Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Механизм репликации ДНК
1.1. Скорость репликации ДНК эукариот, единицы репликации 8
1.2. Репликативный комплекс эукариот. Мульти-ферментный комплекс синтеза предшественников ДНК. Функциональная компартментализация дезоксирибонуклеотидов 9
1.3. Прерывистый синтез ДНК. Ступенчатость синтеза. Синтез фрагментов Оказаки 12
1.3.1. Инициация синтеза фрагментов Оказаки 13
1.3.2. РНК-праймеры фрагментов Оказаки. Гетерогенность РНК-праймеров 14
1.3.3. Синтезируются ли фрагменты Оказакина обеих или на одной нити ДНК? 15
1.3.4. Ферменты синтеза фрагментов Оказаки 18
1.4. Заполнение брешей и лигирование 20
1.4.1. Ферменты, участвующие в процессе застройки брешей ( "gap filling" ) 21
1.4.2. Ингибиторы и другие факторы регуляции второго этапа репликации ДНК 23
1.4.3. Лигирование фрагментов Оказаки 25;
2. Синтез хроматина
2.1. Структура хроматина 26
2.2. Гиперчувствительность новообразованного хроматина к нуклеазам 28
2.3. Структурные особенности хроматина в репликативной вилке
2.3.1. Ступенчатое связывание гистонов с новообразованной ДНК 31
2.3.2. Модификация гистонов коровых частиц "незрелых" нуклеосом 32
2.3.3. Дефицит гистона HI во фракции "незрелых" нуклеосом. Формирование мононуклеосом с ДНК укороченной длины 34
2.3.4. Конформациошше интермедиаты вновь образованных нуклеосом 36
2.4. Характер распределения родительских и новообразованных гистонов по хроматину
при репликации
2.4.1. Модели расположения родительских и вновь синтезированных гистонов в вилке репликации 38
2.4.2. Анализ распределения новообразованных гистонов в репликативной вилке 42
2.4.3. Последовательность взаимодействия вновь образованных гистонов с ДНК
в вилке репликации 45
2.5. Динамика сборки нового хроматина 50
3. Энзиматическое метилирование ДНК при репликации
3.1. Механизм метилирования. Содержание 111 в ДНК эукариот 54
3.2, Характер метилирования ДНК высших эукариот
3.2.1. Внутригеномное распределение 55
3.2.2. Последовательности ДНК, метилируемые in vivo 57
3.3. Связь метилирования ДНК и репликации 60
3.4. Разная чувствительность метилаз к аналогам SAM-ингибиторам синтеза и метилирования ДНК 67
3.5. Метилирование ДНК и структура хроматина... 69
3.6. Биологическая функция метилирования ДНК у эукариот 73
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 79
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Динамика репликации ДНК в L-клетках мыши в зависимости от плотности клеток в культуральном слое 91
2. Метилирование фрагментов Оказаки и линкерных участков ДНК« Локализация дополнительного метилирования ДНК 103
3. Метилирование ДНК в присутствии s -изобутил-тиоаденозина (SIBA)
5. формирование нуклеосом на фрагментах Оказакидо их лигирования 121
6. Реплжативное метилирование ДНК в присутствии циклогексимида 124
7. Схема репликативного метилирования ДНК 129
ВЫВОДЫ 136
- Механизм репликации ДНК
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
- Динамика репликации ДНК в L-клетках мыши в зависимости от плотности клеток в культуральном слое
Введение к работе
Актуальность проблемы, Энзиматическая модификация (метилирование) ДНК, открытая в 1964-1965 гг, в настоящее время рассматривается как один из важных механизмов регуляции экспрессии генов и клеточной дифференцировки. В последние годы показана достаточно четкая обратная корреляция уровня метилирования и транскрипционной активности отдельных последовательностей генома, в том числе индивидуальных генов Установлено, что уменьшение степени модификации суммарной ДНК лежит в основе индукции клеток к дифференцировке. Причины и механизмы такого направленного снижения уровня метилирования ДНК пока неизвестны.
Решшкативный синтез ДНК может быть одной из возможных точек приложения регулирующих уровень и характер метилирования ДНК факторов. Исследование сопряженности процессов репликации и модификации ДНК, в этой связи, является одним из актуальных и принципиально важных направлений молекулярной биологии. Процессы репли-кативного синтеза ДНК и ее метилирования в клетке реализуются в сложном динамическом надмолекулярном комплексе ДНК с белками -хроматине. Изучение взаимосвязи синтеза и метилирования ДНК требует одновременного анализа сопряженности этих двух процессов с динамикой формирования структуры хроматина вновь образующейся ДНК.
Задачи исследования Удобная клеточная модель - культура клеток трансформированных мышиных фибробластов - была использована нами для изучения динамики репликации и репликативного метилирования ДНК в животных клетках, сопряженности этих процессов с образованием структуры хроматина в решшкативной вилке.
Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований установлено, что решшкативное ме - 7 тилирование ДНК в L -клетках осуществляется в два этапа в соответствии с двумя этапами синтеза ДНК: на первом этапе метилируются остатки цитозина во фрагментах Оказаки сразу же по мере их синтеза; при этом в них модифицируется примерно половина всех CpG- -сайтов; на втором этапе метилируются только линкерные участки ДНК (все CpG--сайты), С помощью бактериальной ДНК-метилазы м.Есо ЕІІ и ингибитора белкового синтеза циклогексимида показано, что характер метилирования ДНК при репликации определяется не только специфичностью функционирующих в репликативной вилке ДНК-метилаз, но и изменяющейся экспонированностью CpG- -сайтов в формирующейся структуре хроматина. Сформулирована общая схема репликативного метилирования ДНК, которая сводит воедино процессы дискретного синтеза и модификации ДНК и формирования хроматиновой структуры в репликативной вилке. Сформулировано представление о существовании двух ДНК-метилаз, которые модифицируют ДНК на двух этапах ее репликации,
В целом диссертационная работа носит теоретический характер. Результаты экспериментальной работы вносят вклад в понимание механизма метилирования ДНК у эукариот и могут служить основой для дальнейших исследований проблемы регуляции репликации, экспрессии эукариотических генов и клеточной дифференцировки.
