Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы II
I. Природа, возникновение дополнительных оснований и содержание 5-метилцнтозина в ДНК растений II
1.1. Природа дополнительных оснований в ДНК растений ... II
1.2. Содержанке 5-метилцитозина в ДНК растений -12
1.2.1. Видовые различия 12
1.2.2. Тканевая (клеточная) разнокачественность метилирования генома растений 13
1.2.3. Метилированные основания в ДНК субклеточных органелл растений (хлоропласти и митохондрии) 14
1.2.4. Метилирование ДНК при разных инфекциях и неблагоприятных условиях произрастания 15
1.2.5. Метилирование ДНК при прорастании семян 17
1.3. Возникновение дополнительных метилированных оснований в ДНК растений 19
1.3.1. Механизм метилирования 19
1.3.2. Специфичность метилирования ДНК 22
1.4. Распределение 5-метилцитозина в геноме 24
1.4.1. Метилирование сателлитной ДНК 24
1.4.2. Содержание 5-метилцитозина в AT- и GC -обогащенных фракциях ДНК 24
1.4.3. Метилирование повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК 25
1.5. Метилирование и синтез ДНК 26
1.5.1. Возникновение полупрометилированных сайтов .... 28
1.5.2. Влияние 5-азацитидина 30
Стр. 1.6. Возможная функциональная роль метилирования ДНК у эукариотов 30
II. Экспериментальная часть 37
2. Материалы и методы исследования . 37
2.1. Обработка и посев семян пшеницы, отбор и пикировка проростков . . 37
2.2. Введение радиоактивной метки в ДНК проростков ... 37
2.2.1. Срезанные проростки 37
2.2.2. Целые проростки 38
2.3. Фиксация проростков и подготовка к выделению ДНК . . 38
2.4. Выделение ДНК 38
2.4.1. Использование модифицированного метода Шмидта и Таннгаузера для определения уровня метилирования и состава новообразованной ДНК 38
2.4.2. Выделение ДНК с проназной и РЖазной обработкой для фракционирования в градиенте плотности хлористого цезия 39
2.4.3. Выделение ДНК с проназной и щелочной обработкой
для анализа уровня метилирования 40
2.5. фракционирование ДНК в градиенте плотности хлористого цезия 40
2.6. Анализ состава и уровня метилирования ДНК 41
2.6.1. Суммарная немеченая ДНК 41
2.6.2. Меченая новообразованная ДНК 43
2.7. Анализ состава (плавучей плотности) ДНК методом равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия . 44
2.8. Выделение и очистка митохондрий из проростков пшеницы 45
2.9. Фиксация митохондрий, обработка, подготовка препаратов, электронная микроскопия 46
2.10. Выделение ДНК из градиента плотности хлористого
цезия и измерение радиоактивности 47
2.11. Измерение радиоактивности, включенной в ДНК от
дельных органов проростка (динамика синтеза ДНК
в проростке) 48
2.12. Определение содержания ДНК в проростке 49
3. Результаты и их обсуждение 51
3.1. Состав и уровень метилирования новообразованной ДНК в развивающихся проростках пшеницы 51
3.1.1. Проростки пшеницы разного возраста 51
3.1.2. Разные органы проростков пшеницы 53
3.1.3. Колеоптили и листья разного возраста 54
3.2. Митохондриальная природа фракции ДНК, синтезирующейся в стареющих колеоптилях: ее состав и уровень метилирования 55
3.2.1. Метаболическая стабильность новообразованной в стареющем колептиле ДНК 55
3.2.2. Влияние циклогксимида и бромистого этидия на синтез ДНК в стареющих колеоптилях 59
3.2.3. Влияние истощения путем инкубации в воде срезанных проростков на синтез ДНК 60
3.2.4. Митохондриальная природа новообразованной в стареющих колеоптидях ДНК, ее состав и уровень метилирования 64
3.3. Первый лист развивающихся этиолированных проростков пшеницы как модель для исследования метилирования ДНК в клеточном цикле на уровне целого растения: синхронность синтеза ДНК в органе и возможность дифференцировать синтез мтДНК и яДНК 71
3.4. Метилирование яДНК в клеточном цикле интеркалярной меристемы первого листа развивающихся проростков пшеницы 84
3.4.1. Уровень метилирования ДНК, синтезируемой в разные моменты цикла синтеза (короткая импульсная метка) 84
3.4.2. Динамика "дометилирования" новообразованной ДНК
вне репликации 87
3.4.3. Исследование репаративного синтеза ДНК в клеточном
цикле в развивающихся проростках пшеницы 89
Заключение 92
Выводы 94
Литература 95
- Природа, возникновение дополнительных оснований и содержание 5-метилцнтозина в ДНК растений
- Обработка и посев семян пшеницы, отбор и пикировка проростков
- Состав и уровень метилирования новообразованной ДНК в развивающихся проростках пшеницы
Введение к работе
Актуальность исследования. Энзиматическая модификация (метилирование) ДНК, открытая в 1964-1965 гг., рассматривается как один из механизмов регуляции экспрессии генов и клеточной диф-ференцировки у про- и эукариотических организмов. Исследование специфичности и свойств такой модификации генома в клетке тлеет первостепенное значение для расшифровки механизмов трансформации клеток, для понимания регуляции репликации и репарации ДНК. Поэтому проблема метилирования ДНК - это одна из важнейших проблем современной молекулярной биологии и молекулярной генетики, имеющая важное значение для многих прикладных работ в области медицины, сельского хозяйства, генной инженерии.
В ДНК всех высших растений количество метилированного основания - 5-метилцитозина - в несколько раз больше, чем в ДНК животных и бактерий, где его содержание не превышает нескольких долей процента. В ДНК некоторых видов растений более половины всех остатков цитозина оказывается прометилированной. Эта энзиматическая модификация у микроорганизмов лежит в основе явлений хозяйской модификации и рестрикции и является одним из тонких механизмов в контроле за репликацией ДНК.
У высших эукариот роль метилирования ДНК, по-видимому, полифункциональна: метилирование ДНК связывают с регуляцией активности генома и клеточной дифференцировкой. На это указывают непостоянство содержания т^с в ДНК в разных органах и тканях одного и того же животного, изменения в уровне метилирования ДНК в онтогенезе и под воздействием гормонов, а также различный уровень метилирования работающих и молчащих генов. Для реализации сигнальных функций модификации-рестрикции достаточно очень малого количества этого минорного основания в ДНК. Функциональная же роль "суперметилирования" ДНК растений в сравнении с животными и микроорганизмами не известна. До сих пор совершенно не изучены ни природа механизма "суперметилирования" ДНК, ни свойства и специфичность действия ДНК-метилаз у высших растений.
Совершенно не изучены также ни динамика метилирования при воспроизведении ДНК в клеточном цикле, ни характер метилирования ДНК при репликации. Во многом это связано с отсутствием достаточно надежных и удобных растительных моделей, сочетающих синхронность клеточных процессов с гомогенностью клеточной : -. популяции в целом растении или его отдельных органах.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явились поиск и анализ растительной модели, сочетающей естественную, природную синхронность репликации ДНК всех ее клеток и связанную естественными регуляторними связями в системе целого развивающегося растения, а также использование такой модели для решения вопроса о динамике и природе "суперметилирования" ДНК у высших растений. Эти сведения не только важны для общетеоретического представления об участии метилирования в процессах регуляции активности генома растений и клеточной дифференциров-ки, но и, в принципе, могут быть использованы практически для подбора регуляторов роста и развития растений с четко установленным механизмом действия.
Научная новизна. Полученные данные оригинальны и представляют существенный научный интерес. Впервые установлено, что в первом листе этиолированных проростков пшеницы синтез ДНК синхронен и цикличен. В каждом цикле синтеза реплицируется ядерная и митохондриальная ДНК, репликация яДНК опережает репликацию мтДНК. За первые три цикла синтеза ДНК в листе содержание ДНК в этом органе каждый раз удваивается. Таким образом, первый лист можно использовать как модельную систему для исследования метилирования ДНК в клеточном цикле на уровне целого растения. С помощью этой модели впервые установлено, что метилирование ДНК в меристеме у растений осуществляется как при решшкативном, так и репаративном синтезе ДНК; уровень решшкативного метилирования ДНК низок и напоминает уровень метилирования ДНК животного происхождения. Дометилирование новообразованной ДНК до уровня суммарной ДНК проростка происходит при репаративном синтезе и завершается к концу клеточного цикла; мтДНК пшеницы не содержит т^с и по этому признаку, так же как и по составу, отличается от яДНК.
