 54
2.7.1 Связывание антител с NF-kB 54
2.7.2 Связывание антител с TLR9 2.8 Иммуноферментный анализ секреции цитокинов 55
2.8.1 Иммуноферментный анализ секреции цитокина IL-10 55
2.8.2 Иммуноферментный анализ секреции цитокина TNF 58
2.9 Определение активности каспазы 3 61
2.10 Статистическая обработка результатов 61
3 Результаты и обсуждения 62
3.1 Рецепторы, отвечающие на действие CG-богатой внеклеточной ДНК 62
3.1.1 Определение экспрессии мРНК TLR9 в мезенхимальных стволовых клетках, при действии на них вкДНК, модельной п(рДНК) и ДНК Е.coli 66
3.2 Исследование сигнальных путей, активирующихся в мезенхимальных стволовых клетках в ответ на действие фрагментов п(рДНК) 73
3.2.1 Кинетика изменения во времени экспрессии мРНК TLR9 и адаптера TLR-сигнального пути – MyD88 в ответ на стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК). 73
3.2.2 Aктивация NF-kB -, JNK/p38-, IRF- сигнальных путей в ответ на стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК) 76
3.2.3 Транслокация NF-kB в ядро мезенхимальных стволовых клеток при действии фрагментов п(рДНК)
3.2.4 П(рДНК) стимулирует увеличение количества мРНК цитокинов
IL10 и TNF
3.3 Снижение ферментативной активности каспазы 3 в мезенхимальных стволовых клетках при действии модельных фрагментов внеклеточной ДНК 89
Обсуждение результатов 90
Выводы 94
4 список литературы
- Модификация оснований внеклеточной ДНК
- Определение концентрации повторяющейся последовательности ДНК человека в крови
- Определение экспрессии мРНК TLR9 в мезенхимальных стволовых клетках, при действии на них вкДНК, модельной п(рДНК) и ДНК Е.coli
- Снижение ферментативной активности каспазы 3 в мезенхимальных стволовых клетках при действии модельных фрагментов внеклеточной ДНК
Введение к работе
Актуальность проблемы. Внеклеточная ДНК (вкДНК) в норме присутствует в плазме крови человека и в межклеточном веществе. До сих пор остаются невыясненными вопросы ее происхождения, однако в литературе обсуждаются две главных модели. Первая из них предполагает, что появление вкДНК связано с гибелью клеток в организме, вероятнее всего, посредством апоптоза. Фрагменты ДНК погибших клеток поступают в кровь и циркулируют в организме. В рамках второй модели вкДНК появляется в межклеточном веществе в результате секреции клетками фрагментов ДНК. В ряде независимых исследований показано, что в крови пациентов с различными патологиями концентрации вкДНК существенно возрастают [Вейко и соавт., 2007]. Поэтому на данный момент наибольший интерес научного сообщества вызывает ее применение в диагностике различных заболеваний.
До недавнего времени предполагалось, что вкДНК не влияет на
функционирование клеток организма. Однако было показано, что вкДНК
существенно отличается от ядерной ДНК (яДНК) по ряду свойств.
Установлено, что вкДНК в отличие от яДНК обогащена повторяющейся
последовательностью - транскрибируемой областью рибосомного повтора
(ТОрДНК) [Костюк и соавт., 2006; Вейко и соавт., 2007], которая аналогично
бактериальной ДНК является потенциальным иммуномодулятором, также
было показано, что вкДНК и фрагмент ТОрДНК обладает стимулирующим
действием на лимфоциты человека [Вейко и соавт., 2006]. Кроме того,
отмечено, что активирующее действие ТОрДНК на клетки иммунной
системы опосредуется через белки семейства «Toll-like» рецепторов,
обозначаемыми как TLR [Вейко и соавт., 2006].
Однако остается не известным, оказывают ли воздействие фрагменты вкДНК на свойства мезенхимальных стволовых клеток.
