Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Строение митохондрий 8
1.2. Функции митохондрий 11
1.2.1. Продуцирование энергии митохондриями 11
1.2.2. Митохондрии в оогенезе и раннем эмбриогенезе 13
1.2.3. Участие митохондрий в апоптозе 15
1.3.Митохондриальньїй геном 21
1.3.1. Строение митохондриальнои ДНК 21
1.3.2. Репликация мтДНК 25
1.3.3. Транскрипция мтДНК 26
1.3.4. Регуляция биогенеза митохондрий 29
1.4. Биосинтез белков в митохондриях 32
1.5. Особенности генетики митохондрий 35
1.6. Митохондриальные заболевания 38
1.7. Современные представления об изучении и терапии митохондриальных болезней 48
2. Методы и материалы 56
2.1. Выделение фракции митохондрий человека из культуры клеток HepG2 и анализ функциональной активности 56
2.2. Подготовка животных 57
2.2.1. Гормональная стимуляция самок и суперовуляция 57
2.2.2. Техника стерилизации самцов 57
2.2.3. Подготовка псевдобеременных самок 57
2.3. Манипуляции с эмбрионами 58
2.3.1. Получение оплодотворенных яйцеклеток лабораторных животных (мышей) для цитоплазматической микроинъекции 58
2.3.2. Цитоплазматическая микроинъекция митохондриальнои фракции человека в оплодотворенные яйцеклетки лабораторных мышей 58
2.3.3. Культивирование доимплантационных зародышей in vitro 59
2.3.4. Разделение на бластомеры культивируемых in vitro зародышей 2-х и 4-х клеточной стадии развития 59
2.3.5. Трансплантация зигот самкам-реципиентам 61
2.4. Выделение ДНК 61
2.4.1. Выделение ДНК из зародышей 7ого-10ого дня внутриутробного развития 61
2.4.2. Выделение ДНК из зародышей 11ого и ІЗого дня внутриутробного развития и новорожденных мышей 62
2.4.3. Выделение ДНК для контроля 63
2.5. ПЦР-анализ 63
2.5.1. Разработка видоспецифичных праймеров к мтДНК человека и мыши 63
2.5.2. Анализ ДНК зародышей доимплантационных сроков развития 64
2.5.3. Анализ ДНК постимплантационных зародышей и новорожденных мышей 65
2.6. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле (ПААГ) 65
3. Результаты 67
4. Обсуждение результатов 82
5. Выводы 92
Список литературы 93
- Митохондрии в оогенезе и раннем эмбриогенезе
- Митохондриальные заболевания
- Разделение на бластомеры культивируемых in vitro зародышей 2-х и 4-х клеточной стадии развития
- Разработка видоспецифичных праймеров к мтДНК человека и мыши
Введение к работе
В середине девятнадцатого века митохондрии впервые привлекли внимание исследователей механизмов клеточной жизнедеятельности. Многочисленные, легко выделяемые, являющиеся богатым источником ферментов, необходимых для выполнения разнообразных функций, эти органеллы были в центре внимания при изучении основных принципов клеточной энергетики. По прошествии многих лет, когда исследования функций ядерных генов стали более доступными, интерес молекулярных биологов к митохондриям стал спадать.
Однако, публикации последних двадцати лет говорят о том, что митохондрии вновь находятся в центре внимания исследователей, поскольку доказана их значимость для таких областей науки о жизни, как эволюционная биология, исследование механизма клеточной смерти, молекулярная медицина и даже судебная экспертиза (Kiberstis, 1999).
Одним из наиболее важных достижений было признание того, что митохондрии играют центральную роль в регуляции программируемой клеточной смерти или апоптоза. Как показывают многочисленные исследования, митохондрии способны вызывать клеточную гибель несколькими способами: нарушением транспорта электронов через митохондриальные мембраны; высвобождением/активацией белков, которые участвуют в апоптозе, изменением клеточного редокс-потенциала. По отдельности или вместе все эти механизмы помогут объяснить, как митохондриальные дефекты способствуют старению, развитию дегенеративных заболеваний человека и малигнизации клеток (Kroemer et aL, 1998, Tsujimoto and Shimizu, 2.000).