Практическая значимость работы. Диссертационная работа носит теоретический характер. Полученные оригинальные данные могут быть использованы при чтении курсов лекций по физиологии растений и молекулярной биологии. Результаты экспериментальной работы вносят вклад в понимание механизма метилирования ДНК и могут быть использованы в ряде случаев как тестовые системы при изучении природы синтеза ДНК при экспериментальных воздействиях на целые растения или его части. Практическое значение работы также заключается в отработке условий и подходов для изучения участия механизма метилирования ДНК в регуляции репликации и экспрессии генома растений и клеточной дифференцировки.
Полученные в работе результаты и разработанные методы изучения синтеза и энзиматической модификации ДНК (метилирования) уже используются в Межфакультетской проблемной НИЛ молекулярной биологии и биоорганической химии имени А. Н. Белозерского МГУ и могут быть рекомендованы для других физиологических и биохимических лаборатории АН СССР и сельскохозяйственных научно-исследовательских учреждений.
I. Обзор литературы
I. Природа, возникновение дополнительных оснований и содержание 5-метилпитозина в ДНК растений
I.I. Природа дополнительных оснований в ДНК растений
В ДНК разного происхождения наряду с обычными могут встречаться дополнительные метилированные основания. У бактерий в качестве таких минорных оснований в ДНК находят и -метиладе-нин ( гаА ) и 5-метилвдтозин - пгС (Ванюшин Б. Ф., 1968, 1974), а в ДНК высших растений уже давно выявлен m5C ( Wyatt9 1950, 1951; wardeli , Skoog , 1969; Ванюшин Б. Ф., 1965, 1972, 1968, 1974; Ванюшин Б. Ф., Белозерский А. Н., 1959). Для исследования специфичности метилирования генома особый интерес приобретают поиски в ДНК высших растений других оснований, и в частности m6A . После инкубирования проростков кукурузы, ячменя, редиса, гороха, огурца, хлопчатника и подсолнечника с 8-^С-аденином заметная радиоактивность обнаруживается как в аде-нине, так и в га А , выделенных из ДНК этих проростков (Ванюшин Б. Ф. и др., 1971). Значит, ш^А может присутствовать в ДНК как однодольных, так и двудольных растений. Позднее Бурьянов Я. И. и др. (1972) подтвердили заключение о присутствии тбА в ДНК у высших растений: из ДНК пыльцы ивы и березы они выделили и спектрофотометрически определили m А (около 0,22 мол. %). По содержанию ш6а в ДНК высшие растения сопоставимы с бактериями и водорослями.
Исследование характера энзиматической модификации ДНК в ядре, хлоропластах и митохондриях у высших растений приобретает особый интерес и валено не только для понимания регуляции транскрипции генома в этих субклеточных структурах, но и для выяснения вопроса о происхождении и эволюции этих структур.
1.2. Содержание 5-метилцитозина в ДНК растений
I.2.I. Видовые различия
Обнаруживается т5с в суммарных ДНК всех изученных до сих пор высших растений (Ванюшин Б. Ф., 1965, 1972; Ванюшин
Б. Ф., Белозерский А. Н., 1959; Ванюшин Б. Ф. и др., 1972).
Количество т5с в ДНК высших растений может достигать 8 -
10 мол. % и различаться у разных видов почти в 10 раз.
Из всех высших растений наименьшим количеством га с обладают ДНК некоторых мхов (около 1-2 мол. %), причем даже и такие, которые обладают высоким содержанием вдтозиновых остатков и принадлежат к GC -типу (Ванюшин Б. Ф. и др., 1971; Ко-курина Н. А., Ванюшин Б. Ф., 1975). По содержанию т5с в ДНК изученные мхи близки водорослям (Ванюшин Б. Ф. и др., 1971; Кокурина Н. А., Ванюшин Б. Ф., 1975; Пахомова М. В. и др., 1968).
Различия в уровне метилирования ДНК найдены у разных видов плаунов (Ванюшин Б. Ф. и др., 1971), злаков, лилейных, амариллисовых и других растений (Ванюшин Б. Ф., 1972; Дохием М. и др., 1978). Максимальными различиями в уровне метилирования ДНК обладают лилейные; так, содержание га^С в ДНК майника почти в девять раз выше, чем в ДНК кордилины (Дохием М. и др., 1978). В отличие от большинства эволюпионно молодых и процветающих сейчас лилейных, кордилина имеет некие архаичные черты метилирования генома: как у многих примитивных фотосинтетиков и архегониальных, ее ДНК очень слабо метилирована - пгС = =1,1 мол. % (Дохнем М. и др., 1978). Итак, эволюция видов у высших растений отразилась определенным образом и на уровне метилирования их ДНК. Предполагается, что в процессе прогрессивной эволюции известное преимущество получили виды с относительно высоким содержанием га50 в ДНК (Ванюшин Б. Ф. и др., 1971).
1.2.2. Тканевая (клеточная) разнокачественность метилирования генома растений
Известно, что в животных клетках метилирование ДЖ характеризуется тканевой, клеточной и субклеточной специфичностью (Ванюшин Б. Ф., 1968, 1974; Васильев В. К. и др., 1972; Vanyushin eta» 1973). При изучении состава ДНК у разных цветковых растений (горох, мышиный горошек, табак, яблоня, ландыш) обнаружено, что по содержанию га с ДНК из генеративных частей (соцветия, цветы) достоверно отличаются от ДНК вегетативных органов - листьев, побегов (Хвойка Д\ и др., 1974, 1978). Так, у табака количество ш^с в ДЖ соцветий на 0,8 мол. % выше, чем в ДЖ нижних листьев. Это в полной мере согласуется с представлениями о существовании градиента цветения (Skoog , Ann , 1955; warden , 1977). Недавно удалось индуцировать цветение растений с помощью очищенной фракции повторяющихся последовательностей ДНК, выделенной из цветущих растений; эта фракция, по-видимому, заметно обогащена m с (warden, 1977). Статистически достоверные различия по количеству т о выявлены между ДНК вегетативных и цветочных почек яблони; верхние листья табака содержат заметно больше ш5с в ДНК, чем нижние - старые (Хвойка I. и др., 1978). Может быть, это является отражением возрастного уменьшения метилирования генома, как при старении у животных (Ванюшин Б. Ф., Бердышев Г. Д., 1977), и коррелирующего с этим угасания функциональной активности генов в старых листьях. ДНК из разных частей взрослого паразитического цветкового растения cuscuta » паразитирующего на люцерне, сходны по GC -содержанию, но зато заметно различаются по количеству т5С (Ванюшин Б. Ф. и др., 1979). В апикальной части этого растения ДНК меньше метилирована, чем ДНК гаусторий, а в постгаусториальных зонах она метилирована еще больше. Поскольку у этого паразита во взрослом состоянии хлоропласты отсутствуют, а количество пропластид очень сильно редуцировано, то считается, что найденные различия по количеству т^с в ДНК разных зон этого растения относятся именно к суммарным ядерным ДНК ода).
Все эти факты означают, что у высших растений, как и у животных, существует органная разнокачественность метилирования ДНК. Следовательно, и у растений уровень и характер метилирования генома определенным образом связаны с клеточной дифференци-ровкой.
1.2.3. Метилированные основания в ДНК субклеточных органелл растений (хлоропласты и митохондрии)
О метилировании аденина ДНК в хлоропластах и митохондриях растений ничего не известно. Специально предпринятые исследования не выявили га5с ни в хпДНК, ни в мтДНК высших растений (Ванюшин Б. Ф., 1968, 1974; Кирнос М. Д. и др., 1983; Tewari » Wildman , 1966). В то же время m^G есть в хпДНК одноклеточной водоросли Ghlamydomonas reinhardi ( Sager, Grabowy, Sano , 1981). В этом случае метилирование ДНК играет важную роль в механизме наследования хпДНК по материнской линии. При слиянии (+) и (-) гамет и образование зиготы отцовская (-) хпДЖ элиминируется. Предполагается, что этот процесс осуществляется по типу рестрикции.
1.2.4. Метилирование ДЕК при разных инфекциях и неблагоприятных условиях произрастания
Уровень метилирования ДНК может резко изменяться при заражении растений вирусами и дритопатогенными микроорганизмами. Так, например, в ДНК зараженных вирусом мозаики костра растений ячменя содержание пгС примерно вдвое меньше, чем у здоровых растений (Ванюшин Б. Ф. и др., 1971). Количество пгс в ДНК ячменя резко уменьшается и после заражения вирусом штриховатой мозаики ячменя (Ванюшин Б. Ф. и др., 1971). Таким образом, заражение растений вирусами может сказываться на характере метилирования ДНК растения-хозяина. Это совпадает с известной гипотезой Борека и Сринивасана об онкогенной роли вирусов, согласно которой вирусы могут привносить в клетку новую генетическую информацию для синтеза новых или искажения работы хозяйских ДНК-метилаз (Ванюшин Б. Ф., 1983).