За последнее время достигнуты большие успехи в изучении биологии
стволовых клеток, но остается еще много вопросов, связанных с их
взаимодействием с клетками микроокружения, а также ролью различных
сигнальных путей в регуляции стволовых клеток. Стволовые клетки
обладают уникальными свойствами: они представляют собой
неспециализированные клетки, не имеют тканеспецифических маркеров и поддерживают статус недифференцированных клеток. При действии определенных биологических сигналов стволовые клетки способны дифференцироваться в специализированные клетки [Morrison et al., 2006]. Применение эмбриональных стволовых клеток открывает широкие возможности для клинической практики, но вызывает большое количество этических проблем. Поэтому в настоящее время все больше внимания уделяется изучению свойств стволовых клеток из других источников. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются предшественниками клеток мезенхимальной линии, это хрящевая, костная, жировая и мышечные
ткани. МСК достаточно легко выделяются из костной и жировой тканей, а также из других источников, и быстро растут в лабораторных условиях. Кроме того, мезенхимальные стволовые клетки способны оказывать иммуносупрессорное действие посредством индукции регуляторных Т-лимфоцитов и дендритных клеток [Stagg, 2007]. Эти свойства способствуют применению мезенхимальных стволовых клеток в практической медицине. В то же время не полностью изучена регуляция этих клеток и сигнальные пути, активирующиеся при их взаимодействии с клетками организма, поскольку эти сигнальные пути образуют сложную сеть.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является изучение влияния внеклеточной
ДНК и ее фрагментов на мезенхимальные стволовые клетки, посредством
моделирования in vitro ситуации, когда эндогенные мезенхимальные
стволовые клетки, мигрирующие из ниши в очаги повреждения, или
мезенхимальные стволовые клетки, введенные в организм с целью терапии, контактируют с ГЦ-богатой вкДНК, которая в норме и при патологии содержится в плазме крови.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Отработать адекватные условия культивирования МСК, полученных из жировой ткани;
-
Выявить рецепторы в МСК, которые активируются в ответ на действие вкДНК;
-
Изучить сигнальные пути, участвующие в ответе МСК на действие модельного ГЦ-богатого фрагмента вкДНК;
-
Проследить, какие механизмы выживаемости активируются в МСК при контакте с ГЦ-богатыми фрагментами вкДНК;
Научная новизна. Впервые показано активирующее действие вкДНК и ГЦ-богатого фрагмента (ТОрДНК) на мезенхимальные стволовые клетки человека, сопровождающееся усилением синтеза РНК и высокой продукцией цитокинов IL10 и TNF.
Установлено, что стимулирующее действие вкДНК и ТОрДНК на мезенхимальные стволовые клетки человека реализуется посредством активации рецепторов из семейства «toll-like» (в частности TLR9), которые узнают ГЦ-богатые последовательности ДНК.
Впервые показано, что плазмида (п(рДНК)), содержащая в своем составе фрагменты ТОрДНК, активирует в мезенхимальных стволовых клетках TLR9-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRF-cигнальные пути.
Научно-практическая значимость работы. В последнее время терапия стволовыми клетками приобретает все более актуальное значение для лечения заболеваний, сопровождающихся дегенерацией тканей. Массовая гибель клеток, пересаженных в очаг поражения тканей, остается серьезной проблемой в трансплантологии. Для того, чтобы повысить
жизнеспособность пересаживаемых мезенхимальных стволовых клеток, проводят предварительную обработку клеток, в частности, TNF [Yao et al., 2009] или синтетическими олигонуклеотидами (ГЦ-ОДН) [Tomchuck et al., 2008]. Эффективность этой предварительной обработки в значительной степени зависит от активации NF-kB и его транслокации в ядро [Yao et al., 2009]. Полученные данные указывают на то, что культивирование мезенхимальных стволовых клеток с ГЦ-богатой плазмидой п(рДНК) в низких концентрациях (50 нг/мл) в течение короткого времени вызывает стимуляцию TLR9, что приводит к активации и транслокации NF-kB в ядро. П(рДНК) может быть использована для предварительной обработки культуры пересаживаемых мезенхимальных стволовых клеток, наряду с предлагаемой обработкой стволовых клеток синтетическими ГЦ-ОДН для стимуляции TLR9.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на международной конференции «CNAPS VII: Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum» (Мадрид Испания, 2011), на научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва, 2011), на XXI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009) и на XXIII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, включенных в список, рекомендованный ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, 4 главы, состоящих из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 113 страницах текста, иллюстрирована 27 рисунками, включает 6 таблиц. Список литературы состоит из 155 источников, из них 145 зарубежных авторов.
