Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 4
1.1. Метилируемые последовательности эукариотических ДНК 4
1.2. Структура и функции цитозин(С5)-ДНК-метилтрансфераз 9
1.2.1. Первичная структура цитозин(С5)-ДНК-метилтрансфераз 9
1.2.2. Эукариотические ДНК-метилазы 11
1.2.2.1. ДНК-метилазы растений 12
1.2.3. Регуляция экспрессии ДНК-метилазных генов 20
1.3. Функциональная роль метилирования ДНК растений 22
1.3.1. Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина 22
1.3.2. Тотальное метилирование цитозина в ДНК растений и РНК-интерференция 25
1.3.3. Роль метилирования ДНК в развитии растений 30
1.3.4. Метилирование ДНК и геномный импринтинг 32
1.3.5. Влияние неблагоприятных условий окружающей среды на метилирование ДНК растений 35
II. Материалы и методы исследования 39
2.1. Материалы и оборудование 39
2.1.1. О борудование 39
2.1.2. Реактивы, среды и ферменты 39
2.1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды 43
2.1.4. Растительный материал 43
2.2. Методы 45
III. Результаты и их обсуждение 55
3.1. Влияние интеграции гена ДНК-метилтрансферазы ZJCORII на фенотип и картину метилирования CpNpG-последовательностей генома трансгенных клеток высших эукариот 55
3.1.1. Получение рекомбинантных плазмид с модифицированным геном ДНК-метилтрансферазы ЕсоШІ для экспрессии в клетках высших эукариот 56
3.1.2. Получение трансгенных растений Nicotiana tabacum, содержащих модифицированный ген NLS-MiiCoRII 61
3.1.3. Анализ метилирования ДНК трансформированных клеток человека НК293, экспрессирующих модифицированный ген NLS-M'^coRII-GFP 73
3.2. Исследование метилирования ДНК растений Mesembryanthemum crystallinum в стрессовых условиях 80
IV. Выводы 89
Список литературы 90
- Первичная структура цитозин(С5)-ДНК-метилтрансфераз
- Тотальное метилирование цитозина в ДНК растений и РНК-интерференция
- Получение рекомбинантных плазмид с модифицированным геном ДНК-метилтрансферазы ЕсоШІ для экспрессии в клетках высших эукариот
- Исследование метилирования ДНК растений Mesembryanthemum crystallinum в стрессовых условиях
Введение к работе
Изучение явления энзиматического метилирования ДНК эукариот продолжается более пятидесяти лет. Однако мы далеки пока от всестороннего понимания функциональной роли этой модификации генома. В исследовании энзиматического метилирования ДНК можно выделить два основных этапа.
На первом, самом раннем, этапе с помощью классических биохимических методов была установлена видовая, клеточная, тканевая [Ванюшин, Белозерский, 1959; Маринова и др., 1969; Vanyushin et al., 1970; Vanyushin et al., 1973] и внутригеномная специфичность [Сулимова и др. 1970; Romanov, Vanyushin, 1981] метилирования ДНК животных и растений. На этом этапе было также обнаружено связанное с онтогенезом изменение содержания 5-метилцитозина в эукариотическом геноме [Бердышев и др., 1967; Дрожденюк и др., 1976] и изменение метилирования ДНК при канцерогенезе и при воздействии на организм различных физиологических факторов [Vanyushin et al., 1973; Бурцева и др., 1977; Romanov, Vanyushin, 1981]. Следует отметить значительный приоритетный вклад отечественных ученых школы А.Н. Белозерского в структурно-функциональные исследования метилирования эукариотических геномов, указавших на участие метилирования ДНК в регуляции генетической экспрессии. В этот же период был обнаружен CpG-тип метилирования ДНК животных и растений [Sinsheimer, 1954; Sinsheimer, 1955; Shapiro, Chargaff, 1960; Doskocil, Sorm, 1962; Grippo et al., 1968] и CpNpG-тип (N- любой нуклеозид) метилирования ДНК высших растений [Кирнос и др., 1981; Gruenbaum et al., 1981].