Изучение митохондрий играет также существенную роль в эволюционной биологии. Недавно проведенный сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей примитивного митохондриального и эубактериального геномов внес существенные дополнения в известную популярную теорию эндосимбионтного происхождения митохондрий (Gray et aL, 1999). Существует и новое направление в использовании митохондриальной ДНК (мтДНК) как критерия для определения родства и
уточнения происхождения разных видов в ходе эволюции (Gadaleta et al, 1989).
Около 60 лет назад было открыто первое заболевание, связанное с
разобщением окисления и фосфорилирования в митохондриях, что
положило начало исследовании «болезней окислительного
фосфорилирования» (OXPHOS diseases), отличающихся тяжелой
симптоматикой, зачастую с неблагоприятным исходом. В настоящее время известно около 120 нозологических единиц и синдромов. Вызванные структурными нарушениями в ДНК митохондрий, эти синдромы наследуются по материнской линии (при слиянии мужской и женской гамет организм получает почти все свои митохондрии из яйцеклетки).
Особенностью наследственных митохондриальных болезней является зачастую полное отсутствие патологических признаков в первые годы жизни человека. Это вызвано присутствием в клетках растущего организма сотен митохондрий как с мутантной, так и с нормальной ДНК, что получило название гетероплазмии. Содержание митохондрий с мутантной митохондриалыюй ДНК (мтДНК) нарастает постепенно, и будущие пациенты нередко достигают половозрелого возраста и дают потомство, несущее те же мутации в мтДНК. Когда количество мутантных копий мтДНК, неспособных кодировать тРНК или белковые цепи ферментов, достигает в клетке «порога концентрации», энергетический метаболизм становится недостаточным, что и проявляется в виде заболевания с симптомами дегенерации разных органов.
Сегодня установлена природа ряда мутаций, вызывающих болезни OXPHOS. Это могут быть как точечные мутации, так и обширные делеции, затрагивающие несколько генов. Однако, до сих пор неизвестны многие молекулярные механизмы, обеспечивающие возникновение и развитие симптомов этих тяжелых заболеваний. Это создает трудности для разработки методов лечения митохондриальных болезней. Среди причин относительно слабого развития медицины в этой области - отсутствие возможности изучения митохондриальных болезней на животных, поскольку у них такие заболевания не выявлены.
Актуальность исследований, результаты которых описаны в последующих главах, обусловлена тем, что несмотря на обнаружение еще в 80-х годах прошлого столетия причинной связи между мутациями в мтДНК и возникновением митохондриальных заболеваний, до сих пор не была разработана модель животного с симптомами, сходными с проявлениями болезни у человека. Между тем, отсутствие такой модели серьезно затрудняет как научные исследования, так и испытания лекарственных препаратов, предлагаемых для облегчения проявлений этой тяжелой наследственной патологии. Перспективным подходом к изучению данной проблемы считается создание так называемых «трансмитохондриальных» животных. Работы по введению митохондрий одного вида животных в клетки другого вида уже имеют заметный успех (Pinkert et al., 1997; Irwin et al., 1999; Rinaudo et al, 1999). Обнадеживающие результаты этих пока еще единичных работ позволяют рассчитывать на то, что в недалеком будущем генно-инженерная модель животного с симптомами «болезни окислительного фосфорилирования» будет разработана, и у медицины появятся шансы продвинуться вперед.
Целью нашего исследования являлось получение трансгенных мышей, несущих в органах/тканях мтДНК человека и изучение возможности их дальнейшего использования для создания модели митохондриального заболевания человека.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
осуществление доставки митохондрий человека в оплодотворенные яйцеклетки лабораторной мыши и изучение влияния чужеродных митохондрий на развитие мышиных эмбрионов;
контроль за сохранением либо элиминацией мтДНК человека на разных стадиях развития организма мыши; .
3) изучение распределения чужеродной мтДНК в организме
трансмитохондриальных мышей;
4) проверка гипотезы о возможной гетероплазмии в тканях/органах
животных;
5) изучение возможности передачи чужеродной митохондриальной ДНК потомству трансмитохондриальных мышей.
Научная новизна проведенных исследований состоит в том, что впервые в мире получены мыши, несущие в тканях/органах мтДНК человека, сосуществующую с собственной мтДНК животных. Показана также возможность передачи по материнской линии чужеродной мтДНК от трансмитохондриальных мышей их потомству.