Модификация оснований внеклеточной ДНК
История изучения биологии циркулирующих нуклеиновых кислот ведет свое начало с 1948 года, когда исследователи Мендель и Метаис впервые обнаружили их в плазме крови человека. С тех пор нуклеиновые кислоты были обнаружены как в различных циркулирующих жидкостях в организме животных, так и в межклеточном веществе в тканях, а также в средах культивирования различных клеток растений [Gahan et al., 2008]. Этот факт был подтвержден также на бактериях и клетках растений [Peters and Pretorius, 2011]. Фрагменты ДНК, которые были выделены из жидкостей организма, принято называть внеклеточной ДНК (вкДНК), экстрацеллюлярной ДНК, внехромосомной ДНК, ДНК плазмы, cell-free DNA, circulating DNA [Gahan et al., 2008; Peters and Pretorius, 2011]. Особое внимание уделяется вкДНК после того, как современные методы позволили провести анализ первичной структуры очень маленьких фрагментов ДНК. Отдельное внимание уделяется совершенствованию методов анализа фрагментов измененной ДНК опухоли, которые циркулируют в крови пациента, или ДНК плода, частицы которой можно обнаружить в крови матери. ВкДНК используется как маркер патологии при аутоиммунных заболеваниях, диабете, травмах, инсультах, инфарктах миокарда и т.д. Вопросу использования феномена вкДНК в диагностике различных заболеваний посвящено много работ и обзоров (обзор [Tong et al., 2006]). Для того, чтобы понять влияние вкДНК на жизненноважные процессы организма, необходимо изучить свойства вкДНК и характер взаимодействия фрагментов вкДНК с клетками организма.
К свойствам вкДНК относят следующие характеристики: концентрация фрагментов в биожидкости, наличие однонитевых разрывов цепи и длина фрагментов, изменение последовательностей во вкДНК по сравнению с геномной ДНК, модификация функциональных групп ДНК. 1.1.1 Концентрация внеклеточной ДНК в биожидкостях
Внеклеточная ДНК является нормальной составляющей крови и может быть обнаружена в плазме крови любого человека. Однако уровень ДНК в образцах плазмы крови здоровых людей довольно низкий. Его оценки сильно различаются в зависимости от способа измерения и выборки доноров. Обычно значения нижней границы диапазона близки – около 3,6-5 нг/мл [Suzuki et al., 2008], однако в некоторых исследованиях наблюдается существенный разброс данных, например, 1,8-36 нг/мл [Gahan and Stroun, 2010].
На данный момент считается перспективным направлением исследований изучение диагностического значения концентраций вкДНК. При патологических состояниях концентрация вкДНК, как правило, значительно увеличивается [Umetani et al., 2006; Zhong et al., 2006]. Отмечены колебания концентрации вкДНК при инфарктах. При остром инфаркте концентрация вкДНК значительно растет по сравнению с нормой (от 36,3±23,8 нг/мл до 511±398 нг/мл), и изменение ее концентрации коррелирует с изменениями количества традиционных маркеров инфаркта, например, тропонина. Впрочем, в этом исследовании не учитывался размер поврежденной области, что может объяснить широкий разброс данных. Концентрация вкДНК может служить хорошим критерием для прогноза отдаленных последствий инфаркта миокарда. По сравнению с контрольной группой (пациенты, не имевшие осложнений), где концентрация составила 475-530 пг/мкл, в группах, где развились осложнения, она была больше: 1060 пг/мкл у пациентов с развившейся позднее сердечной недостаточностью; 1000 пг/мкл у пациентов, у которых позже повторился инфаркт; 1350 пг/мкл у пациентов с последующей остановкой сердца и 725 пг/мкл у пациентов, повторно поступивших через 6 месяцев после первой госпитализации [Butt and Swaminathan, 2008].
Что касается онкологических заболеваний, на данный момент измерение концентрации вкДНК в крови не позволяет отличить рак от других заболеваний; однако увеличение ее концентрации однозначно свидетельствует о развитии болезни, а снижение – о выздоровлении или ремиссии [Gahan and Swaminathan, 2008].