Второй этап исследований энзиматического метилирования ДНК эукариот, продолжающийся и в настоящее время, связан с революционными достижениями современной биологии в области молекулярной генетики, секвенирования метилированной ДНК, а также с выделением и исследованием самих ДНК-метилтрансфераз (ДНК-метилаз). За это время получена обширная информация о характере распределения метилированных
2 последовательностей CpG и неметилированных CpG-островков в геноме позвоночных [Bird, 1986; Gardiner-Garden, Frommer, 1987; Antequera, Bird, 1993] и растений [Antequera, Bird, 1988], а также получены первые данные о существовании у млекопитающих CpNpG-типа метилирования ДНК [Clark et al., 1995] и о существовании в клетках грибов [Selker, Stevens, 1985], животных [Toth et al., 1990] и растений [Meyer et al., 1994] NpC-несимметричного типа метилирования ДНК.
Если у прокариот энзиматическое метилирование ДНК участвует в системах рестрикции-модификации, обеспечивая защиту против чужеродных ДНК, то в эукариотической клетке оно выполняет многие другие функции. В настоящее время установлено участие энзиматического метилирования ДНК эукариотических организмов в регуляции транскрипции генов, клеточной дифференцировке и эмбриональном развитии [Bestor, 1990], эпигенетическом контроле геномного импринтинга [Sapienza et al., 1987] и инактивации мобильных генетических элементов [Bestor, 1990; Yoder et al., 1997]. Эти функции установлены как у млекопитающих, так и у высших растений. Нарушение нормальной картины метилирования ДНК сопровождает канцерогенез и различные генетические заболевания человека. В растениях снижение уровня метилирования ДНК может нарушать нормальное развитие растений и вызывать появление новых морфологических фенотипов [Finnegan et al., 1998], а гиперметилирование ДНК может приводить к "замолканию" чужеродных генов в трансгенных растениях. Кроме того, изменение уровня метилирования растительной ДНК имеет место при воздействии неблагоприятных условий окружающей среды [Schmittetal., 1997].
Регуляция функционирования генов может быть связана также с недавно открытым новым типом энзиматической модификации адениновых остатков в ДНК. Впервые Л^-адениновая ДНК-метилаза была выделена из колеоптилей пшеницы в лаборатории Б.Ф. Ванюшина [Fedoreyeva, Vanyushin, 2002]. Эта новая тематика энзиматической модификации ДНК находится только в начале своей разработки [Ванюшин, 2005].
Существенные успехи в исследовании функций метилирования ДНК получены после открытия белков, связывающихся с метилированными CpG-последовательностями ДНК и мобилизующими в эти участки гистоновые деацетилазы, формирующие транскрипционно неактивную структуру хроматина. В этом смысле "метилирование встречает ацетилирование" [Bestor, 1998], то есть метилирование ДНК и деацетилирование гистонов могут быть прочно сопряжены с процессом формирования нетранскрибируемой структуры хроматина.
В структурно-функциональном исследовании энзиматического метилирования эукариотических ДНК существует значительный пробел, связанный с изучением только CpG-типа этой модификации. Только в настоящее время выясняется связь других сайт-специфических типов метилирования эукариотических ДНК с разными генетическими функциями. Растущее внимание к картине метилирования целого эукариотического генома, на фоне которого развиваются нормальные и нарушенные процессы жизнедеятельности клетки, ставит вопрос о понимании функционального значения этих типов метилирования ДНК и роли индивидуальных ДНК-метилаз в специфических генетических процессах.
Целью настоящей работы являлось изучение энзиматического метилирования ДНК растений при различных физиологических состояниях. Для экспрессии ДНК-метилтрансферазы M-EcoRll в клетках эукариот стояла задача получения модифицированных форм этого гена, кодирующих сигнал ядерной локализации. В число основных экспериментальных задач входили: исследование эффекта переноса гена бактериальной ДНК-метилтрансферазы ЕсоШІ в геном растений Nicotiana tabacum; анализ уровня сайт-специфического метилирования ядерной ДНК и исследование картины метилирования некоторых генов растений Mesembryanthemum crystallinum, растущих в экстремальных условиях засоления.