Существенные изменения в метилировании ДНК у растения-хозяина могут происходить под влиянием цветковых растений-паразитов. Так, в ДНК стеблей люцерны выше прикрепления кускуты заметно увеличивается содержание ш^с (Ванюшин Б. Ф. и др.,1979). Может быть, это происходит в результате изменения паразитом содержания и соотношения известных фитогормонов в клетках у растения-хозяина.
Содержание т5с в ДНК листьев, пораженных вилтом, растений хлопчатника уменьшается почти в два раза ( Guseinov , Vanyu- shin , 1975). Никаких иных заметных изменений в структуре ДНК пораженных грибом (verticiiiium dahiiaekiieb ) растений хлопчатника при этом не обнаруживается (GC -содержание, Тдд, д Т, содержание разных по длине и составу пиримидиновых блоков, кинетика реассоциации). Это означает, что гриб вызывает заметное уменьшение собственно степени метилирования ДНК растения-хозяина. Это индуцированное грибом изменение уровня метилирования ДНК у хлопчатника не хаотично, а избирательно касается определенных нуклеотидных последовательностей: у пораженных вилтом растений, в отличие от здоровых, ш^с отсутствует в дипирими-диновых фрагментах ДНК; кроме того, в ней резко снижен уровень метилирования последовательностей С3, С2 Т, С Т2 и в особенности - длинных пиримидиновых блоков с количеством нуклеотидных остатков п = 7. Наряду с этим, вызванное грибом специфическое "деметилирование" ДНК растения-хозяина вовсе не затрагивает уникальные последовательности в геноме, а отмечается преимущественно в высоко ( Cot = 0-3,7'Кг) и разных умеренно повторяющихся ( Cot = 0-487; 0-10,5; 0-0,8) последовательностях. У по- раженных вилтом растений количество га с в повторяющихся последовательностях ДНК уменьшается в 2-3 раза (Guseinov, Vanyushin t 1975) Считается, что именно умеренно повторяющиеся последовательности в ДНК соответствуют регуляторним сайтам генома. Поэтому отмеченное нарушение метилирования именно этих участков генома может быть довольно эффективным механизмом расстройства регуляции генной активности растения-хозяина, по-видимому, на пользу гриба-паразита.
Воздействие на геном хозяина путем нарушения его метилирования, по-видимому, довольно общий молекулярный механизм патогенеза, свойственный многим фитопатогенным грибам. Уменьшение уровня метилирования ДНК у растений-хозяев обнаружено при заражении пшеницы ржавчинными грибами (Смирнова Т. А. и др., 1976) и при поражении картофеля разными расами фитофторы (Ванюшин Б.Ф. и др., 1979).
Метилирование ДНК может значительно изменяться при неблагоприятных условиях выращивания растений. Так, например, содер- жание пг с в ДНК подсолнечника снижается при борной недостаточности в сочетании с выращиванием при повышенных температу- pax, при этом заметнее всего количество m с уменьшается в ДНК конусов нарастания (Боженко в. П. и др., 1972). Уменьшение содержания ш5с в суммарной ДНК отмечено у растений цветной капусты при молибденовой недостаточности и растений томата при недостаточности цинка (Боженко в. П., Беляева вЛ., 1977). Исследования влияния разных условий выращивания на метилирование генома растений еще пока относительно немногочисленны, и конкретные механизмы этого воздействия неизвестны.
1.2.5. Метилирование ДНК при прорастании семян
Одним из первых указаний на изменение метилирования ДНК в онтогенезе у растений было сообщение о том, что содержание щ5с в ДНК хлопчатника несколько увеличивается при прорастании - через 10 ч (Ванюшин Б. Ф. и др., 1972). Эти данные указывали на то, что в покоящихся семенах ДНК может быть частично недо-метилирована по сравнению с ДНК проростков.
При прорастании семян салата содержание т5с в суммарной ДНК также не остается на одном и том же уровне. Здесь наблюдается иная картина по сравнению с хлопчатником. По крайней мере, через 10 и 24 ч прорастания содержание Л в Ш проростков салата примерно на 10-15 % меньше, чем в ДНК семян (Башките Е.А. и др., 1978). В ДНК прорастающих семян пшеницы также наблюдаются два достоверных минимума степени метилирования ДНК - через 10 ч и 3 сут прорастания (Дрожденюк А. П. и др., 1975, 1976). Других значительных изменений в структуре ДНК ( GC -содержание, количество разных пиримидиновых блоков) не отмечено. Поэтому найденные при прорастании изменения в ДНК по содержанию ш?с , по-видимому, главным образом, отражают изменение собственно уровня метилирования генома. Кривые реассоциации ДНК семян и проростков пшеницы в целом очень сходны (Дрожденюк А. П. и др., 1976).
Установлено, что уменьшение уровня метилирования при прорастании касается всех изученных фракций ДНК, как повторяющихся, так и уникальных последовательностей (Дрожденюк А. П. и др., 1977; Сулимова Г. Е. и др., 1978), максимальным снижением степени метилирования ДНК при прорастании пшеницы характеризуется фракция, содержащая уникальные последовательности - Cot = 420 (Дрожденюк А. П. и др., 1977, Сулимова Г. Е. и др., 1978). В отличие от ДНК семян,в этой шракции ДНК проростков максимальным содержанием т^с обладают не монопиримидиновые, а длинные блоки, имеющие четыре и более пиримидиновых нуклеотидов подряд.
Такой необычный характер распределения пгс по изошштам не встречается ни в одной из фракций ДНК семян, и это означает, что при прорастании в геноме пшеницы начинают метилироваться иные нуклеотидные последовательности, не метелирующиеся в семенах (Сулимова Г. Е. и др., 1978). Причина выявленного изменения характера метилирования ДНК при прорастании еще не ясна. Это изменение, с одной стороны, может быть обусловлено появлением при прорастании в клетках новых ДНК-метилаз с иной специфичностью действия, а с другой - появлением новых доступных для метилирования и транскрипции сайтов ДНК в связи с индуцированными конФормационными изменениями хроматина.
Во всяком случае, у растений в процессе онтогенеза определенно происходит изменение уровня и характера метилирования генома. Предполагается, что такое специфическое изменение метилируемых последовательностей на разных стадиях онтогенеза может носить регуляторний характер и, возможно, связано с запрограммированным переключением работы генов (Ванюшин Б. Ф., 1968).
1.3. Возникновение дополнительных метилированных оснований в ДНК растений І.З.І. Механизм метилирования
В настоящее время можно считать установленным, что метилированные производные азотистых оснований образуются в нуклеиновых кислотах в результате реакции трансметилирования, и метилирование происходит на полинуклеотидном уровне. Основным донором метильных групп является метионин. Образование активированного метионина, т. е. s -аденозилметионина идет по схеме метионин + АТФ - S -аденозилметионин + фермент + пирофосфат + Р неорганический ( Cantoni , Durrel , 1957; Mudd » Cantoni , 1958).
Считается, что реакция метилирования ДНК протекает по уравнению
ДНК-метилаза ДНК + s -аденозилметионин метил-ДЖ + + s -аденозилгомоцистеин.
Содержание пгс в суммарной ДНК растении может быть довольно велико (до 10 мол. %). Поэтому сразу трудно поверить, что у растений ш^С возникает в цепях ДНК в результате энзима-тического метилирования такого большого количества цитозиновых остатков. Предполагалось, что наряду с этим пгс может возникать путем включения готовых т^с -содержащих нуклеотидов по матричному механизму при репликации ДНК. Чтобы проверить это предположение, специально синтезировали высокомеченные по 0Но- группе пгс , m С -рибозид и m с -дезоксирибозид (Хвойка Л. и др., 1974) и изучали возможность включения этих готовых метилированных предшественников в ДНК проростков пшеницы и других растений (Сулимова Г. Е. и др., 1978; Хвойка Л. и др., 1974). После инкубирования проростков с 3н]-метил- т^с радиоактивности в ДНК не обнаруживается вовсе, а после инкубирования с 3LJ-метил- m с -дезоксирибозидом радиоактивность обнаруживается в тимине, но не в т5с ДНК. Это означает, что свободное метили-рованное основание ( m С ) не используется клетками для синтеза ДНК, а его нуклеозиды включаются в ДНК только после дезами-нирования в виде обычных (неметилированных) предшественников (Сулимова Г. Е. и др., 1978; Хвойка Л. и др., 1974).