Помимо этого, изучалось участие вкДНК в развитии асептического воспаления, например, при интенсивной физической нагрузке. В группе покоя концентрация вкДНК составила 18,01 пг/мкл, после бега на длинную дистанцию она возросла до 334,4 пг/мкл, но уже через два часа упала практически до исходного значения – 30,44 пг/мкл [Butt and Swaminathan, 2008]. Таким образом, даже у здорового человека концентрация вкДНК в крови может существенно колебаться.
Показано также нахождение фетальной вкДНК в плазме материнской крови; однако она меньше по размерам ( 300 п.н., в то время как материнская 300 п.н.). В настоящее время делаются попытки диагностировать по вкДНК, выделенной из материнской крови, как материнские заболевания (преэклампсия, замедление внутриматочного развития), так и болезни плода (резус-несовместимость, -талассемия). Производятся попытки с помощью метилированных специфических маркеров фетальной ДНК диагностировать анеуплоидию. Параллельно налаживается технология ранней диагностики пола [Gahan and Swaminathan, 2008].
Таким образом, поиск применения вкДНК крови в диагностике является активно развивающимся направлением. И несмотря на то, что на данный момент большинство оценок носит количественный характер, уже найдены некоторые основные корреляции и делаются попытки качественной диагностики конкретных заболеваний [Gahan and Swaminathan, 2008].
Определение концентрации повторяющейся последовательности ДНК человека в крови
Вероятно, что три адаптера используются не всеми TLR: TRIF, TRAM и Mal/ TIRAP/ TICAM-2. MyD88, четвертый, используется всеми TLR, исключая TLR3. Комбинация взаимодействия различных TLR с различными адаптерными молекулами активирует каскад киназ, что в конечном счете, ведет к активации комплекса определенных генов [Vogel et al., 2003].
MyD88 играет ключевую роль при прохождении сигнала через TLR9 при действии ГЦ- ДНК [Janssens et al., 2002; Tobias et al., 2005; Seya et al., 2005] (рис. 4). При активации TLR9 лигандом, MyD88 в комплексе с остальными адаптерами, типа Маl, действует на киназы семейства IRAK (IL-1R-ассоциированных серин/треониновых протеинкиназ). В комплексе IRAK 1 ассоциирован с Toll-интерактивным белком (Tollip), MyD88, и TRAF6 (фактор некроза опухоли фактор 6). Фосфорилирование IRAK 4 инициирует
Сигнальные пути, активирующиеся при проведении сигнала через TLR9. MyD88 (myeloid differentiation factor 88 - миелоидный фактор дифференцировки 88) – адаптерная молекула, которая используется TLR9 для проведения сигнала; IRAK (IL-1R-associated kinase) и TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6) – киназный комплекс; (IRF-7 – interferon regulatory factor7) – регулирующий фактор транскрипционную активность гена интерферона; IKK-комплекс – IкB киназный комплекс, состоящий из трех субъединиц, включая киназы IKK-, IKK-, IKK-. Неактивная форма NF-kB локализована в цитоплазме, связанная с регуляторными протеинкиназами - ингибиторы kB (IkB): IkB, IkB, IkB. IkB взаимодействует с гетеродимерами р50 и р65. При активации NF-kB происходит отщепление ингибитора и перемещение из цитоплазмы в ядро гетеродимера, состоящего из субъединиц р50 и р65 [Tobias et al., 2005; Seya et al., 2005]. фосфорилирование IRAK 1 с последующей диссоциацией киназного комплекса, но в тоже время с сохранением его связи с TRAF6 [Miggin1 et al., 2006]. Это приводит к активации TRAF6, сопровождаемой активацией и формированием сложного комплекса TAK1/TAB1/TAB2/TAB3 (TGF beta-Activated Kinase 1/TAK1-binding protein 1/2/3).
Активный комплекс TAK1/TAB, запускает последующую активацию IKK комплекса, который состоит из IKK-, IKK-, IKK- (регуляторных субъединиц - модуляторов, катализирующих фосфорилирование) [Fitzgerald et al., 2003]. Далее следует разделение в димерном комплексе IKK-/ IKK- с участием протеосомного пути (рис. 4), с последующей активацией IkB и транслокация NF-В в ядро, далее и активируется каскад MAPК (mitogen-activated protein kinase) – митоген-активированные протеинкиназы [Sharma et al., 2003; Li et al., 2013].