Первичная структура цитозин(С5)-ДНК-метилтрансфераз
CpG-островки тканеспецифических генов, например гена сс-глобина человека, поддерживаются неметилированными во всех тканях, даже если они не транскрибируются [Bird et al., 1987]. В то же время обнаружено, что в культуре многих типов клеток мыши и человека около половины всех CpG-островков значительно метилированы. Это метилирование связано с тканеспецифическими генами (но не с генами домашнего хозяйства) и с потерей клетками своих специфических функциональных свойств в культуре [Antequera et al., 1990]. Таким образом, существует четкая корреляция между метилированием CpG-островков и подавлением транскрипции соответствующих генов.
CpG-островки отличаются доступностью для нуклеаз и локализацией в областях "открытого хроматина", состав которого характеризуется гиперацетилированными гистонами и недостатком гистона HI [Tazi et al., 1990]. В то же время, метилирование CpG-островков приводит к образованию компактной и нечувствительной к нуклеазам структуры хроматина [Antequera et al., 1989]. В CpG-островках часто встречаются сайты CCGG, выявляемые с помощью чувствительной к метилированию рестрикционной эндонуклеазы Hpall в виде очень мелких Я/гаІІ-фрагментов (Hpall tiny fragments - HTF). На фракцию HTF приходится около 1% генома позвоночных [Cooper et al., 1983].
Обычно CpG-островки расположены в 5 -областях генов домашнего хозяйства, занимая только часть транскрибируемого участка гена. В случае коротких генов весь ген может входить в состав CpG-островка, как, например ген а-глобина человека [Bird et al., 1987]. CpG-островки могут отсутствовать в 5 -области, но располагаться в транскрибируемой области некоторых тканеспецифических генов и примыкать к их З -концу. Некоторые гены позвоночных, такие как гены гормона роста, инсулина, фибриногена и других могут быть лишены CpG-островков. [Bird, 1986].
CpG-островки генов высших растений проявляют структурно-функциональное сходство с CpG-островками генов позвоночных. Так, геномы растений кукурузы, пшеницы, риса и табака содержат фракцию HTF. У кукурузы эта фракция составляет 2,5% от ядерного генома и содержит фрагменты от 25 до 250 п.н. со средним размером 120 п.н. [Antequera et al., 1988]. Интересно отметить, что в геноме кукурузы неметилированные последовательности CpNpG менее кластеризованы. Кластеризованные неметилированные динуклеотиды CpG в антоциановом гене кукурузы al полностью соответствуют свойствам типичных CpG-островков позвоночных. Этот CpG-кластеризованный участок имеет размеры около 2 т.п.н., он содержит полную транскрибируемую область и 5 -нетранскрибируемую последовательность. CpG-островки найдены также в кукурузных генах алкагольдегидрогеназы 1 (Adhl), сахарозосинтазы (Shi), локусе waxy и в соевом гене лектина. В то же время у растений, как и у позвоночных, имеются гены без CpG-островков, например зеиновый ген у кукурузы [Antequera et al., 1988].
Предполагается, что CpG-островки появились независимо у позвоночных и растений в процессе эволюции и эта особенность коррелирует с большим размером их генома, значительная часть которого никогда не транскрибируется [Antequera et al., 1988]. В этой связи можно отметить, что CpG-островки очень редко встречаются в геноме холоднокровных позвоночных [Aissani et al., 1991], а их количество в геноме мыши на 16 % ниже, чем в геноме человека [Antequera et al., 1993].
В настоящее время непонятен механизм поддержания CpG-островков в неметилированном состоянии. Во-первых, это может быть структурное свойство самих CpG-островков, поскольку обнаружено, что CpG-обогащенные последовательности плохо метилируются in vitro [Carotti et al., 1989]. Во-вторых, в клетке могут существовать специфические для CpG-островков ДНК-деметилирующие ферменты [Frank et al., 1994; Choi et al., 1993]. В-третьих, CpG-островки могут защищать от метилирования связывающиеся с ними специфические белки, например Spl [MacLeod et al., 1994]. Предполагается, что CpG-островки помогают ядерным факторам клеток растений и позвоночных распознавать доступные для транскрипции районы хромосом [Bird et al., 1986; Antequera et al., 1988].