Выделение и изучение свойств растительных ДНК-метилаз существенно отстаетпо сравнению с исследованиями бактериальных ферментов.
В чистом виде ДНК-метилазы из растений до сих пор не были получены, и вопрос об их специфичности и возможной множественности остается открытым. Разнообразие модифицированных олиго- нуклеотидов в ДНК растений и животных,можно объяснить как существованием в клетках нескольких специфичных к нуклеотидной последовательности ДНК-метилаз, так и метилаз (метилазы), узна- ющих некий общий принцип в организации метилируемых последовательностей. ДНК-метилазы выделены и частично очищены из клеток Chlamidomonas reinhardi ( Sano, Sager , 1980; Sano , Grabowy, 1981), проростков гороха ( Morris , 1969) и зародышей пшеницы (Theiass , Polimann , 1980). Это ферменты, имеющие высокую молекулярную массу и не содержащие кофактороа ДНК-метилазы могут присоединять метильные группы к неметилированной ДНК, но их действие эффективнее на полупрометилированной ДНК. В отличие от животных метилаз, растительные не метилируют синтетические полимеры.
Известно, что уровень метилирования дочерних ДНК идентичен уровню метилирования комплементарных родительских ДНК (Башките Е. А. и др., 1980; Kiryanov et ai. ., 1980). Это означает, что при репликации модифицируются только дочерние цепи ДНК. Действительно, не обнаруживается включения метки из (метил-3Н) мети-онина в высокомолекулярную фракцию родительских цепей ДНК при ее репликации в культурах клеток табака и мыши, в то время как короткие новосинтезированные фрагменты хорошо метились по 5 -положению цитозина (Кирнос М. Д. и др., 1981). Таким образом, репликативное метилирование в культурах клеток животных и растений происходит по полуконсервативному механизму и в дочерних цепях ДНК, по-видимому, в основном воспроизводится как уровень, так и характер метилирования родительских цепей.
У высших растений метильные группы найдены в симметричной последовательности тощ , а также в GC , CG и СА динуклеоти-дах ( Deumling , 1981; Gruenbaum et al. ., 1981; Кирнос M. Д. и др., 1981).
Известно (Романов Г. А., Ванюшин Б. Ф., 1980), что большая часть т^с в ДНК животных локализована в динуклеотиде cpg .
Следовательно, в большинстве пиримидиновых последовательностей
ДНК животных он локализован на 3 -конце. В растениях лишь часть m С содержится в динуклеотиде GpG (Романов Г. А., Ванюшин
Б. Ф., 1980; Doscocil , Sorm , 1962), значительная его доля локализована в середине и на 5 -конце пиримидиновых последовательностей. Было показано (Кирнос М. Д. и др., 1981), что в ДНК животных более всего метилирована последовательность Ри_С-Ри, а У растений наряду с этой метилируются и другие последовательности ДНК. По-видимому, полуконсервативное репликативное метилирование ДНК способна осуществлять ДНК-метилаза, узнающая в комплементарных цепях симметрично расположенные цитозиновые остатки. Считается, что возможны два типа последовательностей с такой симметрией (Кирнос М. Д. и др., 1981).
1.3.2. Специфичность метилирования ДНК
Первые данные о характере распределения т^с в ДНК высших растений были получены при исследовании метилирования пиримидиновых дезоксирибонуклеотидов различной длины, выщепляющихся из ДНК после специфического гидролиза с дифениламином ( Burton , Peterson , I960). В ДНК всех изученных растений до 70 % т^с
СОСреДОТОЧеНО В MOHO- И ДИПИрШЛИДИНОВЫХ фрагментах ( Shapiro , Chargaff , I960; Ванюшин Б. Ф. и др., 1962; Spenser , Chargaff , 1963; Дохием M. и др., 1978; Сулимова Г. Е. и др., 1978). Содержание т5с в более длинных пиримидиновых последовательностях у разных видов варьирует- . (Дохием М. и др., 1978). В ДНК хлопчатника икс сконцентрирован в основном в трипиримидиновых блоках ( Guseinov, Yanyushin , 1975). Разнообразие модифицированных олигонуклеотидов в ДНК растений можно объяснить существованием в клетках нескольких специфичных к нуклеотидной после- довательности ДНК-метилаз, различающихся своей специфичностью:
5 - DpG - 3 5 - CpTpG - З
I , , и II , /
З - GpC - 5 3 - GpApC - 5 , где с - остаток m5c .
При реализации I типа симметричного метилирования «it будет сосредоточен только в динуклеотиде cpG , второго (II) - в пиримидиновых динуклеотидах Ср Т и Ср А. Если же в ДНК метилируются оба типа пиримидиновых сайтов, то ш5с может быть обнаружен'в динуклеотидах cpG , Ср Т и Ср А, причем его количество в двух последних парах должно быть одинаково (Кирнос М. Д. и др., 1981; Sneider , 1980; Doskocil , Sorm , 1962; Gruenbaum et al., ., 1981; Sneider, 1972; Simon et al ., I980)i
Существование двух типов симметрии метилируемых сайтов в ДНК растений обнаружено в ДНК ландыша (Кирнос М. Д. и др.,1981). Содержание метилированного дипиридина (СТ) р3 в ДНК ландыша составляет 6 мол. %, а ш^с в нем - почти 2 мол. %, Если принять равновероятной частоту встречаемости изомеров Ср Т и Т р С (а в ДНК зародышей пшеницы так дело и обстоит), то в каждом таком сайте должно содержаться по 1,5 мол. % остатков цитозина. Значит, метилированным окажется цитозин не только на 3 -конце пиримидинового динуклеотида, но и на 5 -конце. А это, вероятно, указывает на то, что у ландыша может модифицироваться последовательность как Ри - TpCpG , так и Ри - CpTG . Это должно привести к появлению ш5с в .динуклеотидах Ср' Т, Ср А и CpG в ДНК.
Чем более метилирована ДНК растений (пшеницы - 5,7 мол. %, ландыша - 8,4 мол. % т5с ), тем выше уровень метилирования (СТ) р_ в сравнении с монопиридиновой фракцией (Кирнос М. Д. и др., 1981). Особый интерес представляют последовательности с двумя метилированными цитозинами в одном пиримидиновом сайте. Так, дануклеотид -^ был ввдеЛен из ДНК шеншщ и рш (Shapiro , Chargaff , I960; Spencer , Chargaff , 1963). В ДНК ландыша дважды метилируется последовательность 5 -pCpCpCpGpGpGpGp -3 , встречающаяся с частотой І на 1560 оснований (Кирнос М. Д. и др., 1981).
1.4. Распределение 5-метилцитозина в геноме
I.4.I. Метилирование сателлитной ДНК
По-видимому, у растений, как и у животных, сателлитная ДНК более метилирована по сравнению с остальной ДНК. Так, например, сателлитная ДНК из растения Soilla содержит остатков ш5о больше, чём цитозина; пгС в этом сателлите находят в CG -, СТ- и СА-динуклеотидах ( Deumiing , 1981).
Значение высокого уровня метилирования сателлитной ДНК не совсем ясно. Полагают, что сателлитная ДНК облегчает рекомбинацию во время мейоза ( Yamamoto , Miklos , 1978; Cooper ,1964) t в соматических же клетках высокий уровень концентрации т*с в сателлитной ДНК обеспечивает инактивацию транскрипции ( Adama Burdon » 1982).
1.4.2. Содержание 5-метилцитозина в AT- и GC -обогащенных фракциях ДНК
При фракционировании суммарной растительной ДНК по составу, т. е. по ГЦ-содержанию, получаются обогащенные т5с фракции, в которых практически каждый второй остаток цитозина представлен его метилированным производным (Сулимова Г. Е. и др., 1970).
В АТ-фракциях ДЕК пшеницы, тимофеевки и ландыша количество т5с (2,4 мол. %) примерно в 2,5 раза меньше, чем в исходной ДНК (6 мол. %) и в 4 раза меньше, чем в GC -фракциях соответствующих ДНК (9 мол. %), В одной из фракций ДНК ландыша, зна-чительно обогащенной GC -парами оснований, содержится пгС 11,5 мол. %. В ней почти каждый второй остаток цитозина метилирован. Следовательно, т^с распределен в ДНК неравномерно и локализован преимущественно в gc -богатых последовательностях (Сулимова Г. Е. и др., 1970).
