Введение к работе
Актуальность проблемы. Важнейшие характерные свойства опухолевых клеток обусловлены аномальным функционированием сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл и апоптоз (Hanahan, Weinberg, 2000; Копнин, 2004). Митогенные и антиапоптотические сигналы передаются в ядро, где происходит активация генов-мишеней, запускающих генетические программы клеточного роста, пролиферации клеток и избегания апоптоза (Татосян, 2004).
В основе данных нарушений лежит изменение экспрессии ключевых для онкогенеза генов - протоонкогенов и опухолевых супрессоров, продукты которых задействованы в передаче сигналов в клетке и их регуляции. Согласно традиционной модели онкогенеза, нарушение экспрессии генов является результатом генетических аберраций (Knudson, 2001).
Существенный пересмотр представлений об этиологии опухолей в настоящее время связан с обнаружением значительных эпигенетических нарушений, связанных с изменением активности генов во всех типах новообразований (Esteller, 2005). К эпигенетическим модификациям клетки относят картину метилирования геномной ДНК и характер модификаций хроматина. Они определяют митотически наследуемые изменения функции генов, происходящие без нарушения нуклеотидных последовательностей (Yoo, Jones, 2006). Таким образом, аномальное изменение экпрессии генов в опухолях может иметь негенетическую природу.
Аберрантное энзиматическое de novo метилирование CG-динуклеотидов в промоторных областях генов-супрессоров (CpG-островках) в опухолях сопряжено с потерей экспрессии и функционально аналогично инактивации генов вследствие мутаций (Bird, 2002; Киселёва, Лихтенштейн, 2004). Изменения нормального метилирования ДНК появляются на самых ранних этапах онкогенеза, когда клетка еще не приобрела свойства опухолевой (Hoist et al., 2003), и поэтому представляют исключительную ценность для ранней диагностики, прогноза и классификации онкозаболеваний (Laird, 2003; Залетаев и др., 2004). Эпигенетическая инактивация транскрипции обратима: деметилирующие агенты реактивируют ген, открывая возможность новой эпигенетической терапии онкозаболеваний (Yoo, Jones, 2006). Аномальное метилирование генов онкогенных сигнальных путей может предрасполагать к накоплению мутаций в генах тех же путей (неслучайность мутаций), приводя к прогрессии опухоли (Baylin, Ohm, 2006). Функционально эпигенетические и генетические нарушения при канцерогенезе представляются одинаково важными и находятся в тесном взаимодействии друг с другом (Feinberg, 2004; Ванюшин, 2005).
Хронический В-клеточный лимфо лейкоз (В-ХЛЛ) представляет одно из наиболее распространённых лимфопролиферативных заболеваний, крайне гетерогенное по своему течению и характеризующееся нарушением апоптоза и клеточного цикла (Никитин, 2001; Zent, Kay, 2004). Цитогенетические нарушения в опухолевом клоне редко обнаруживаются на ранних стадиях заболевания (Chiorazzi et al., 2005), что позволяет предположить важный вклад эпигенетических изменений в патогенез В-ХЛЛ. Однако характер метилирования геномной ДНК в опухолевых клетках при В-ХЛЛ мало изучен. Данные литературы характеризуют общее содержание 5-метилцитозина, картину метилирования нескольких генов, а также аномальное метилирование отдельных CG-динуклеотидов в масштабе генома (Rush et al., 2004). Функциональное значение изменений картины метилирования ДНК при В-ХЛЛ в целом остаётся неясным.
Многие широко используемые методы изучения картины метилирования ДНК обладают низкой информативностью и позволяют изучать метилирование лишь нескольких нуклеотидов за один эксперимент (например, метилспецифичная ПЦР). Методы анализа метилирования протяжённых локусов (Ажикина, Свердлов, 2005) или целого генома (Rush, 2004) удовлетворяют условию масштабности, но достаточно трудоёмки и ограничивают исследование нуклеотидами в участках узнавания метилчувствительных рестриктаз. Особую актуальность поэтому приобретает разработка нового метода масштабного изучения метилирования, с помощью которого можно одновременно исследовать характер метилирования множества (сотни, тысячи) нуклеотидов разных локусов/генов сразу в нескольких биологических пробах. В настоящей работе данные условия реализуются с использованием технологии ДНК-чипов (Hoheisel, 2006).