Однако распределение m5C в эукариотическом геноме не ограничено последовательностями CpG. Уже первые результаты анализа метилирования эукариотических ДНК указывали на присутствие в ДНК животных и растений m С в последовательностях, отличных от CpG [Salomon, Кауе, 1970]. В ДНК растений т5С был обнаружен наряду с динуклеотидом m5CpG в динуклеотиде m5Cpm5C [Shapiro, Chargaff, 1960; Doskocil, Sorm, 1962]. В дальнейшем, с помощью указанных методов, а также метода рестрикционного анализа, с применением чувствительных и нечувствительных к метилированию ДНК рестрикционных эндонуклеаз, у растений был выявлен новый тип метилируемой последовательности m5CpNpG [Кирнос и др., 1981; Gruenbaum et al., 1981]. С помощью метода анализа ближайших соседей установлено, что в ДНК селезенки человека только 45,5% всего метилированного цитозина содержится в динуклеотиде CpG, в то время как в последовательностях СрА, СрТ и СрС в сумме его количество составляет 54,5% [Woodcock et al., 1987]. Обнаружение метилированного цитозина в ДНК эукариот в последовательностях т5СрТ, m5CpA, m5CpC и m5Cpm5C могло указывать как на CpNpG-симметричный, так и на несимметричный NpC-тип модификации этих ДНК.
Дальнейшее исследование различных аспектов функциональной роли метилирования ДНК у эукариот шло почти исключительно с применением рестрикционного анализа ДНК с известной нуклеотидной последовательностью. Так, большинство работ по анализу динамики метилирования индивидуальных эукариотических генов выполнено с использованием пары рестрикционных эндонуклеаз Нра\\ и Mspl. соответственно чувствительной и нечувствительной к метилированию внутреннего цитозина в последовательности CCGG. При таком методическом подходе исследовался только CpG-тип метилирования ДНК, "за бортом" анализа оставалась подавляющая часть самих последовательностей CpG, а также другие возможные типы метилирования ДНК. На это указывали и результаты анализа ДНК с помощью рестриктазы Mspl, свидетельствующие о метилировании внешнего цитозина в последовательностях CCGG в ДНК животных [Sneider, 1980]. Такая специфичность метилирования последовательности CCGG могла соответствовать CpNpG-симметричному или NpC-несимметричному типу метилирования ДНК.
Тотальное метилирование цитозина в ДНК растений и РНК-интерференция
Снижение уровня метилирования также изменяло время цветения в мутантных растениях, имеющих антисмысловые гены МЕТІ и ddml, этот эффект зависел от условий роста и от реакции родительских растений на яровизацию [Kakutani, 1998; Kakutani et al., 1995; Ronemus et al., 1996]. Описаны и другие изменения в развитии: некоторые растения с антисмысловыми генами ДНК-метилаз формировали надземные розетки и давали больше стеблевых листьев и вторичных соцветий на первичных стеблях [Ronemus et al., 1996]. Было обнаружено, что у двудомного растения Melandrium album половая детерминация гетерогаметных мужских соцветий основана на присутствии Y хромосомы, что имеет значение как для выражения мужских, так и для подавления женских функций. Обработка мужских растений 5-azaC приводила к гермафродитизму примерно в 21% случаев, но не действовала на образование женских цветков [Janousek et al., 1996]. Было высказано предположение, что угнетение женских частей у мужских цветков связано с метилированием специфических последовательностей в Y хромосоме или в аутосомах.
Экспрессия некоторых генов высших эукариотических организмов зависит от их родительского происхождения. Это явление получило название геномного импринтинга. Геномным импринтингом называют процесс, при котором экспрессия гена зависит от того, на каком аллеле, отцовском или материнском, он расположен. Как правило, различные аллели импринтных генов различаются по таким признакам, как метилирование ДНК, структура хроматина (с различной модификацией гистонов и гиперчувствительностыо к ДНКазам), время репликации [Gribnau et al., 2003]. Важные свойства импринтинга — наследуемость и обратимость при наследовании. Как правило, импринтные гены расположены в геноме в виде кластеров. Вероятно, экспрессия ряда генов, существующих внутри одного кластера, может находиться в зависимости от какого-либо общего регуляторного элемента. Кроме того, подверженные импринтингу гены обычно функционируют на ранних стадиях развития.