NF-B (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) – ядерный фактор «каппа-би», это универсальный фактор транскрипции, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла. Он получил свое название из-за участия в регуляции экспрессии гена легкой цепи иммуноглобулина в В-клетках. В семействе NF-B находятся пять видов белков: NF-B1 (p50), NF-B2 (p52), RelA (p65), RelB и c-Rel, которые образуют 15 комбинаций димеров. У всех белков семейства есть общий домен гомологии Rel, необходимый для образования белковых димеров, связывания ДНК с NF-B, а также для связывания с IkB цитозольный ингибиторный белок. Активная форма NF-B проявляется только в форме димера, наиболее распространённой формой является димер субъединиц p50 или p52 с субъединицей p65 [Fusco et al., 2009; Wier et al., 2012]. В цитоплазме субъединицы NF-B находятся в неактивном состоянии в комплексе с ингибиторным белком IkB. Активация NF-B обусловлена различными стимулами, включающими B- и T-клеточные митогены, цитокины (например TNF и IL1), продукты бактериальной и вирусной природы (лиганды рецепторов семейства TLR, например двухцепочечная РНК вируса или липополисахарид) и факторы стресса (активная форма кислорода или ультрафиолет). Стимулирующий фактор запускает фосфорилирование IkB при действии киназы IKK (IkB-киназа), что ведет к деградации IkB под действием протеосомы 26S. Вследствие чего NF-kB освобождается из ингибирующего комплекса, перемещается в ядро и активирует транскрипцию контролируемых генов. NF-kB – это важная составляющая большинства сигнальных путей, активация которых ведет к быстрой индукции цитокинов, являющихся основными участниками регуляции воспалительного процесса, неспецифических и специфических механизмов защиты [Akira et al, 2003; Bonizzi et al, 2004]. Блокировать способность NF-B связываться с ДНК и запускать транскрипцию генов может GR (англ. Glutathione reductase; глутатионредуктаза), взаимодействуя субъединицами NF-B. Также в подавлении активности NF-B может участвовать негативная регуляция посредством МАР-киназного сигнального пути, который ингибирует IKK-киназы, принимающие участие в активации NF-B [Hayashi et al, 2001; Hayden et al, 2008]. Помимо этого глюкокортикоиды вызывают увеличение экспрессии белка IkB, являющегося ингибитором NF-B, что ведет к стабилизации, тем самым препятсвуя перемещению NF-B в ядро.
Классический NF-B сигнальный путь является важной составляющей системы координирования экспрессии множества генов врожденной иммунной системы и воспаления, способствуя выживаемости клеток иммунитета при различных инфекциях или при острых воспалительных процессах [Palmer et al, 2008].
Определение экспрессии мРНК TLR9 в мезенхимальных стволовых клетках, при действии на них вкДНК, модельной п(рДНК) и ДНК Е.coli
После инкубации с п(рДНК), средняя интенсивность флуоресценции МСК увеличилась в 4 раза, что указывает на увеличение содержания p65 в клетке, которое коррелирует с усилением экспрессии гена Rel А (рис. 23). Для сравнения использовали геномную ДНК (гДНК). При действии гДНК количество p65в МСК увеличивалось в меньшей степени, чем при действии ГЦ-богатой ДНК (п(рДНК)) - в 1,6 раза по сравнению с исходным уровнем.
Основным доказательством NF-kB активации в присутствии ГЦ-ДНК была его транслокация из цитоплазмы в ядро МСК, выявленная с помощью флуоресцентной микроскопии на фиксированных МСК, обработанных первичными антителами к NF-kB (р65) и вторичными, меченными FITC. В контрольных образцах МСК около 65 ± 10% общего количества клеток содержат очень низкое количество NF-kB в цитоплазме, в 20 ± 5% клеток NF-kB присутствует в цитоплазме, но не в ядре, в оставшихся 15 ± 5% клеток NF-kB локализуется в ядре.
Воздействие п(рДНК), 50 нг/мл, на МСК в течение 30 минут приводит к увеличению доли клеток с NF-kB, светящимся в цитоплазме, в то время как число клеток с NF-kB в ядре остается таким же, как в контроле (Р 0,05). От 1 часа и до трех часов после начала воздействия на МСК 50 нг/мл п(рДНК), произошла транслокация NF-kB в ядро из цитоплазмы – NF-kB светился в ядре почти во всех клетках популяции МСК, однако через 24 часа процент активированных клеток снизился в 2 раза, одновременно с уменьшением средней интенсивности флуоресценции. гДНК существенно не изменяла процент клеток с локализацией NF-kB в ядре по сравнению с контролем (рис. 24). Рисунок 24. Данные флуоресцентной микроскопии (увеличение 40): п(рДНК) вызывает транслокацию в ядро NF-kB через 1-3 часа после начала воздействия.