Научно-практическое значение работы состоит в том, что намечены конкретные шаги для получения животных, являющихся адекватной моделью «болезней окислительного фосфорилирования», вызываемых мутациями в мтДНК и передаваемых по материнской линии. Получение такой модели предоставит возможность для разработки новых подходов к лечению подобных заболеваний, в том числе для испытания новых лекарственных средств.
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Показано, что введение в оплодотворенные яйцеклетки мыши
митохондрий человека не оказывает отрицательного эффекта на развитие
эмбрионов животных.
2) Установлено, что мтДНК человека сохраняется в зародышах мыши,
развивающихся как in vitro, так и in vivo, а также в тканях
новорожденных животных.
Чужеродная мтДНК распределяется неравномерно в организме трансмитохондриальных мышей.
В экспериментах по получению трансмитохондриальных мышей была создана искусственная гетероплазмия, когда в образцах тканей/органов животных наряду с собственной мтДНК обнаруживалась мтДНК человека.
5) Показана возможность передачи мтДНК человека от поколения F0 трансмитохондриальных мышей следующему поколению по материнской линии.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на
научной конференции, посвященной 110-летию Института
Экспериментальной медицины, Санкт-Петербург, 2000 г; на X Международном Конгрессе «Генетика человека», Вена, 2001г.; на конференции EUROMIT-5 (The Mitochondria Research Society), Венеция, 2001; на IV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей, Санкт-Петербург, 2001; на III съезде Биохимического Общества, Санкт-Петербург, 2002; на I Всероссийском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва, 2002.
Основное содержание диссертации опубликовано в 2х научных статьях и тезисах Т докладов.
Митохондрии в оогенезе и раннем эмбриогенезе
Давно известно, что в ходе созревания ооцитов в их цитоплазме происходит накопление различных ферментов, структурных и регуляторных белков, матриц и метаболических субстратов, которые участвуют в обеспечении биохимических нужд клеток и в регуляции процессов последующего нормального развития эмбрионов. Также происходит создание запаса органелл в количестве, достаточном для развития зародыша на ранних этапах. Это справедливо и для митохондрий, количество которых увеличивается многократно за счет деления предсуществующих органелл, а также путем образования de novo, что сопровождается активной репликацией мтДНК (Anderson et at, 1970; Mignotte et я/., 1987).
На ранних стадиях эмбрионального развития вплоть до начала гаструляции формирования новых митохондрий не происходит. Это характерно как для зародышей млекопитающих (Piko and Taylor, 1987), так и для дробящихся эмбрионов Xenopus. Репликации мтДНК и транскрипции митохондриальных генов также не наблюдается (Piko and Matsumoto, 1976).
К тому же в результате оплодотворения в цитоплазму ранних зародышей привносятся митохондрии спермия, и популяция митохондрий становиться гетерогенной. Как правило, привнесенные митохондрии направленно элиминируются в клетках развивающегося эмбриона к концу преимплантационного периода развития млекопитающих (Cummins et ah, 1997; Sutovsky and Schatten, 2000). Элиминация митохондрий спермия была показана также при инъекции сперматозоидов в соматические клетки, не содержащие собственной мтДНК (Manfredi et al., 1997). Однако другими авторами было показано, что мтДНК спермия в следовых количествах может быть обнаружена в зародышах на поздних сроках развития и даже у новорожденных животных (Gyllensten et al., 1991; Houshmand et al., 1997).
В оогенезе, так же как и на ранних этапах эмбриогенеза, распределение митохондрий в цитоплазме часто является строго определенным. В ходе созревания ооцитов они могут располагаться как равномерно по всей цитоплазме, так и образовывать целые скопления, окружающие зародышевый пузырек (Anderson et al, 1970). В процессе формирования и функционирования веретена деления митохондрии концентрируются в области веретена (Muggleton-Harris and Brown, 1988). После оплодотворения ооцитов митохондрии млекопитающих занимают перипронуклеарные зоны и сопровождают миграцию пронуклеусов. На начальных стадиях дробления каждой фазе клеточного цикла соответствует определенное положение митохондрий: от диффузного распределения в фазах Gi и G2 до агрегированного вокруг веретена деления при митозе (Stern et al., 1971; Tokura et al., 1993). При этом митохондрии ранних зародышей мышей функционально активны. На стадии 8 бластомеров диффузное распределение сменяется локализованным. Митохондрии располагаются преимущественно в кортикальной зоне цитоплазмы, концентрируясь в области формирующихся межклеточных контактов бластомеров, а также в перинуклеарных зонах, что коррелирует с перераспределением цитоскелетных элементов и начальными этапами дифференцировки клеток (Maro et al, 1990).