Импринтинг в растениях отличается от геномного импринтинга животных. У растений импринтинг обнаруживается только в эндосперме семян, и не переносится в следующие поколения [Haig, Westoby, 1991; Kermicle, Alleman, 1990]. Было показано, что растительный эмбрион менее чувствителен к эффектам импринтинга, чем эндосперм, для развития которого геномный импринтинг жизненно важен. [Gutierrez-Marcos, Dickinson, 2002]. Эндосперм многих покрытосеменных триплоиден, и имеет две копии материнского и одну копию отцовского генома [Lin, 1984], которые функционально не равнозначны в развитии растительного эндосперма [Haig, Westoby, 1991; Kermicle, Alleman, 1990]. Эта ситуация аналогична геномному импринтингу млекопитающих, где два родительских генома различны. В основном, экспрессия отцовских генов в растениях обеспечивает нормальное развитие эндосперма, тогда как экспрессия материнских генов ингибирует его. Дисбаланс между экспрессией материнских и отцовских генов приводит к нарушению развития эндосперма и, в некоторых случаях, к невызреванию семян [Vinkenoog, Scot, 2002]. Имеются данные, что повышенная экспрессия материнских генов в растениях A. thaliana приводит к изменению фенотипа (карликовость) и подавлению митоза в эндосперме, тогда как сверхэкспрессия отцовских генов приводит к обратному фенотипу (большой рост и сверхпродуктивный эндосперм) [Adams et al., 2000].
Было показано, что для нормального развития эндосперма плечи некоторых хромосом должны быть получены от отцовского организма [Haig, Westoby, 1991; Kermicle, Alleman, 1990]. Эти области хромосом могут нести импринтные гены, необходимые для развития эндосперма. Были описаны различия в картине метилирования импринтных растительных генов г и dzrl, [Chaudhuri, Messing, 1994; Kermicle, 1978], которые коррелировали с различиями в экспрессии материнских и отцовских копий аллелей в г локусе [Alleman, 1998]. Кроме того, на примере инбредных полиплоидных гибридов Тритикале (пшеницахрожь) было показано, что воздействие деметилирующего агента 5-azaC способно проявить у них генетические вариации [Heslop-Harrison, 1990]. Показано, что экспрессия FWA в эндосперме арабидопсиса дикого типа осуществляется с материнских аллелей. В отличие от животных, импринтинг FWA устанавливается не аллель-специфичным de novo метилированием, а активацией материнского гаметофит-специфичного гена, который зависит от гена ДНК-гликозилазы DEMETER, выполняющей функцию деметилирования ДНК [Kinoshita et al., 2004]. Метилирование ДНК является ключевым эпигенетическим фактором, контролирующим экспрессию импринтных генов у животных, где метилирование стирается и восстанавливается в каждом поколении [Surani, 2001]. Напротив, эпигенетическое состояние экспрессии генов у высших растений часто наследуется без изменений в течение многих поколений [Kinoshita et al., 2004]. В то же время нельзя полностью исключить влияния механизма импринтинга на метилирование ДНК и структуру хроматина родительских аллелей в растениях [Gehring et al., 2004]. С другой стороны импринтинг растений может быть связан и с такими эпигенетическими феноменами, такими как парамутации и "замолкание" трансгенов. Следует отметить, что геномный импринтинг высших растений оказывает существенное влияние на скрытие генетических вариаций у гибридных растений в течение многих поколений. Таким образом, как и у млекопитающих [Li et al, 1993], так и у растений метилирование может играть важную роль в геномном импринтинге.