Аналогичные данные получены для сателлитной ДНК ( Gauntier et al.i 1977; Gruenbaum et al. ., 1981; Deumling , 1981).
1.4.3. Метилирование повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК
Геном высших растений, как известно, обладает выраженной кинетической сложностью (Дрожденюк А. П. и др., 1976, 1977). Степень метилирования в аналогичных фракциях ДНК из растений разных видов может сильно различаться (Дрожденюк А. П. и др., 1976, 1977). У растений пкс распределен по фракциям разной степени повторяемости в геноме более или менее равномерно (Сулимова Г. Е. и др., 1978; Дрожденюк А. П. и др., 1976). Тем не менее, у большинства изученных объектов все же наблюдается четко выраженная тенденция к увеличению степени метилирования цитозина при переходе от уникальных к высокоповторяющимся последовательностям (Дрожденюк А. П. и др., 1976). Эта асимметрия метилирования генома свойственна ДНК табака (Zimmerman , Goldberg , 1975) и особенно резко выражена у хлопчатника: в ДНК быстро реассоциирующей фракции содержится 5,8 мол. % ш5с , а в уникальных последовательностях - 0,5 мол. % п?с ( Guseinov et al » 1975). У растений других видов эти различия менее значительны (Дрожденюк А. П. и др., 1976, 1977). Несколько иной характер распределения т^с наблюдается в геноме пшеницы. Содержание т5С во фракции уникальных и часто повторяющихся последовательностей ДНК семян пшеницы практически одинаково; максимальным количеством т^с обладают малоповторяющиеся последовательности (Дрожденюк А. П. и др., 1976). Таким образом, mojkho заключить, что геном растений метилирован весьма специфично.
1.5. Метилирование и синтез ДНК
Сформировавшиеся органы характеризуются относительно постоянным уровнем метилирования ДНК, но во всех случаях при исследовании динамики содержания га5б в ДНК в онтогенезе уровень метилирования ДНК изменяется. Особенно заметны эти изменения в молодых, активно растущих органах и тканях - проростках семян, эмбриональных органах у животных (Дрожденюк А. П. и др., 1975, 1976; Зиньковская Г. Г. и др., 1978; Ванюшин Б. Ф., Рома-ненко Е. Б., 1979). В этих тканях идут интенсивное деление и дифференцировка клеток и синтез ДНК. Поэтому несомненный интерес представляет вопрос о связи метилирования с синтезом ДНК. В ряде работ установлено, что метшшрование несколько "отстает" от синтеза ДНК (Adams , 1971; Evans , Evans , bittman, 1973; Theiss , Pollman , 1978; Adams , 1973; Bugler et al ., 1978; Woodcock et al. > 1982). Иными словами, уровень метилирования новообразованной ДНК повышается при ее созревании.
В клетках мышиных фибробластов в культуре ( L -клетки) метилирование ДНК происходит, по крайней мере, в два этапа - на первом из них метилируются фрагменты Оказаки (до уровня ЮОх х щ^с /С + т^С (2,8-2,9), на втором происходит метилирование образующихся при лигировании фрагментов, линкерных участков ДНК (до уровня 6,0). В клетках культуры табака уровень метилирования фрагментов Оказаки примерно вдвое ниже, чем у .датированных интермедиатов репликации и peлoй" ДНК (Кирьянов Г. И. и др., 1982; Башките Е. А., 1980). В аоцитных опухолевых клетках Эрли-ха (Drahovsky , Wacker , 1975) энзиматическое метилирование вновь реплицированной ДНК имеет место после лигирования репли-кативных интермедиатов: 9s интермедиаты не содержали ш с » а 30 s интермедиаты содержали пгС в таком же количестве, как и зрелая клеточная ДНК. Таким образом, как у растений, так и у животных существует репликативное метилирование ДНК, которое осуществляется, по крайней мере, в два этапа: сначала метилируются фрагменты Оказаки, а после их лигирования происходит дополнительное метилирование ДНК.
В проведенных на несинхронных клеточных культурах исследо ваниях было установлено, что полное метилирование ДНК заверша ется при лигировании решшкативных интермедиатов. Однако иссле дование метилирования ДНК в клеточном цикле показало, что у жи вотных клеток метилирование генома завершается лишь в конце клеточного цикла (Adams et аЗ., 1974). Оно может осуществ ляться не только в пределах s-йазы, но также и при митозе , 1980 ( Bugler, Bertaux, "Valencia). J низшего эукариота - миксомицета P.poiycephalum окончательное дометилирование ДНК до уровня метилирования суммарной клеточной ДНК занимает не один, а несколько циклов репликации ( Evans et aL, 1973). Эти данные указывают на то, что, по крайней мере, какое-то время в клеточном цикле в ДНК присутствуют полупрометилированные сайты. Прямое тому подтверждение - асимметрия метилирования последовательности сателлитной ДНК растения S. sibirica ( Deumling » 1981):
5'-CCCA0}GCACC GAACCGCCCG CGGGTCGTCC GTGGG GGGTACGTGG CTTGGCGGGC GCCGAGCAGG CACCC-5» где M - 5-метилцитозин; " - цитозин, который может подвергаться модификации. І.5.І. Возникновение полупрометилированных сайтов
Фрагменты Оказаки после их синтеза более не метилируются, так что в них примерно половина сайтов метилирования ( CG ) остается немодифицированными (Кирьянов Г. И. и др., 1982). Такая полупрометилированная ДНК - природный субстрат для ДВК-метилаз. Действительно, такой субстрат - подходящий акцептор метильных групп in vitro (Adams , Burdon , I982;Turnbull , Adams , 1976; Bird , 1980; Lautenberger et al. ., 1978; Jones , Tuy-lor, 1981).
Инкубация ядер с s -аденозил 3H MeJ метионином ведет к введению радиоактивности в метилцитозин ( Geraci et al ., 1974; Adams » Hogarth » 1973). Значительное число метильных групп присоединяется к ДНК, которая реплицировалась до введения радиоактивности ( Adams , Hogarth , 1973), по-видимому, метильные группы присоединяются к полуметилированным сайтам, не заполненным СН -группами in vitro . Возникновение полуметилированных сайтов можно объяснить нуклеосомным строением хроматина, которое делает доступными некоторые районы ДНК для действия ДНК-метилазы или блокирует их. Adams et al., .(1977) не нашли различий между содержанием т5с в нуклеосомной коровой ( core ) ДНК и тотальной ДНК в клетках китайского хомячка. Влияние нуклеосомальной структуры генома на метилирование in vivo не известно, но в опытах in vitrcea мышиных ядрах с использованием мышиной ДНК-метилазы было показано, что метальные группы присоединяются преимущественно к ДНК, которая чувствительна к микрококковой нуклеазе (Adams » Burdon » 1982). Из этого опыта был сделан вывод, что в основном метилируется линкерная ДНК. Аналогичный результат получили Bloch , Cedar (1976) И Doenecke (1979), ИСПОЛЬ-зуя бактериальную ДНК-метилазу. , Tosi и Scarano (1973) показали значительное увеличение способности ДНК морского ежа присоединять метильные группы in vitro после обработки ядер трипсином. Эти результаты свидетельствуют о том, что нуклеосо-мальная организация хроматина ограничивает метилирование ДНК in vivo Seidman et al. (1979), Jackson , Cholkley (1981) показали, что гистоны НЗ и Н4 прочно связаны с ДНК при ее репликации. По-видимому, дочерние цепи ДНК перед тем, как они должны метилироваться, связываются с родительской цепью ДНК, имеющей нуклеосомную структуру. Этот процесс может привести к недометилированию закрытых участков ДНК, которые в следующей генерации будут метилироваться. Это объясняет присутствие неме-тилированных последовательностей в коровой ДНК.
СН -акцепторная способность ДНК в составе хроматина (моно-и динуклеосомы, моно- и динуклеомеры) в 15-30 раз меньше по сравнению со свободной суммарной ДНК печени крыс (Кирьянов Г.И. и др., 1981}
В хроматине доступность и узнавание ДЖ-метилазами сайтов метилирования уменьшены по сравнению со свободной ДНК не только в ДНК core -частицы, но и в межнуклеосомной ДНК. Доступность ДНК-метилазам изменяется при конформационных превращениях хроматина.