В последнее время несколько работ направлено на исследование связи митохондрий с клеточной дифференцировкой. Известно, что у млекопитающих и птиц миогенная дифференцировка зависит от активности митохондрий (Van den Bogert et al., 1992; Rochard et al., 2000). При этом речь идет не о пассивном замедлении процессов дифференцировки в результате снижения продукции АТФ, а об активной регуляции. Так, например, в условиях in vitro при угнетении белкового синтеза в митохондриях миобластов птиц резко прекращается формирование мышечных трубочек и снижается накопление коннектина, тогда как стимуляция транскрипции мтДНК вызывает противоположный эффект (Rochard et al., 2000). При этом содержание мРНК myo D и ту/ 5, участвующих в миогенной дифференцировке, сохраняется на постоянном уровне. Однако содержание миогенина, ген которого находится downstream по отношению к генам указанных транскрипционных факторов, значительно снижается при ингибировании митохондриальной активности и увеличивается при стимуляции (Rochard et al., 2000). Этот факт указывает на то, что миогенин является специфической мишенью регуляции дифференцировки митохондриями, хотя непосредственный механизм процесса пока остается невыясненным.
Похожие результаты блока дифференцировки мышечных клеток получены в экспериментах на клетках млекопитающих при элиминации мтДНК (Herzberg et al, 1993). Показано также, что угнетение активности митохондрий может приводить к блоку пролиферации (Van den Bogert et al., 1992). Пока неизвестно, в какой мере эти два процесса коррелируют друг с другом.
Программируемая клеточная гибель или апоптоз является важнейшим механизмом контроля клеточной популяции в многоклеточном организме. Основной его функцией является уравновешивание эффекта пролиферации клеток, элиминация поврежденных, например, радиацией, пораженных вирусом и неопластических клеток и селекция лимфоцитов, при которой удаляются аутоиммунные клоны. Апоптоз служит молекулярным механизмом, обеспечивающим старение и смерть живого организма, что, возможно, не очень полезно для индивида, но чрезвычайно важно для стабильности популяции (Skulachev, 2000). Детерминированность срока жизни клетки и гибель ее после определенного числа делений (для большинства нормальных соматических клеток) также определяется включением механизмов апоптоза.
Митохондриальные заболевания
То, что мтДНК находится в цитоплазме клетки и представлена большим количеством своих копий, несомненно, налагает особый отпечаток на генетику митохондрий. Следует перечислить особенности генетики митохондрий, отличающих ее от хорошо известных принципов наследования признаков, кодируемых ядерной ДНК.
Во-первых, мтДНК полуавтономна, что неудивительно, если вспомнить об эндосимбиотическом происхождении митохондрий. Эта автономия подтверждается, в частности, возможностью переноса как митохондрий, так и мтДНК между культивируемыми клетками человека. Целенаправленно измененные образцы мтДНК, инъецированные в клетку с интактной мтДНК, реплицировались в этой клетке и переходили из митохондрии в митохондрию в процессе слияния и разъединения органелл (Wallace, 1982).
Во-вторых, млекопитающие получают мтДНК, в основном, от матери. Яйцеклетка млекопитающих содержит около 106 молекул мтДНК, тогда как сперматозоид содержит лишь порядка 100-1500 молекул мтДНК (Chen et al., 1995; Manfredi et al., 1997). Митохондрии сперматозоида поступают в яйцеклетку во время оплодотворения, однако они, по-видимому, погибают на ранних стадиях эмбриогенеза вскоре после оплодотворения, в период между двух- и четырех-клеточными стадиями зародыша (Manfredi et al., 1997). Отцовская мтДНК не была обнаружена у новорожденных детей, появившихся на свет в результате оплодотворения с помощью инъекции в цитоплазму сперматозоида in vitro (Danan et al., 1999). Это могло быть обусловлено либо повреждением митохондрий спермы, либо блокадой репликации мтДНК спермы в клетках (Mafredi et al., 1997). Однако присутствие отцовской мтДНК было обнаружено на стадии бластоцисты в некоторых аномальных (полиплоидных) эмбрионах человека, полученных путем оплодотворения in vitro с помощью инъекции в цитоплазму сперматозоида (St John et al., 2000).