Получение рекомбинантных плазмид с модифицированным геном ДНК-метилтрансферазы ЕсоШІ для экспрессии в клетках высших эукариот
Выделение и очистка растительной ДНК: геномную ДНК выделяли по методу [Draper et al., 1988]. 5 г свежего каллуса, молодых листьев или другой ткани быстро замораживали в жидком азоте. Замороженную ткань помещали в ступку диаметром 12-15 см, осторожно разрушали пестиком, добавляли 0.5 г окиси алюминия и растирали в мелкий порошок, затем добавляли 40 мл буфера для протеиназы (ЮОмМ трис-НС1, рН 8,5; ЮОмМ NaCl; 50мМ EDTA, рН 8,0; 2% SDS), протеиназу К до концентрации 0,1 мг/мл и тщательно перемешивали. Смесь переносили в две полиалломерные пробирки объемом 38 мл с завинчивающимися крышками и инкубировали при 37С в течение 1—2 ч. В каждую пробирку добавляли по 8 мл фенола и по 8 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и мягко перемешивали, переворачивая пробирки. Для разделения фаз препарат центрифугировали 10 мин (5000 об/мин, 4С). Водную фазу переносили в новые центрифужные пробирки и повторяли экстракцию смесью фенол/хлороформ-изоамиловый спирт. Используя пипетку с широким концом, переносили водную фазу в новые центрифужные пробирки, добавляли 0,6 объема изопропанола, перемешивали и оставляли на ночь при -20С для выпадения нуклеиновых кислот в осадок. Осадок нуклеиновых кислот собирали центрифугированием (4С, 8000 об/мин, 10 мин), промывали дважды 10 мл 70%-ного этанола, высушивали в эксикаторе и затем растворяли в 5 мл ТЕ-буфера. Добавляли раствор РНКазы А до концентрации 10мкг/мл и инкубировали при 37С 1 ч. Затем добавляли 2,5 мл фенола, 2,5 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт и осторожно перемешивали. Разделяли фазы центрифугированием и повторяли экстракцию, используя 5 мл хлороформенной смеси. К водной фазе добавляли 0,1 объема З М ацетата натрия и 2,5 объема этанола и ДНК осаждали в течение ночи при -20С. Осадок собирали центрифугированием и заново растворяли в 2,4 мл Ш CsCl/EtBr (0,2мг/мл бромистого этидия) при 56С на водяной бане. Раствор переносили в центрифужную пробирку, добавляли 2,9 мл 7М CsCl/EtBr (0,2 мг/мл бромистого этидия) и мягко перемешивали содержимое. Пробирки центрифугировали в роторе Beckman VTi65 при 40000 об/мин в течение 16ч. Полосу ДНК визуализировали, используя источник УФ-излучения с длиной волны 310 нм, и отбирали материал при помощи шприца на 1 мл, прокалывая пробирку сбоку. Бромистый этидий удаляли путем пятикратной экстракции изоамиловым спиртом. CsCl удаляли путем диализа против 2 л буфера ТЕ при 4С. Диализ проводили в течение 24 ч на магнитной мешалке, меняя буфер не менее 3-х раз. К раствору добавляли 1/10 объема З М ацетата натрия и два объема охлажденного этанола. ДНК осаждали в течение ночи при -20С. Осадок ДНК собирали центрифугированием, высушивали в вакууме и растворяли в ТЕ-буфере. Препарат ДНК хранили при -20С.
Выделение геномной ДНК культивируемых клеток эпителиального слоя почек человека НК293: клетки собирали центрифугированием при 4С в течение 5 мин при 500 об/мин. Осадок промывали фосфатным буфером (PBS) и снова осаждали центрифугированием. Клетки суспендировали в лизирующим буфере (100 тМ NaCl, 10 тМ Tris-Cl, 25 тМ EDTA, 0,5% SDS, 0,1 мг/мл протеиназы К). Лизис проводили при 50С в течение 12-18 часов. ДНК отчищали смесью фенол/хлороформ и осаждали при -20С в течение 30-60 мин с последующим центрифугированием при 10000 об/мин в течение 12 мин. Осадок ДНК промывали в 70 % этаноле и растворяли в 200-500 мкл ТЕ-буфера.
