Введение к работе
Актуальность проблемы. Оценка пролиферативной активности лимфоидных клеток при лимфопролиферативных заболеваниях является одним из важных показателей в диагностике варианта заболевания и определении степени злокачественности процесса. Этот показатель используется для прогнозирования скорости опухолевого роста и выбора адекватного курса лечения.
Активация клеток млекопитающих к пролиферации сопровождается увеличением содержания многих ядерных белков. К ним, в частности, относятся факторы репликации, транскрипционные факторы, циклинзависимые киназы, а также белки ядрышка - основного структурного домена клеточного ядра, необходимого для образования рибосом и обеспечивающего белоксинтезирующие функции клеток. Согласно последним данным протеомного анализа, ядрышки клеток человека содержат 700-4500 белков. К ядрышковым белкам относятся, в частности, белки связанные с транскрипцией рДНК (РНК полимераза I, факторы транскрипции рДНК, топоизомеразы), а также белки цитоплазматических рибосом и специфические ядрышковые белки, необходимые для процессинга рРНК, включая фибрилларин, В23/нуклеофозмин/нуматринЛЧ038 (В23) и С23/нуклеолин (нуклеолин). Одним из важнейших свойств ядрышка является его высокая структурная и функциональная изменчивость, которая отражает общий уровень метаболизма и способность клеток к пролиферации. Показано, что размеры ядрышек прямо коррелируют со скоростью пролиферации опухолевых клеток. Изменение функционального состояния ядрышка в ходе клеточного цикла сопровождается также изменением количественного содержания его белков. К таким белкам относятся, в частности, аргентофильные белки. Количественный анализ содержания аргентофильных белков в настоящее время используется для оценки скорости пролиферации клеток, а также в диагностических и прогностических целях. Установлено, что размеры аргентофильных зон в ядрышках варьируют в зависимости от формы острого лейкоза и прямо коррелируют со злокачественностью процесса.
Мажорные белки ядра и ядрышка - В23, PCNA, Ki-67, содержание которых возрастает при переходе от состояния пролиферативного покоя к делению, относят к маркерам клеточной пролиферации, а антитела ним используют в клинической диагностике для прогностической оценки скорости роста злокачественного клона. Однако, набор белковых маркеров активации лимфоцитов в настоящее время крайне ограничен, а белки, указывающие на ранние стадии активации лимфоцитов к пролиферации, которые могли бы найти применение в онкогематологии, на сегодняшний день отсутствуют.
Целью работы явилось сравнительное изучение экспрессии ключевых белков ядрышка в лимфоидных клетках человека в различные периоды пролиферативного процесса, а также выявление ранних маркеров активированных лимфоцитов человека и мыши.
Задачи работы.
Изучить содержание ключевых белков ядрышка SURF-6 и В23 при активации лимфоцитов мыши к пролиферации с помощью конканавалина А (Кон А).
Изучить уровень экспрессии SURF-6 в лимфоцитах селезенки мыши, активированных к пролиферации Кон А.
Изучить экспрессию белков ядрышка - фибрилларина, В23, нуклеолина и SURF-6 - при активации лимфоцитов периферической крови человека к пролиферации с помощью фитогемагглютинина (ФГА) методом иммуноцитохимии.
Оценить количественное содержание этих же белков в процессе ФГА-стимуляции на иммуноблотах.
Проанализировать экспрессию В23, фибрилларина и SURF-6 в лимфоидных клетках ограниченного числа больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями.
Сопоставить уровень экспрессии вышеназванных белков с уровнем пролиферации лимфоидных клеток, определяемым маркерными белками Ki-67 и PCNA.
Научная новизна исследования. На модели ФГА-стимулированной культуры лимфоцитов человека показаны изменения в содержании и уровне экспрессии белков ядрышка фибрилларина и нуклеолина. Впервые на этой же модели показано, что белок SURF-6 не выявляется в покоящихся лимфоцитах, а его экспрессия в ФГА-активированных лимфоцитах начинается до экспрессии известных маркеров клеточной пролиферации белков Ki-67 и PCNA. Выявлена положительная корреляция между экспрессией белка SURF-6 и белками Ki-67 и PCNA в лимфоидных клетках больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями. Эти наблюдения впервые показали, что белок ядрышка SURF-6 может служить маркером ранней активации лимфоцитов человека к пролиферации, а также иметь прогностическое и, возможно, диагностическое значение. Показано, что, как и в лимфоцитах периферической крови человека, SURF-6 не выявляется в лимфоцитах, выделенных из селезенки мышей. Таким образом, на сегодняшний день белок SURF-6 является единственным белком ядрышка, который, не выявляясь в ядрышках покоящихся лимфоцитов млекопитающих (на примере человека и мыши), начинает экспрессироваться в митоген-стимулированных лимфоцитах раньше известных маркеров клеточной пролиферации (Ki-67 и PCNA).
Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные результаты расширяют существующие фундаментальные представления о белках ядрышка как маркерах клеточной пролиферации. Возможность выявления по состоянию ядрышкового белка SURF-6 ранней стадии пролиферативной активности лимфоцитов (по-видимому, ранней Gl-фазы), не выявляемой общеизвестным антигеном Ki-67, позволяет рекомендовать его анализ для лабораторных исследований в клинической практике с целью
ранней диагностики злокачественной транформации лимфоцитов. Выявленная корреляция экспрессии белков Ki-67 и SURF-6 у больных с лимфопролиферативными заболеваниями, с повышением их экспрессии при нарастании злокачественности процесса, позволяет рассчитывать на широкое клиническое применение антител к SURF-6.
Положения, выносимые на защиту.
С использованием первичной культуры лимфоцитов селезенки мыши, активированных к пролиферации конканавалином А, показано, что уровень белков SURF-6 и В23 возрастает при активации клеток к пролиферации, при этом SURF-6 не выявляется в неактивированных лимфоцитах.
На модели стимулированной ФГА культуры лимфоцитов здоровых лиц показано, что белок SURF-6 является надежным маркером последовательных стадий активации лимфоцитов человека к пролиферации. SURF-6 отсутствует в неактивированных лимфоцитах и начинает выявляться в клетках раньше маркеров клеточной пролиферации - белков Ki-67 и PCNA.
Существует положительная корреляция между экспрессией белка SURF-6 и белков Ki-67 и PCNA в лимфоидных клетках больных различными лимфопролиферативными заболеваниями.
Белок ядрышка SURF-6 может служить новым маркером активации лимфоцитов млекопитающих к пролиферации и иметь дополнительное диагностическое и прогностическое значение.
Апробация работы состоялась 21 июня 2010 г. на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН и 24 июня 2010 года на заседании межлабораторного научного коллоквиума Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Основные положения диссертации были представлены на II Съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), Научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007), VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), XXI и XXII зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009 и 2010 гг.), XVIII Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Украина, Гурзуф, 2010), III Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК и 9 тезисов. Получено положительное заключение о выдаче патента.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных данных, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 29 отечественных и 218 зарубежных литературных источника. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами, 11 рисунками и 17 фотографиями.