Третьей отличительной чертой митохондриальной генетики является то, что мтДНК подвергается репликативному отбору как при митозе, так и при мейозе (Larsson et al., 1992). В каждой клетке млекопитающих содержится несколько сотен митохондрий, причем каждая митохондрия включает от двух до десяти копий молекул мтДНК. При возникновении мутации в мтДНК в пределах отдельно взятой клетки нередко обнаруживается смесь мутантных и нормальных (дикого типа) мтДНК. Этот феномен обозначается как гетероплазмия. Во время деления клетки митохондрии и их геномы распределяются между дочерними клетками неравномерным образом, что было названо репликативной сегрегацией. В результате ряда последовательных делений могут возникать клеточные популяции, в которых митохондриальный геном представлен почти исключительно мутантными или только нормальными копиями мтДНК. Поэтому в известном смысле генетику мтДНК можно рассматривать как популяционную генетику. Естественно, тяжесть расстройства энергетического метаболизма в клетке прямо пропорциональна доле мутантных копий мтДНК в ее митохондриях и варьирует от 100-процентной активности до нулевого уровня OXPHOS. Таким образом, гетероплазмия и репликативный отбор нередко приводят к тому, что клетки или особи с идентичным ядерным геномом (например, однояйцевые близнецы) могут иметь различные митохондриальные генотипы и, как результат, различаться фенотипически (Schon and DiMauro., 1994).
В-четвертых, для генетики мтДНК характерен феномен пороговой экспрессии. Большинство (но не все) патогенных мутаций мтДНК имеют гетероплазмический характер. Фенотип остается в норме до тех пор, пока количество мутантной мтДНК в ткани не достигло критического уровня и не преодолен порог генотипической экспрессии (Wallace et al., 1997). Как только этот порог преодолевается, даже незначительное увеличение содержания мутантной мтДНК способны вызвать заметные изменения в фенотипе. Разные ткани обнаруживают различные зависимости от окислительного фосфорилирования, необходимого для обеспечения их нормальных функций. Порог уровня OXPHOS наиболее высок в нервной ткани, поперечно-полосатых мышцах и миокарде, сетчатке глаза, панкреатических островках Лангерганса и некоторых других тканях (Scion and DiMauro, 1994). Поэтому именно эти органы наиболее чувствительны к воздействию патогенных мутаций мтДНК (Wallace, 1994а, 1995). В конечном счете, разные ткани могут содержать различные количества мутантной и нормальной мтДНК (Wallace, 1982а). Таким образом, дети от одной и той же матери могут иметь совершенно разные фенотипы в зависимости от количества мутантной мтДНК в отдельных тканях.
Пятой особенностью митохондриальной генетики является более высокий уровень эволюционной изменчивости мтДНК по сравнению с ядерной ДНК. Это означает, что вредные мутации в ДНК митохондрий фиксируются гораздо чаще, чем в ядерном геноме. Несмотря на то, что лишь около 20% компонентов OXPHOS кодируются в митохондриях, а остальные — в ядре, гораздо чаще возникают расстройства тканевого дыхания, вызванные мутациями мтДНК. Однако большинство мутаций мтДНК имеют черты нейтрального полиморфизма, которые накапливались последовательно по материнской линии. Такие признаки полиморфизма создают группы родственных гаплотипов мтДНК, называемые гаплогруппами. Изменения в цепи мтДНК можно использовать для построения филогенетического древа, которая будет наглядно показывать эволюционные связи между отдельными последовательностями. Из этого следует, что как сравнительно безвредные, так и вредные мутации мтДНК закрепляются в человеческой популяции (Wallace, 1994, 1995а). Причиной значительного увеличения (почти в 10-20 раз) скорости накопления признаков полиморфизма в митохондриальной ДНК по сравнению с ядерной ДНК, по-видимому, является отсутствие в митохондриях эффективной системы восстановления (репарации) ДНК (Bogenhagen, 1999). К тому же в митохондриях отсутствует и защитный слой белков, таких как гистоны, так что мтДНК физически связана с внутренней мембраной митохондрии, где в качестве побочных продуктов окислительного фосфорилирования продуцируются высоко мутагенные кислородные радикалы (Richter, 1988).