1.5.2. Влияние 5-азацитидина
После выращивания клеток с 5-азацитидином и 5-азадезокси-цитидином их ДНК обладает низким уровнем метилирования. По видимому, эти аналоги ингибируют ДНК-метилазную активность ( Jo -nes , Taylor , 1981; Adams et al. ., 1982). Adams (1982) показал, что замещение остатков цитозина на 5-азацитозин в одной цепи дуплекса ДНК в клетках тимомы достаточно для экспрессии определенных генов. Это указывает на то, что 5-азащтозин не только препятствует действию ДНК-метилазы, но, вероятно, влияет на генную экспрессию, препятствуя взаимодействию белков с ДНК ( Adams et al ., 1982). Введение в ДНК 5-азацитозина вызывает дифференциацию в культуре клеток животных ( Taylor , Jones , 1979; Jones , Taylor , 1980). Можно предположить, что именно полупрометилированные.сайты важны для экспрессии генов и клеточной дифференцировки. Известно, что целый ряд белков, например ДНК-метилаза, имеют высокое сродство к полупрометилированным сайтам (Adams , Burdon , 1982).
1.6. Возможная функциональная роль метилирования ДНК у эукариотов
Имеется ряд гипотез о функциональной роли метилирования нуклеиновых кислот у эукариотов. Энзиматическая модификация (метилирование) ДНК рассматривается как один из механизмов регуляции экспрессии генов и клеточной дифференцировки у про- и эукариотических организмов (Ванюшин, 1983). Хорошо известно, что метилирование у большинства изученных бактерий защищает ДНК от действия соответствующих рестриктаз. В бактериальных клетках метилирование ДНК по одинаковым остаткам связано также с регу- ляцией репарации и рекомбинации ДНК (Ванюшин Б. Ф., 1983).
Специфические эндонуклеазы типа рестриктаз обнаружены и у эукариот: хламидомонады ( sager , Kitchin , 1975), тетрахи-мены ( Sager , Kitchin , 1975), в семенниках зеленой обезьяны Cercopitecus aethiops ( Brown , Musich , Maio , 1978) И культуре клеток ВНК китайского ховлячка ( Cato, Burdon , 1978). В последнем случае удалось показать, что метилирование и гидролиз затрагивают одни и те же участки (последовательности) ДЕК. Для действия выделенной эндонуклеазы (рестриктазы) необходим s -аденозилметионин ( sam ). Предварительное метилирование разных ДНК с помощью метилазы клеток ВНК защищает их от действия этой рестриктазы ( catо , Burdon , 1978). В связи с обнаружением специфических к цитозин-гуанин-динуїслеотидам (GC -динуклеотидам) эндонуклеаз становятся понятными многие моменты структуры и функции эукариотических геномов. GC -содержащие последовательности могут являться потенциальными точками разрыва, своеобразными "слабыми местами" эукариотических хромосом. Ввиду этого наблюдаемая повышенная элиминация CG -динуклеоти-дов у эукариотов и их метилирование являются, вероятно, звеньями единого процесса, направленного на обеспечение максимальной стабильности эукариотического генома (Романов Г. А., Ванюшин Б. Ф., 1981).
Системы модификации-рестрикции ДНК у высших растений могут быть более разнообразными и эффективными, чем у животных; поэтому, вероятно, не случайно генетической матрицей почти всех вирусов растений является РНК, а не ДНК. При разных вирусных (Ванюшин Б. Ф. и др., 1971) и, тем более, грибных ( Guseinov , Vanyushin , 1975) инфекциях уровень метилирования ДНК растения-хозяина резко уменьшается. Это, по-видимому, делает ДНК более доступной для соответствующих рестриктаз, а значит, может быть одним из главных молекулярных механизмов воздействия фито-патогена.
Во многих случаях злокачественная трансформация клеток сочетается с повышением активности ДНК-метилаз ( Hass » 1973). Hoiliday (1979) выдвинул гипотезу, в которой связал изменение уровня метилирования ДНК с репаративным синтезом. Автор предположил, что поврежденная ДНК корректируется при репарации, при этом ДНК не всегда адекватно метилируется. Этим, возможно, и объясняется возникновение раковых опухолей.
Однако естественной функцией специфических эукариотических эндонуклеаз (рестриктаз) может быть не только защита от инородных ДНК, но и сугубо внутриклеточные функции, например разрушение "балластной" неактивной ДНК, репликация ДНК и другие процессы, для которых необходимы специфические разрывы ДНК. Это объясняет значение того факта, что амплифицированные рибосо-мальные гены, образующиеся в ооцитах некоторых животных (например, Xenopus ), совсем не метилированы, тогда как хромосомная ДНК отличается высоким содержанием щ^с ( Dawid , Brovm , Re -der , 1970). Отсутствие N m С в амплифицированной ДНК может быть следствием ее быстрого "каскадного" синтеза и крайне низкого уровня ДНК-метилазной активности в ооците ( Miller , Cartwright » 1978). При завершении развития ооцита, когда амп-лифицированные рибосомальные гены уже не нужны, активация рес-трицирующих эндонуклеаз может приводить к избирательному разрушению этих генов.
Такті образом, гипотеза о связи метилирования с рестрикцией в эукариотических клетках позволяет хорошо объяснить основные свойства ферментативной модификации ДНК. В ракшах этой гипотезы метилирование ДНК представляется фундаментальным процессом, обеспечивающим сохранность генома и определяющим частоту хромосомных аберраций. Это означает, что нарушение метилирования ДНК может изменять контрольные механизмы транскрипции и репликации генома и приводить к гибели или злокачественной трансформации клеток.
Однако ферментативная модификация, затрагивающая непосредственно генетическую матрицу ДНК и возможность наследования расположения метильных групп в ДНК дочерних клеток ( Riggs , 1975) привели к предположению о том, что метилирование ДНК непосредственно вовлекается в регуляцию действия генов (Ванюшин Б. ., 1968, 1972, I974;Ho.lliday , Pugh , 1975; Riggs , 1975; Scarano , Iaccarino , 1967). В пользу ЭТОГО допущения говорят следующие факты. Инициация транскрипции гена 72 К аденоврірусов ингибируется метилированием ДНК. ДНК онкогенного вируса герпеса неметилирована, а не экспрессируемая вирусная ДНК, находящаяся в трансформированных клеточных линиях суперметилирована ( Vardimon et al ., 1981). Эти же авторы показали существование обратной корреляции между степенью метилирования интегрированных аденовирусных генов и экспрессией этих генов в трансформированных клетках. В отличие от неметилированных, метилированные in vitro метилазой Нра, II фрагменты аденовирусных ДНК не транскрибируются в ооцитах ксенопуса. Для экспрессии генов важно, чтобы промоторная (лидерная) зона на 5 -конце аденовирусных генов была неметилированной. Метилирование in vitro лидерных област.ей генов ингибирует их транскрипцию.
Р. Херленд установил, что транскрипция встроенного в ДНК фага f Х174 тимидинкиназного гена не происходит, если его промоторная область метилирована. Транскрипция тимидинкиназного гена блокирована и в том случае, если промотор неметилирован, но в комплементарной ему цепи все цитозиновые остатки метилированы. Метилирование даже далеко отстоящих от гена участков ДНК может препятствовать его транскрипции. Предполагается, что метилирование ДНК может блокировать не только инициацию, но и элонгацию транскрипции. С другой стороны, в последнее время появляются данные о позитивной корреляции метилирования и экспрессии генов ( Adams, Burdon, 1982А
В последние года появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что по своей структуре нуклеосомы активного и неактивного в транскрипции хроматина различаются по степени модификации гистонов: существенно больше гистоны модифицированы в активном хроматине. Метилирование гистонов может быть одним из процессов, обеспечивающих структурную гетерогенность хроматина разных типов. Донором метильных групп при метилировании гистонов, как и при метилировании ДНК, является sam . В связи с этим, при недостатке sam метилирование гистонов может происходить тем больше, чем меньше sam расходуется на метилирование ДНК (соотношение содержания гистонов и ДНК примерно одинаково для хроматина разных типов). Действительно, при изучении хроматина из клеток асцита Кребса II установлено ( Burdon , 1971), что интенсивность метилирования ДНК и гистонов находится в обратной зависимости. В этой гипотезе процессу метилирования эукариотических ДНК отводят своеобразную сортировочную функцию. Она состоит в определении того или иного типа регуляции для кавдого конкретного локуса генома, что необходимо для обеспечения правильного контроля транскрипции этих локусов.