Разработка и применение данного метода для сравнительного исследования картины метилирования ДНК в опухолевых клетках при хроническом В-клеточном лимфолейкозе и В-лимфоцитах здоровых доноров имеет важное теоретическое и практическое значение. Обнаружение аберрантно метилированных генов существенно расширяет наши представления об эпигенетическом механизме заболевания. Аномально метилированные гены могут рассматриваться в перспективе в качестве биомаркеров для диагностики и прогноза В-ХЛЛ, а также мишеней для новых эпигенетических подходов к терапии.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было сравнительное исследование картины метилирования 5-областей (промотор, первый экзон) потенциально важных для онкогенеза генов в опухолевых клетках при хроническом В-клеточном лимфолейкозе и в В-лимфоцитах здоровых доноров.
Для выполнения цели поставлены следующие задачи:
выбрать гены-кандидаты для изучения метилирования их 5-регионов (по данным литературы);
разработать метод масштабного анализа картины метилирования ДНК с помощью гибридизации на in situ синтезированных олигонуклеотидных ДНК-чипах;
выделить ДНК из периферической крови больных В-ХЛЛ и В-лимфоцитов здоровых доноров и модифицировать её бисульфитом натрия;
разработать олигонуклеотидные праймеры и провести ПЦР-амплификацию исследуемых областей генов на модифицированной бисульфитом ДНК (пробоподготовка);
спроектировать олигонуклеотидный состав ДНК-чипов для изучения характера метилирования искомых генов и синтезировать олигонуклеотидные зонды на поверхности чипов;
провести сравнительный гибридизационный анализ картины метилирования ДНК больных В-ХЛЛ и здоровых доноров;
верифицировать полученные результаты для некоторых генов с помощью широко используемых альтернативных методов - метилспецифичной ПЦР и бисульфитного секвенирования ДНК;
сопоставить характер метилирования ДНК с признаками, имеющими прогностическое значение при В-ХЛЛ: мутационным статусом генов иммуноглобулинов IgVn, стадией заболевания, исходным уровнем лимфоцитов, временем удвоения лимфоцитов, характером поражения костного мозга и полом;
9. предложить гипотетический эпигенетический механизм нарушения контроля передачи митогенных и проапоптотических сигналов в клоне В-ХЛЛ.
Научная новизна. Разработанный метод масштабного анализа картины метилирования ДНК с помощью гибридизации на ДНК-чипах с in situ синтезированными олигонуклеотидными зондами не имеет аналогов в отечественной литературе и позволяет дискриминировать пробы ДНК разной степени метилирования. В ходе одного эксперимента возможен одновременный анализ метилирования порядка 1000 индивидуальных CG-динуклеотидов в каждой из восьми биологических проб. Впервые в опухолевых клетках В-ХЛЛ выявлено аберрантное метилирование генов сигнального пути Wnt: WIF1 (65%, 30/46), DKK1 (50%, 23/46 образцов), PYG01 (86%, 19/22), DACT1 (6%, 3/46), DKK2 (3/7), DKK3 (2/7); проапоптотических генов APAF1 (4/10), ВАХ (3/10) и RAD9A (3/10); гена, контролирующего клеточный цикл, UBE2C (4/6), а также генов BCL6 (6/6) и FSCN1 (2/6). Аномальное метилирование данных генов, очевидно, имеет неслучайный характер и, по-видимому, вносит важный вклад в патогенез хронического лимфолейкоза, приводя к нарушению контроля клеточного цикла и передачи митогенных и апоптотических сигналов вклетках В-ХЛЛ.
Практическая значимость. С помощью гибридизации на олигонуклеотидных ДНК-чипах возможен эпигенетический анализ любого типа опухоли, а также поиск новых локусов, подверженных метилированию при онкогенезе. После дополнительных испытаний данный метод может быть использован в диагностических целях по ранее описанным маркерам метилирования ДНК в биоптатах опухолей или биологических жидкостях организма. Установленное в работе аберрантое метилирование генов SFRP1, WIF1, PYG01 и ряда других при В-ХЛЛ (в т.ч. на ранних стадиях заболевания), а также характер метилирования отдельных CG-динуклеотидов создаёт основу для разработки диагностического теста на основе метилспецифичной ПЦР, а также испытаний деметилирующих агентов (например, децитабина) в качестве средств эпигенетической химиотерапии. Обнаруженное метилирование генов негативных регуляторов сигнального пути Wnt важно для разработки направленной терапии В-ХЛЛ (например, ингибиторов (3-катенина).