Наконец, шестой особенностью митохондриальной генетики являются так называемые возрастные соматические мутации мтДНК. Свободные радикалы кислорода, разрушая молекулу ДНК, вызывают окислительные изменения в ее основаниях, их замещения и перестройку. Накапливание таких соматических мутаций на протяжении жизни может служить причиной развития биоэнергетического дефицита, приводящего к апоптозу и нормальному старению (Trounce et al., 1989; Simonetti et al.y 1992, Ozawa, 1995).
Разделение на бластомеры культивируемых in vitro зародышей 2-х и 4-х клеточной стадии развития
Для эксплантации зигот самки умерщвлялись путем дислокации шейных позвонков. С помощью пинцета и ножниц вскрывали брюшную полость и отодвигали в сторону весь комплекс пищеварительных органов так, чтобы были видны оба рога матки. Извлекали необходимую для получения зигот части органов репродуктивного тракта — яйцеводы — и помещали их в чашку Петри с НТ6 средой (таблица 1), содержащую HEPES-буфер (Sigma, USA) и обеспечивающую поддержание необходимого значения рН (7,4).
Далее работа проводилась в боксе под контролем стереомикроскопа МБС-9. Извлеченные яйцеводы переносились в чашку Петри с 0.1-0.2 мл раствора гиалоуронидазы (100-300 ед/мл). Расширенная часть ампулы яйцевода надсекалась инъекционной иглой. При этом яйцеклетки, окруженные лучистым венцом, свободно переходили в раствор, и в течение нескольких минут лучистый венец распадался на отдельные клетки, освобождая блестящую оболочку зародыша.
Освобожденные от фолликулярных клеток яйцеклетки при помощи вытянутой в пламени пастеровской пипетки, соединенной 6 мундштуком, переносили в среду НТ6, затем промывали еще в 3-4 порциях той же среды. Производили визуальную оценку морфологического состояния зигот. Для последующей микроинъекции отбирали жизнеспособные оплодотворенные яйцеклетки. Критерием для отбора служили целостность блестящей оболочки, наличие второго направительного тельца и отсутствие кортикальных гранул в ооплазме. человека в оплодотворенные яйцеклетки лабораторных мышей.
Перед микроинъекцией яйцеклетки инкубировались в среде НТ6, содержащей цитохалазин В (5мкг/мл), в течение 30-40 минут при 37С, после чего яйцеклетки помещали в крышку пластиковой чашки Петри в микрокаплю среды с цитохалазином В под слой стерильного вазелинового масла. На чашке Петри, рядом с микрокаплей среды, в которой находятся зародыши, помещали капельку раствора митохондрий человека для инъекций. Микроинъекции проводились на микроманипуляторе «Diavert» фирмы «Leitz». При этом использовались специально приготовленные стеклянные инъекционные иглы с диаметром 4-6 мкм. Увеличение диаметра иглы по сравнению со стандартными параметрами микроинъекционных игл (1-3 мкм) было обусловлено тем, что митохондрии человека в растворе зачастую могут образовывать конгломераты и засорять иглу. Проинъецированные зародыши отмывали в нескольких порциях среды и переносили в среду для последующего культивирования или трансплантации в яйцевод самки-реципиента. После успешной микроинъекции отбирали зиготы без видимых признаков деградации и промывали в нескольких каплях манипуляционной среды. Часть зародышей с микро инъецированными митохондриями человека культивировали в пластиковых чашках Петри в микрокаплях среды МЗ (см. таблицу 1) под слоем минерального масла (Sigma, USA) в С02-инкубаторе при 37С в течение всего доимплантационного периода. В каждую микрокаплю культуральной среды