Замечено, что метилирование ДНК довольно интенсивно происходит по мере ее репликации и репарации (Башките Е. А. и др.,
1980; Adams , 1974; Burdon , Adams » 1969; Hotta » Hecht » 1971; Kappler , 1970; Kiryanov et ai ., 1980). Предполагается, что метилирование вновь синтезируемой ДНК может защищать ее от действия ядерных эндонуклеаз ( Kiryanmv et al ., 1980) и что по аналогии с бактериями рестрикции подвергаются только участки, в которых т5С отсутствует в обеих цепях ДНК.
Этим, вероятно, обеспечивается сохранность в клетке недо-метилированной ДНК (известно, что вновь синтезируемые ДНК животных и, в особенности, растений значительно недометилирова-ны) после первого цикла репликации. Однако при следующем цикле в условиях блока процесса метилирования возникнут участки без msC в обеих цепях ДНК, которые уже будут доступны для рестрикции. Такая ситуация может иметь место в клетках растений под влиянием ауксинов, блокирующих метилирование ДНК на уровне ли-гирования фрагментов Оказаки (Башките Е. А. и др., 1980). Тем самым репликативное метилирование (в том числе регулируемое фи-тогормонами) может быть эффективным контролем репликации ДНК, элиминации хромосом и дифференцировки. Не исключено, что метилирование необходимо также для правильного эффективного репара-тивного синтеза ДНК, как это наблюдается в клетках бактерий ( Glickman et al ., 1978).
Таким образом, представления о функциональной роли метилирования ДНК все еще не устоялись и иногда даже весьма противоречивы. В одних случаях получены доказательства того, что метилирование ДНК в качестве позитивного или негативного сигнала может контролировать транскрипцию, в других, - наоборот, приводятся сведения о том, что метилирование тех или иных генов не влияет на их экспрессию. Имеются указания на то, что метилирование ДНК может контролировать рекомбинацию и репарацию ДНК ( Taylor » 1978; Wagner » Meselson , 1976). Метилирование ДНК у бактерий защищает ее от рестрикции, но до сих пор не известно, обладает ли метилирование ДНК аналогичной функцией у животных и высших растений. Так или иначе, метилирование ДНК, в особенности у растений, небезразлично для структуры самой ДНК и важно для ее взаимодействия с различными, в том числе и регуляторними, белками.
По-видимому, метилирование ДНК в клетках эукариот полифункционально. Приведенные выше данные указывают на то, что эта энзиматическая модификация генома может рассматриваться как необходимый элемент общего контроля за экспрессией генов у эука-риотов.
К сожалению, специфичность метилирования ДНК, свойства ДНК-метилаз и функциональная роль метилирования ДНК у высших растений до сих пор еще слишком мало изучены. Не известны собственно механизм "суперметилирования" ДНК и его роль в жизни у растений в сравнении с таковой у животных или бактерий. Исследование метилирования ДНК у высших растений, на наш взгляд, имеет не только теоретическое, но и практическое значение.
II. Экспериментальная часть
2. Материалы и методы исследования
2.1. Обработка и посев семян пшеницы, отбор и пикировка проростков
Семена озимой пшеницы сорта "Мироновская-808" интенсивно промывали струей горячей водопроводной воды (45-50 С), 2-3 раза - дистиллированной водой и раскладывали на поверхность стекла (30x30 см), покрытого фильтровальной бумагой. Стекло помещали в кювету из винипласта (35x35x10 см) так, что края фильтровальной бумаги оказывались погруженными в дистиллированную воду. Сверху семена закрывали листом фильтровальной бумаги с прорезями, края листа также опускали в воду. Кювету плотно закрывали стеклом и помещали в термостат (30 С). Через 24 ч с момента замачивания одинаково проклюнувшиеся семена переносили в другую кювету fea расстоянии 0,5 см друг от друга) и продолжали инкубацию в термостате при той же температуре.
2.2. Введение радиоактивной метки в ДНК проростков
2.2.1. Срезанные проростки
Проростки срезали у самой зерновки, не захватывая конус нарастания, и помещали в 2-процентыую сахарозу. С помощью водоструйного насоса сахарозу отсасывали и проростки инкубировали в среде, содержащей радиоактивную метку: (2- С)-оротовую кислоту или (3Н)-тимидин (ЧССР, 50-100 мКи/мл). Использовали оро-товуга кислоту производства ЛМО "Изотоп" (СССР) с удельной активностью 43,4 мКи/ммоль или Института изотопов (Венгрия) с удельной активностью 50-100 мКи/ммоль. Раствор (2- С)-оротовой кислоты готовили следующим образом: содержимое ампулы переносили в колбу, добавляли эквимолярное количество NaOH (0,1 мл 2 моль Наон на 31 мг оротовой кислоты) и дистиллированную воду и растворяли при температуре 100 С. Время инкубации и концентрация радиоактивной метки зависели от условий экспершлента. По окончании инкубации проростіш промывали водой и фиксировали этанолом.
2.2.2. Целые проростіш
В кьэвету, где росли проростки, заливали раствор, содержащий радиоактивную метку, - 10 ёд./мл бензилпенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. По окончании инкубации проростки срезали и фиксировали этанолом.
2.3. Фиксация проростков и подготовка к выделению ДНК
Фиксированные этанолом проростки расчленяли на лист и колеоптиль и отдельно растирали их в ступке со стеклянными бусами или кварцевым песком до гомогенного мелкодисперсного состояния . ". Растертый материал количественно переносили в центрифужные пробирки и осаждали путем центрифугирования. Осадок промывали 3-4 раза ацетоном (каждый раз суспендируя в течение 10 мин), I раз - смесью спирт/эфир, I раз - эфиром и высушивали при комнатной температуре.
2.4. Выделение ДНК
2.4.1. Использование модифицированного метода Шмидта и Таннгаузера для определения уровня метилирования и состава новообразованной ДНК Сухой осадок растертого растительного материала суспенди- ровали в 2 мл 0,5 н. NaOH , содержащего 500 мкг/мл ДНК-носителя (ДНК из селезенки крупного рогатого скота), инкубировали4в течение 18 ч при температуре 37 С центрифугировали (5000 g , 10 мин) и отбирали I мл супернатанта. К щелочному лизату добавляли изоамиловыи спирт и кислотонераствориглыи материал осшкдали на холоду (О С) путем добавления I мл 2 моль НСЮ4 . Смесь перемешивали путем пропускания воздуха через капилляр, осадок отделяли посредством центрифугирования (5000 g , 2 мин, О С) и триады промывали 0,5 н. НСЮ4 » один раз кислым спиртом (0,5 н. НСЮ4 на 96 % этаноле). Кислоту удаляли 3-кратным промыванием осадка этанолом и обезвоживали осадок, несколько раз промывая его смесью спирт/эфир (1:1) и эфиром. Выделенную ДНК высушивали при температуре 95 С на протяжении 10-20 мин.
2.4.2. Выделение ДНК с проназной и РНКазной обработкой для фракционирования в градиенте плотности хлористого цезия
Растертый, обезжиренный и сухой растительный материал суспендировали с предварительно прогретой (60 С) в течение 20 мин проназой Е ( мегск» Г, I мг/мл) в среде с 0,1 моль трис- неї буфером рН 7,5; 0,5 % DDC-Na ,0,1 моль Na^-ЭДТА и инкубировали на протяжении 2 ч при температуре 37 С. Через 2 ч добавляли новую порцию среды с проназой и инкубировали суспензию при той же температуре в течение ночи. По окончании инкубации к смеси добавляли 1/4 объема 5 моль раствора Haci » суспендировали на протяжении 10 мин и осадок удаляли посредством центрифугирования, осадок промывали минимальным объемом I моль раствора ПаС1. После промывки фракции объединяли и депротеинизи-ровали один раз с четырьмя объемами смеси хлороформ/изоамиловый спирт (10:1). Нуклеиновые кислоты (НК) осаждали 2,5-объемами спирта на холоду, промывали 80 % спиртом и перерастворяли в 0,01 моль трис-нсі буфере рН 7,5 - 0,1 моль Иа*-ЭДГА. Раствор НК обрабатывали РНКазой A ( Sigma ) в течение 2 ч при температуре 37 С. РБКазу предварительно инкубировали при температуре 90 С на протяжении 15 мин в дистиллированной воде и уже затем добавляли к раствору НК. По окончании инкубации к смеси добавляли раствор проназы Е и DDC-їїа до 0,5 % концентрации. Смесь инкубировали и обрабатывали, как уже было описано. Осадок ДНК хранили в 80 % этаноле на холоду. Выделенную таким образом ДНК растворяли в I мл 0,01 моль трис-нсі буфера рН 7,5 и использовали для фракционирования и очистки в градиенте плотности Свез..