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на био лого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, в спецкурсах «Молекулярная биология», «Генетическая инженерия», «Молекулярная диагностика», а также при проведении практических и семинарских занятий по биохимии в Воронежской государственной медицинской академии.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях: ежегодной международной конференции по методам анализа с помощью биочипов «Chiptechnologien» (Франкфурт, 2006); XIX зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007); 2-ой конференции Германского центра исследования рака (Хайдельберг, 2006); 10-й Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); межрегиональных конференциях, посвященных памяти проф. А.А. Землянухина (Воронеж, 2006, 2007); ежегодной научной сессии отчётной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского
государственного университета (2007); ежегодной конференции «Философские проблемы биологии и медицины» (Воронеж, 2004). По итогам 2-ой конференции Германского центра исследования рака сообщение признано победителем конкурса.
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях - 6 статьях, 5 тезисах и 1 учебно-методическом пособии.
Работа поддержана 6-месячной стипендией Германской службы академических обменов (DAAD) и Министерства образования и науки РФ по совместной российско-немецкой программе «Михаил Ломоносов» (2004-2005 гг..) и годовой стипендией для молодых учёных от DAAD (2005-2006 гг..).
Положения, выносимые на защиту:
Разработанный гибридизационный метод анализа картины метилирования ДНК на олигонуклеотидных чипах позволяет проводить масштабное исследование метилирования ДНК (порядка 1000 CG-динуклеотидов) одновременно в нескольких биологических пробах.
Аномальное метилирование генов, контролирующих клеточный цикл, и проапоптотических генов является частым событием в опухолевых клетках при В-ХЛЛ.
Высокая частота метилирования генов негативных регуляторов онкогенного сигнального пути Wnt предполагает эпигенетический механизм его аномальной активации в клоне В-ХЛЛ.
Гипотетическая схема дерегуляции клеточного цикла и апоптоза, ассоциированной с аберрантным метилированием генов в клетках В-ХЛЛ.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 203 страницах машинописного текста (150 стр. основного текста и 53 стр. приложения) и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (297 источников). Иллюстрационный материал включает 41 рисунок и 8 таблиц. Материал, не вошедший в основной текст работы, изложен в пяти приложениях.
Объекты исследования. В качестве объектов исследования служили образцы периферической крови 46 больных с диагнозом хронический В-клеточный лимфолейкоз и 8 здоровых доноров. Пробы периферической крови больных были получены из лаб. функциональной морфологии гемобластозов (зав. проф., д.б.н. И.А. Воробьёв) и лаб. молекулярной гематологии (зав. к.б.н. А.Б. Судариков) Гематологического научного центра РАМН с письменного согласия больных. Клинико-диагностистическая информация предоставлена с.н.с, к.м.н. Е.А. Никитиным.
Селекция В-лимфоцитов. В-лимфоциты из периферической крови здоровых доноров осаждали на магнитных частицах с иммобилизованными антителами к поверхностному антигену CD 19 - Dynabeads CD 19 (Pan В) («Dynal Biotech ASA», Норвегия) согласно рекомендациям изготовителя.
Выделение геномной ДНК. Геномную ДНК из цельной крови больных В-ХЛЛ и В-лимфоцитов здоровых доноров выделяли с помощью сорбции на микроколонках с силикагелевой мембраной - набор QIAamp DNA Blood Mini Kit («Qiagen», Германия) - в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически.
Модификация ДНК бисульфитом натрия. ДНК модифицировали бисульфитом по стандартной методике (Warnecke et al., 2002) с некоторыми изменениями. Полноту конверсии С—»U подтверждали бисульфитным секвенированием.
ПЦР-амплификация исследуемых областей нативной и модифицированной бисульфитом ДНК. Нуклеотидные последовательности разработанных праймеров, размеры ампликонов и условия проведения ПЦР суммированы в таблице 2 диссертации. Праймеры для амплификации модифицированной ДНК не содержали CG-динуклеотидов или имели однонуклеотидную замену в положении, соответствующем 5тС. ПЦР-амплификацию проводили в режиме «горячего старта» с использованием HotStartTaq ДНК-полимеразы и реактивов фирмы «Qiagen» в объёме 25-100 мкл. Каждый праймер для метилспецифичной ПЦР содержал 2-4 анализируемых CG-динуклеотидов. Результаты ПЦР оценивали в 2%- и 3,5%-(метилспецифичная ПЦР) агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Специфичность ампликонов оценивали с помощью маркерных фрагментов ДНК, а также бисульфитного секвенирования. Концентрацию ПЦР-продуктов после очистки определяли спектрофотометрически или денситографически с помощью маркерных фрагментов ДНК («Fermentas», Литва) и общедоступной программы Image J 1.34s на сервере NCBI ().