помещали 5-Ю зародышей. Аналогичной процедуре подвергали зиготы, в цитоплазму которых инъецировали буфер, не содержащей митохондрий. Контрольные эмбрионы, не подвергавшиеся микроинъекции, помещали в культуральную среду непосредственно после извлечения из яйцеводов. Часть контрольных зигот обрабатывали цитохалазином В той же концентрации и в течение того же времени, что и экспериментальные яйцеклетки, после чего культивировали in vitro в аналогичных условиях. Блестящую оболочку зародыша (zona pellucida) удаляли химическим воздействием: эмбрионы небольшими группами переносили в теплый (37 С) кислый раствор Тироде (рН 2.5) (таблицаї). Изменения поверхности зародышей контролировали под микроскопом, поскольку в кислом Тироде - в течение нескольких секунд - блестящая оболочка сжимается и истончается. До ее полного растворения эмбрионы переносили в теплую МЗ среду (передержка зародышей в среде с низким рН приводит к лизису некоторых, а то и всех клеток) и промывали. Для диссоциации эмбрионов на отдельные клетки использовали бескальциевую среду. 2-х и 4-х-клеточные зародыши инкубировали около 15-20 минут в бескальциевой среде НТ6 при 37 С. Затем каждый эмбрион по отдельности переносили в микрокаплю среды и пипетировали, втягивая и выталкивая его через микропипетку, отверстие которой чуть меньше диаметра эмбрионов (микропипетки изготавливались вручную, вытягивая капиллярную трубку). Единичные клетки, отделившиеся в процессе этой манипуляции, отбирались в 0.5 мл микроцентрифужные пробирки, содержащие 20 мкл ІхПЦР буфера, 20 мкМ дитиоэритритола, 1.7 мкМ SDS и 0.05 мг/мл протеиназы К для последующего ПЦР анализа. Зиготы лабораторных мышей без видимых признаков деградации, в цитоплазму которых были инъецированы митохондрии человека, переносились в организм псевдобеременных приемных матерей. Перенос зародышей осуществляли с помощью микропипетки в правые яйцеводы псевдобеременных самок через воронку яйцевода по 10-15 зигот на самку. Операцию проводили с использованием медицинского эфира в качестве анестетика.
Разработка видоспецифичных праймеров к мтДНК человека и мыши
В настоящей работе была предпринята попытка создания гетероплазмичной линии лабораторных мышей, клетки которых несли бы мтДНК двух видов: Mus musculus domesticus и Homo sapiens. Проведенное исследование направлено на выяснение возможности успешного переноса и сохранения чужеродного генетического материала митохондрий одного вида млекопитающих в органах и тканях другого вида.
Митохондрии человека, выделенные из клеток гепатомы HepG2, доставляли в оплодотворенные яйцеклетки мыши путем микроинъекции в цитоплазму. Тот факт, что митохондрии после окрашивания MitoTracker Red приобретали красную люминесцентную окраску, свидетельствует о функциональной активности митохондрий и интактности митохондриальных мембран. MitoTracker Red, являясь гидрофобным катионным красителем, легко проникает через билипидный слой как плазматической, так митохондриальных мембран, и направленно диффундирует в матрикс митохондрий, где за счет образования ковалентных связей с белками прочно связывается с внутренней мембраной. Наличие трансмембранного потенциала, который обеспечивается функциональной активностью дыхательной цепи и неповрежденностью мембран митохондрий, является обязательным условием люминесценции. Окрашенные MitoTracker Red митохондрии, не обладающие AW, не способны к специфической люминесценции (Gilmore and Wilson, 1999).