Несмотря на то, что п(рДНК) активирует экспрессию TLR9 не более чем в 25% клеток, транслокации NF-kB в ядро наблюдается во всех клетках исследованной популяции МСК. Одним из возможных объяснений наблюдаемого факта является то, что активированные ГЦ-ДНК TLR9 + клетки секретируют растворимые факторы, которые активируют NF-kB-сигнальный путь в TLR9-клеток. В МСК одним из вероятных кандидатов на роль растворимого активирующего агента является TNF (tumor necrosis factor ), продукция которого возрастает в ответ на стимуляцию NF-kB в МСК [Pine et al., 1994; Sano et al., 1989; Schwarzenbach et al., 2011].
Таким образом, ГЦ-богатые последовательности ДНК, накапливающиеся в составе вкДНК, повышают экспрессию большинства генов молекул, участвующих в проведении сигнала через TLR-сигнальный путь, что сопровождается транслокацией в ядро фактора транскрипции NFkB, повышая экспрессию генов NF-kB - сигнального пути. 3.2.4 П(рДНК) стимулирует увеличение количества мРНК цитокинов IL10 и TNF
Конечным событием активации TLR –зависимых сигнальных путей в клетке является продукция цитокинов [Veiko et al., 2000; Yao et al., 2009]. Мы провели анализ секреции цитокинов TNF и IL-10, которые, как было показано в ряде работ [Veiko et al., 2000; Yao et al., 2009], модулируют терапевтическую активность стволовых клеток.
При действии п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл на МСК через 3 часа возрастало количество мРНК TNF в 4 раза, через 24 часа – в 1,9 раз по сравнению с контролем (рис. 25 В). Через 3 часа культивирования МСК в присутствии п(рДНК) экспрессия иммуносупрессора IL10 возрастала в 1,7 раз, через 24 часа - в 9 раз (рис. 25 В).
Кроме того, методом иммуноферментного анализа (ИФА) показано, что секреция цитокинов TNF и IL-10 в среде культивирования МСК при действии п(рДНК) также повышается по сравнению с контролем. Концентрация TNF повышается через 3 часа в 1,5 раза и через 24 часа в 2 раза, концентрация IL-10 через 3 часа повышается в 3 раза, и в 1,6 раза повышается через 24 часа культивирования МСК в присутствии п(рДНК) (рис. 26). Геномная ДНК не вызывала ни повышения экспрессии генов TNFa и IL-10, ни усиления продукции белка TNF и IL-10.
Снижение ферментативной активности каспазы 3 в мезенхимальных стволовых клетках при действии модельных фрагментов внеклеточной ДНК
Проведенное впервые в рамках данной работы исследование позволило выявить новые данные о влиянии вкДНК на свойства МСК.
Нами были отработаны адекватные методы выделения и культивирования МСК человека из жировой ткани. Чтобы подтвердить корректность используемого способа получения МСК, для одной из культур проведен полный анализ маркеров мезенхимальных стволовых клеток.
Мы показали, что фрагменты вкДНК – ТОрДНК оказывают активирующее воздействие на МСК. Ранее предполагалось, что ДНК не оказывает влияния на клетки организма, но эксперименты проводились с использованием геномной ДНК, которая по своим свойствам существенно отличается от внеклеточной ДНК. ГЦ-богатые последовательности в составе вкДНК играют существенную роль в функционировании мезенхимальных стволовых клеток. Нами было показано, что ГЦ-вкДНК воздействует на мезенхимальные столовые клетки через рецепторы семейства TLR, посредством увеличения количества мРНК и белка TLR9 в клетках.