Материалы диссертации могут быть использованы при чтении курсов лекций по молекулярной биологии и биохимии и уже используются в научной работе Межфакультетской проблемной НИИ им.А.Н.Белозерского МГУ.
Механизм репликации ДНК
Хромосомы эукариот имеют много точек начала репликации ДНК (точки ori ). Авторадиографические исследования, проведенные на разных клетках млекопитающих, показали, что репликация протекает, по-видимому, сходным образом у всех представителей млекопитающих (III, 119). Основные ее особенности состоят в том, что скорость-движения точки репликации (решшкативной вилки) вдоль молекулы ДНК составляет 0,1-2 мкм в мин (что соответствует 2-40I(rD или І-І5.Ю3 нукд/мш), а расстояние меаду соседними точками иющиа-ции репликации варьирует от 10 до 250 мкм (89). Это расстояние и определяет величину репликона - единицы репликации ДНК» Большинство эукариот имеет размер репликона 15-100 мкм или 50-330«10 пар оснований (89). Показано, что большинство соседних репликативннх вилок движется в противоположных направлениях (119). В результате существования большого числа одновременно функционирующих вилок общая скорость репликации эукариотической хромосомы может быть выше, чем у бактериальной, хотя скорость наращивания полинуклеотид-ной цепи у прокариот на порядок больше. Так у Е.СОІІ она состав-ляет 20 мкм/мин (133).
Рассчеты Восток и Самнер (3), основанные на оценках скорости движения реплжативных вилок, размеров реплжонов и длины молекул ДНК в клетке, показали, что в каждой клетке млекопитающих содержится, по крайней мере,20.000 репликонов.
Материалы и методы
Эксперименты проводились на ь -клетках - трансформированных 2-0-метилхолантреном фибробластах эмбриона мыши линии СШ.Клетки культивировали в монослое в стеклянных флаконах на питательной среде, состоящей из 45$ среды 199 в растворе Хенкса, 45$ среды 199 с 0,5% гидролизата лактальбумина в растворе Хенкса и 10% сыворотки крупного рогатого скота, В питательную среду добавляли антибиотики из расчета 100 ед/мл пенициллина и 0,2 мкг/мл стрептомицина. Куль-туральные растворы получены из Института полиомиелита и вируоных энцефалитов АМН СССР (среда 199 и гидролизат лактальбумина), из Московского научно-исследовательского института вирусных препаратов (раствор трипсина и раствор Хенкса), с Московского мясокомбината (сыворотка крупного рогатого скота); антибиотики получены с Саранского завода медпрепаратов.
Клетки пересевали через каждые 4-5 дней. Суспензию клеток при посеве вносили в культуральные флаконы (объем 100 мл) дозированно из расчета 3,5#10 клеток на флакон на 20-25 мл культуральной среды. Количество клеток определяли в счетной камере Горяева. Культуру выращивали до малой, средней или большой плотности клеток. Концентрацию клеток в культуральном слое оценивали по суммарному количеству ДНК на флакон (см.ниже).
Динамика репликации ДНК в L-клетках мыши в зависимости от плотности клеток в культуральном слое
Отправной точкой нашего исследования явились два принципиальных факта, обнаруженных в нашей лаборатории: метилирование ДНК фрагментов Оказаки (Демидкина и др.,1979 (13)) и торможение лигирования фрагментов Оказаки в клетках, растущих при большой плотности (Демидкина и др.,1979 (13), Башките и др.,1980 (2)). Более детальное исследование динамики репликативного метилирования ДНК и его сопряженности с синтезом ДНК потребовало анализа динамики репликации ДНК в зависимости от плотности клеток в куль-туральном слое. Ясно, что использование только временных параметров (длительность экспозиции клеток с радиоактивными предшественниками), без учета плотности клеток в слое, является неудовлетворительным, так как не дает возможности сопоставить динамику метилирования ДНК с реальной картиной (стадиями) синтеза ДНК.
Для изучения динамики репликации ДНК в мышиных фибробластах (L -клетки) клетки инкубировали в присутствии ft]- или[14с]-тимидина и [б 3-уридина. При центрифугировании в щелочном сахарозном градиенте разделяли новообразованные фрагменты ДНК. разной длины, и по включившейся в них радиоактивности анализировали профиль седиментации.
Как было показано ранее (14), при невысокой плотности клеток (1-2«105 кл/скг) и импульсных инкубациях с №}-тимидином радиоактивность ДНК в градиенте выявляется в дискретных пиках с коэффициентами седиментации от 4S до 33s и более. При этом наблюдается быстрый переход метки в зоны с коэффициентом седиментации боль При высокой же концентрации клеток (4-5»ICr КЛ/CRT) за те же сроки инкубации с радиоактивным предшественником ново синтезированная ДНК представлена, в основном, низкомолекулярными фрагментами с коэффициентом седиментации 4S.
В нашу задачу входило более детальное исследование динамики репликации ДНК, в частности, сопоставление скорости синтеза фрагментов Оказаки и перехода их в лигировэнную форму при разных экспозициях клеток определенной плотности с радиоактивным тимидином или [б- уридином или, наоборот, при одних и тех же временах инкубации с мечеными предшественниками клеток с разной исходной плотностью их в культуральном слое.