2.4.3. Выделение ДНК с проназной и щелочной обработкой для анализа уровня метилирования
Выделенную с проназой ДНК, как было описано выше, не обрабатывали РНКазой, а подвергали щелочной обработке по модифицированному методу Шмидта и Таннгаузера (см. раздел 2.4.1).
2.5. Фракционирование ДНК в градиенте плотности хлористого цезия
Для фракционирования выделенной с проназой и РНКазой ДНК в градиенте плотности csCl I мл раствора ДНК в 0,01 моль трис- НС1 буфере рН 7,5 и 0,01 моль ЭДТА смешивали с концентрированным раствором csci в OtOI мль трис-нсі буфере рН 7,5 до конечной плотности 1,700 г/ом3 и да фрашентщювали 5-крат-ным пропусканием раствора через медицинскую иглу В І0І20. Препараты ДНК центрифугировали в роторе У-65 на центрифуге К-32 (СССР) на протяжении 48 ч при 43 000 об/глин и температуре 20С.
Фракции по 0,2 мл отбирали со дна пробирки, к каядой добавляли по 0,4 мл Н2О и определяли оптическое поглощение раствора при /\ ~ 260 нм. Далее из каждой фракции отбирали аликвоту (обычно 30 мкл) в счетные флаконы, добавляли 0,5 мл 0,5 н. неї и ДНК гидролизовали при температуре 60 С в течение ночи. Затем к пробам добавляли по 10 мл диоксанового сцинтиллятора и измеряли их радиоактивность на жидкостно-сщштилляционном счетчике Mark-* III ( Nuclear Chicago , США). Эффективность счета (в полиэтиленовых флаконах) составляла около 80-90 % для С и 15-20 % для 3Н. Оставшиеся пробы разбавляли в 2-3 раза дистиллированной водой и измеряли их УФ-поглощение при А = 260 нм на регистрирующем спектрофотометре Hitachi-124 ' (Япония) или Сагу-15 ( Varian , США.). При определении плавучей плотности ДНК использовали реперные ДНКЩлгЪеиз ( Sigma ) f = 1,731 г/см3 и е. coli в (/ = 1,710 г/см3).
Для более точного (до четвертого знака после запятой) определения плавучей плотности измеряли коэффициент преломления каждой фракции на рефрактометре ИРФ-22. По точке пересечения кривой рефракции градиента и перпендикуляра, опущенного из максимальной фракции профиля ДНК на ось абсцисс ("фракции"), определяли коэффициент преломления раствора и рассчитывали соответствующую этому коэффициенту плавучую плотность по формуле
25.0 п 0= 10, 8601 nD - 13, 4974 / 25.0 ( Ifft . Voet »'Vinogradl96l).
2.6. Анализ состава и уровня метилирования ДНК 2.6.1. Суммарная немеченая ДНК
Выделение ДНК для анализа состава и уровня метилирования проводили по модифицированному методу Шмидта и Таннгаузера, как описано ранее. ДНК гидролиз овали до оснований 57 % НС10. (15 мкл/мг ДНК, I ч, 100 С), после гидролиза к содержимому ампулы добавляли равный объем дистиллированной воды, смесь перемешивали и кислоту нейтрализовали добавлением 6 моль КОН до рН 5,0-6,0. Уголь и выпавший осадок КСЮ^ отфильтровывали, гидролизат упаривали до объема 20-30 мкл и наносили на пластины с целлюлозой Filtrak (ГДР) при подсушивании теплым воздухом.
Подготовка целлюлозы и пластин. Пластины мыли в горячем растворе стирального порошка, тщательно ополаскивали дистиллированной водой. Сухие пластины раскладывали на горизонтальную, выверенную по уровню поверхность стола. Целлюлозу Filtrak (ГДР) для тонкослойной хроматографии суспендировали при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке в дистиллированной воде (I г порошка в 10 мл воды) в течение 30 мин. Суспензию разливали из расчета по 70 мл на каждую пластину (20x20 см). Пластины с нанесенной целлюлозой сушили на воздухе и потом складывали слой к слою и хранили при комнатной температуре.
Хроматография оснований. Основания разделяли с помощью одномерной или двумерной восходящей хроматографии в системах растворителей:
Щелочная: п -бутанол - Н^О - 25 % Ш4ОН (60:10:0,1).
Кислая: изопропанол - концентрированная неї - вода (170:45:35).
Предварительно п -бутанол высушивали селикагелем, прокаленным в течение 2 ч при температуре 150-200 С (0,5 кг/5 л\ и перегоняли бутанол (116,5-117,5 С).
Пластины с нанесенными на них гидролизатами складывали слой к слою так, чтобы на фронте (верхняя часть пластины) они
Природа, возникновение дополнительных оснований и содержание 5-метилцнтозина в ДНК растений
В ДНК разного происхождения наряду с обычными могут встречаться дополнительные метилированные основания. У бактерий в качестве таких минорных оснований в ДНК находят и -метиладе-нин ( гаА ) и 5-метилвдтозин - пгС (Ванюшин Б. Ф., 1968, 1974), а в ДНК высших растений уже давно выявлен m5C ( Wyatt9 1950, 1951; wardeli , Skoog , 1969; Ванюшин Б. Ф., 1965, 1972, 1968, 1974; Ванюшин Б. Ф., Белозерский А. Н., 1959). Для исследования специфичности метилирования генома особый интерес приобретают поиски в ДНК высших растений других оснований, и в частности m6A . После инкубирования проростков кукурузы, ячменя, редиса, гороха, огурца, хлопчатника и подсолнечника с 8- С-аденином заметная радиоактивность обнаруживается как в аде-нине, так и в га А , выделенных из ДНК этих проростков (Ванюшин Б. Ф. и др., 1971). Значит, ш А может присутствовать в ДНК как однодольных, так и двудольных растений. Позднее Бурьянов Я. И. и др. (1972) подтвердили заключение о присутствии тбА в ДНК у высших растений: из ДНК пыльцы ивы и березы они выделили и спектрофотометрически определили m А (около 0,22 мол. %). По содержанию Ш6А В ДНК высшие растения сопоставимы с бактериями и водорослями.
Исследование характера энзиматической модификации ДНК в ядре, хлоропластах и митохондриях у высших растений приобретает особый интерес и валено не только для понимания регуляции транскрипции генома в этих субклеточных структурах, но и для выяснения вопроса о происхождении и эволюции этих структур.
Состав и уровень метилирования новообразованной ДНК в развивающихся проростках пшеницы
Семена озимой пшеницы сорта "Мироновская-808" интенсивно промывали струей горячей водопроводной воды (45-50 С), 2-3 раза - дистиллированной водой и раскладывали на поверхность стекла (30x30 см), покрытого фильтровальной бумагой. Стекло помещали в кювету из винипласта (35x35x10 см) так, что края фильтровальной бумаги оказывались погруженными в дистиллированную воду. Сверху семена закрывали листом фильтровальной бумаги с прорезями, края листа также опускали в воду. Кювету плотно закрывали стеклом и помещали в термостат (30 С). Через 24 ч с момента замачивания одинаково проклюнувшиеся семена переносили в другую кювету fea расстоянии 0,5 см друг от друга) и продолжали инкубацию в термостате при той же температуре.
Обработка и посев семян пшеницы, отбор и пикировка проростков
Мы исследовали метилирование новообразованной ДНК в органах проростка в разные моменты их развития с помощью жшульсных меток радиоактивными предшественниками синтеза ДНК. Такой подход позволяет определить метилирование новообразованной ДНК за конкретный промежуток времени в определенных экспериментальных условиях.. Уровень метилирования суммарной ДНК проростков изменяется в течение нескольких суток с момента прорастания (Сули-мова Г. Е. и др., 1978; Дрожденюк А. П. и др., 1975). При этом состав ДНК практически не изменяется. По-видимому, это, скорее всего, указывает на изменение собственно уровня метилирования ДНК, а не ее молекулярной популяции. В то же время, известно, что при исследовании уровня метилирования ДНК с помощью импульсных меток как уровень метилирования, так и состав новообразованной ДНК могут сильно отличаться от этих показателей для суммарной немеченой ДНК (Ванюшин Б. Ф. и др., 1972; Башките Е. А. и др., 1979). Значит, в каждый конкретный момент в растении синтезируются разные фракции в различной степени метилированной ДНК.
Мы попробовали определить, насколько стабильны синтез и метилирование ДНК в онтогенезе проростков пшеницы. Срезанные проростки разного возраста метили; в течение 10 ч (2- С)-орото-вой кислотой, определяли уровень метилирования и состав новообразованной ДНК (табл. I).