После микроинъекции митохондрий зиготы культивировали in vitro в течение шести суток. К концу срока культивирования около трети всех эмбрионов достигали стадии бластоцисты, что свидетельствует о жизнеспособности зародышей. Однако формирование бластоцисты иногда завершалось только через 144 часа после введения чХГ, а не через 120 часов, как это характерно для контрольных зародышей. Задержка в дроблении, должно быть, связана с довольно длительным культивированием в среде с цитохалазином В, который является антиактиновым агентом. Несмотря на то, что продолжительность
обработки ингибитором не превышала 2 часов, какое-то время необходимо для полного удаления цитохалазина из цитоплазмы и восстановления нормальной структуры цитоскелета. Об этом свидетельствует задержка в дроблении зародышей, не подвергавшихся микроинъекции, но обработанных цитохалазином В. Более низкая доля экспериментальных зародышей, достигших стадии бластоцисты (28.8±5.3%), по сравнению с контрольными зародышами, развитие 55.9±8.5% которых завершилось формированием бластоцисты (различие между долями достоверно с вероятностью 99% (t=2,6)), по-видимому, связана с цитотоксическим эффектом цитохалазина В или деструктирующим действием процедуры микроинъекции. Нельзя исключить, что на развитие зародышей оказали влияние оба фактора, хотя на имеющемся материале достоверных различий между долей сформировавшихся бластоцист в группе зародышей, не подвергавшихся микроинъекции, но обработанных цитохалазином В (36.4±8.4%), и аналогичной долей в группах зародышей, подвергшихся микроинъекции митохондрий человека (28.8±5.3%) или буфера (29.6±8.8%) обнаружить не удалось. Тем не менее, полученные результаты позволяют предполагать, что привнесенные митохондрии не оказывают негативного эффекта на развитие зародышей.
Выбранный нами способ идентификации чужеродного генетического материала (мтДНК человека) в развивающемся зародыше или новорожденной лабораторной мыши - метод полимеразной цепной реакции с видоспецифическими праймерами - является оптимальным. ПЦР по сравнению с другими методами, применяемыми в молекулярной биологии для детекции ДНК (к примеру, Саузерн-блотт) является более простым и более чувствительным. Возможно, именно выбором метода можно объяснить результаты Ebert et al. (1989), полученные при введении мышиных митохондрий в оплодотворенные яйцеклетки мыши другой линии. Исследователи использовали для детекции чужеродного генетического материала метод Саузерн-блотта и утверждали, что чужеродные митохондрии не обнаруживаются (а, следовательно, не выживают) в нормально развивающемся потомстве.
Метод ПЦР является более чувствительным, поскольку для прохождения реакции достаточно присутствия даже одной молекулы ДНК. Специально разработанные видоспецифичные праймеры позволяют утверждать, что в пробах присутствует именно искомая ДНК, в нашем случае - мтДНК человека. Наблюдавшееся нами сохранение мтДНК человека в дробящемся мышином зародыше подтверждается и результатами других работ, в которых удалось выявить чужеродную мтДНК в зародышах мыши, подвергшихся микроинъекции митохондрий другого вида или линии млекопитающих (Pinkert et al., 1997r; Rinaudo et al., 1999). Авторы также использовали метод ПЦР для обнаружения чужеродной митохондриальной ДНК в развивающихся in vitro зародышах вплоть до бластоциста.
Присутствие в мышиных эмбрионах и в органах и тканях новорожденных мышей мтДНК человека, введенной в составе митохондрий в зиготы мыши, было подтверждено как проведенными реакциями ПЦР с использованием видоспецифичных праймеров к митохондриальной ДНК человека, так и специфичным расщеплением фрагмента эндонуклеазой Alul.
Было показано, что введенный чужеродный генетический материал стабильно сохраняется в развивающихся эмбрионах лабораторного животного на протяжении всех стадий развития in vitro. Видимо, на ранних этапах развития элиминации митохондрий не происходит. Полученные нами результаты сопоставимы с данными, полученными Shitara et al. (2000). Эти исследователи показали, мтДНК, полученная из соматических клеток, в отличие от мтДНК спермиев, стабильно сохраняется и не элиминируется из эмбрионов в ходе их внутриутробного развития. Авторы предположили, что митохондрии соматических клеток не несут некоего фактора, необходимого для селективной элиминации, тогда как митохондрии спермиев узнаются яйцеклеткой и разрушаются.
Маловероятно, что в этот период происходила репликация или транскрипция чужеродной мтДНК, поскольку эти процессы не характерны и для собственной мтДНК ранних зародышей (Piko and Matsumoto, 1976). Хотя в случае, если в инъецированных митохондриях содержались необходимые компоненты для матричных процессов, не исключена возможность синтеза нуклеиновых кислот в чужеродных митохондриях в течение короткого периода после микроинъекции.