Метилирование ДНК in vitro. Препараты полностью метилированной геномной ДНК и ПЦР-продуктов получали с помощью фермента SssI -метилтрансферазы («New England Biolabs», США) согласно протоколу производителя. Полноту метилирования подтверждали с помощью гидролиза метилчувствительной рестриктазой BstUI, имеющей участок узнавания CG^CG («New England Biolabs»). Пробы ампликонов 25% и 50% степени метилирования получали, смешивая соответствующие количества полностью метилированной и неметилированной ДНК.
Мечение ДНК биотином. Смесь ПЦР-продуктов для гибридизации на олигонуклеотидном чипе (0,5 пмоль каждого ампликона) метили Biotin-16-dUTP («Roche Diagnostics GmbH», Германия) методом рассеянной затравки (Mund et al., 2005).
Проектирование олигонуклеотидного состава ДНК-чипов и их синтез in situ.
Гибридизационный анализ на олигонуклеотидньгх ДНК-чипах проводили в отделе функционального анализа генома (зав. Dr. J.D. Hoheisel) Германского центра исследования рака (German Cancer Research Center) в Хайдельберге, Германия.
Нуклеотидные последовательности олигонуклеотидньгх зондов (17 или 21 нуклеотидов) ДНК-чипа генерировали программой MethPat («Febit Biotech AG», Германия) по заданным последовательностям гибридизуемых на чипе ПЦР-продуктов. Характер метилирования каждого отдельного CG-динуклеотида анализировали с помощью пары зондов, один из которых коплементарен исходно метилированной ДНК-мишени (М-зонд, содержит CG), а другой - исходно неметилированной ДНК (U-зонд, содержит TG). Исследуемый CG-динуклеотид соответствовал центральному нуклеотиду зонда. Возможную перекрестную гибридизацию олигонуклеотидньгх зондов и проб ДНК оценивали, используя дополнение к MS Excel SNP Cross Checker («Febit Biotech AG»). УФ-направленный синтез олигонуклеотидньгх зондов in situ проводили на экспериментальной установке Geniom One («Febit Biotech AG») стандартным фосфорамидитным методом (Baum et al., 2003). В каждом из 8 каналов ДНК-чипа синтезировали 6776 олигонуклеотидньгх зондов (всего на чипе - 54208 олигонуклеотидньгх зондов), среди которых не менее 310 контрольных олигонуклеотидов для контроля качества олигонуклеотидного
синтеза, эффективности мечения гибридизуемой ДНК и подтверждения отсутствия неспецифической гибридизации. Нуклеотидные последовательности зондов указаны в Приложении 5 к диссертации.
Гибридизация, отмывание и детекция флуоресцентных сигналов. Гибридизацию меченной биотином ДНК с олигонуклеотидными зондами чипа проводили в буфере MES (Mund et al., 2005) при 45С в течение 16 ч. По окончании гибридизационный раствор удаляли и чип отмывали два раза: буфером SSPE 6х при 25С 7 мин и SSPE 0,5х при 45С 7 мин. Для амплификации сигналов ДНК-чип инкубировали с конъюгатом стрептавидин-К-фикоэритрин («Molecular Probes», Нидерланды) при 25С в течение 25 мин. Флуоресцентные сигналы регистрировались встроенной цифровой камерой установки Geniom One. Измерение интенсивностей сигналов осуществлялось автоматически (Baum et al., 2003).
Бисульфитное секвенирование ДНК. Определение нуклеотидной последовательности очищенных ПЦР-продуктов осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI 3730XL с помощью набора BigDyeTerminator 3.1 и программы KB basecaller («Applied Biosystems», США) согласно рекомендациям производителя.
Поиск CpG-островков в 5'-областях генов. CpG-островки идентифицировали с помощью программы Methprimer ()
Статистическая обработка экспериментальных данных. Каждый олигонуклеотидный зонд синтезировали на ДНК-чипе в 5-9 повторностях. Достоверность отличия индекса метилирования CG-динуклеотидов в ДНК больных и в норме оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Изучение связи гиперметилирования генов с прогностическими факторами В-ХЛЛ проводили с помощью двустороннего точного критерия Фишера. Обсуждаются статистически достоверные различия при Р<0,05 (Glantz, 2002; Лакин, 1990).