Поскольку мы обнаружили, что ГЦ-обогащенные фрагменты вкДНК активируют TLR9-зависимый сигнальный путь: увеличивается экспрессия генов TLR9 и MyD88 – адаптера TLR-сигнального пути, мы проанализировали экспрессию генов, связанных с TLR- зависимым сигнальным путем, при действии фрагментов ДНК с различной последовательностью. Провели сравнительный анализ профиля экспрессии 86 генов, задействованных в TLR-сигнальных путях, в контроле (культивируемых МСК) и в МСК, обработанных фрагментами ГЦ-вкДНК. Было показано, что плазмида (п(рДНК)), содержащая в своем составе фрагменты ГЦ-вкДНК, активирует в МСК TLR9-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRF-cигнальные пути: увеличивается экспрессия генов адаптеров (MYD88, TIRAP, HSPD1, MAP2K3, TICAM2, SARM1, TOLLIP, HRAS, HSPA1A, MAPK8IP3 PELI1, RIPK2) и эффекторов (EIF2AK2, PPARA, TRAF6, UBE2N, FADD, IRAK1, MAP3K7IP1, IRAK2, IRAK1) TLR-сигнального пути; генов NF-kB- (MAP3K1, MAP4K4, NF-KB1A, REL, IKBKB, RelA (p65), NFRKB, NF-KB1, NF-KB2); JNK/p38- (FOS, MAP2K3, MAPK8, ELK1, MAP2K4); IRF- (IFN1, IFN1, IRF3, IRF1, IFN) сигнальных путей.
Высказываются предположения, что активация TLR-сигнального пути играет существенную роль в защите МСК от апоптоза [Wang et al., 2009]. При действии всех трех проб ДНК мы наблюдали повышение экспрессии MyD88 – ключевого адаптера большинства «Toll-like» рецепторов, что ведет к активации MAPК (mitogen-activated protein kinase) - митоген-активируемых протеинкиназ, и трансактивирующих факторов, вследствие чего транскрипционный фактор NF-kB перемещается в ядро. Известно, что каскад МАРК задействован в передаче сигналов МСК от интегрина бета1 [Moro et al., 1998]. Интегрины и факторы роста обеспечивают жизнеспособность МСК за счет усиления экспрессии антиапоптотических [Zhang et al., 1995] генов и подавления экспрессии проапоптотических [Reginato et al., 2003]. Кроме того, в подавлении апоптоза МСК может быть задействован PI3K/Akt -сигнальный путь, поскольку показано, что Akt регулирует активацию NF-kB, и его активация повышает выживаемость МСК [Armstrong et al., 2006]. Поскольку из трех проб ДНК п(СатIII) вызывала наибольшее снижение активности каспазы 3, и при этом не столь значительно стимулировала экспрессию MyD88 и TLR9, можно предположить, что в устойчивости МСК к апоптозу играют роль и другие сигнальные пути.
В мезенхимальных стволовых клетках в присутствии п(рДНК) увеличивается количество мРНК, как про- так и антивоспалительных цитокинов. Кроме того, оказалось, что в МСК реализуется модель временного регулирования процесса продукции цитокинов, ранее обнаруженная в макрофагах [Chi et al., 2006; Lee et al., 2013]. Активация молекул TLR9-сигнального пути, в частности MAPK, индуцирует быстрый синтез провоспалительных цитокинов (TNF) [Dong et al., 2001; Lee et al., 2013]. Вторая стадия активации TLR9-пути приводит к продукции иммуносупрессорного IL-10, которая также зависит от активности MAPK, и, в частности, p38 MAPK.
Экспрессия многих IFN-индуцируемых генов стимулируется цитокинами в том числе, IL-10 [Harada et al., 1994; Seya et al., 2005] , TNF [Harada et al., 1994; Wang et al., 2013] и др. Однако высокие уровни IL-10 приводят к уменьшению секреции IFN [Harada et al., 1994; Wang et al., 2013]. Хотя IL-10 обладает в основном иммуносупрессивными и противовоспалительными свойствами [Moore et al., 2001], он также может служить провоспалительным цитокином в реализации ответа на воспаление [Sharif et al., 2004], поэтому его функция очень сложна. Баланс между про- и противовоспалительными свойствами IL-10 может регулироваться IFN типа 1, что подчеркивает взаимное влияние IFN и IL-10 [Sharif et al., 2004]. Таким образом, на различных уровнях передачи сигналов TLR9 существуют механизмы контроля, регулирующие чрезмерные ответы клеток на стимуляцию TLR9.