Выделение и очистка растительной РНК: 5 г свежего каллуса, молодых листьев или другой ткани быстро замораживали в жидком азоте. Замороженную ткань помещали в стерильную ступку диаметром 12-15 см, осторожно разрушали пестиком, добавляли 0,5 г окиси алюминия и растирали в мелкий порошок, затем добавляли 40 мл буфера для протеиназы (ЮОмМ трис-HCl, рН 8,5; ЮОмМ NaCl; 50мМ EDTA, рН 8,0; 2% SDS), протеиназу К до концентрации 0,1 мг/мл и тщательно перемешивали. Смесь переносили в две стерильные полиалломерные пробирки объемом 38 мл с завинчивающимися крышками и инкубировали при 37 С в течение 1—2 ч. В каждую пробирку добавляли по 8 мл фенола и по 8 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и мягко перемешивали, переворачивая пробирки. Для разделения фаз препарат центрифугировали 10 мин (5000 об/мин, 4С). Водную фазу переносили в новые стерильные центрифужные пробирки и повторяли экстракцию смесью фенол/хлороформ-изоамиловый спирт. Используя пипетку с широким концом, переносили водную фазу в новые центрифужные пробирки, добавляли 0,6 объема изопропанола, перемешивали и оставляли на ночь при -20С для выпадения нуклеиновых кислот в осадок. Осадок нуклеиновых кислот собирали центрифугированием (4 С, 8000 об/мин, 10 мин), промывали дважды 10 мл 70%-ного этанола, высушивали в эксикаторе и затем растворяли в 5 мл ТЕ-буфера. К растворенному осадку добавляли 2,5 мл стерильного 8 М хлористого лития и оставляли во льду на 30 мин. РНК осаждали центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 мин при 4С. Осадок дважды промывали 70%-ным этанолом, высушивали в эксикаторе и затем растворяли в стерильном ТЕ-буфере.
Агробактериалъная трансформация табака: агробактериальную трансформацию осуществляли методом инокуляции эксплантов агробактериями. В качестве эксплантов использовали листовые диски двухмесячных растений. Для этого ночную культуру A. tumefaciens, выращенную в жидкой среде LB на качалке (150 об/мин) при 26С, центрифугировали, суспендировали в жидкой среде MS, содержащей 12,5 мМ фосфорнокислого натрия, рН 5,5, до плотности Абоо=0,05. Экспланты помещали в бактериальную суспензию (108 кл/мл) на 30-60 с, подсушивали на стерильной фильтровальной бумаге и размещали на безгормональной агаризованной среде MS. Через 2 сут экспланты отмывали от агробактерий средой MS и переносили на селективную среду для регенерации побегов, содержащую 0,3 мг/л 6-БАП и 0,2 мг/л ГК. Кроме того в среду добавляли селективные препараты канамицин -20 мг/л, а также цефотаксим 250 мг/л. Использование цефотаксима необходимо для освобождения эксплантов от агробактерий. Через 2-3 недели на эксплантах наблюдали регенерацию побегов. С периодичностью 1-2 раза в месяц экспланты с образовавшимися побегами переносили на свежую селективную среду для корнеобразования, содержащую 3 мг/л НУК и 25 мг/л Km. Укорененные растения длиной 5-6 см пересаживали в стерилизованную почвенную смесь - торф : песок (1:1 по объему) и выращивали в оранжерее при 22-24С, относительной влажности воздуха 60-70 % и освещенности 4 клк.
Исследование метилирования ДНК растений Mesembryanthemum crystallinum в стрессовых условиях
Энзиматическое метилирование ДНК играет важную роль в регуляции различных клеточных процессов у растений, включая дифференцировку и морфогенез, апоптоз, формирование структуры хроматина и экспрессию генов [Meyer et al., 1994; Sapienza et al., 1987; Yoder et al., 1997; Bestor, 1998; Finnegan et al., 2000]. Кроме общего для всех эукариот симметричного CpG-типа метилирования ДНК, растения отличаются также выраженным типом метилирования симметричных CpNpG-последовательностей (N - любой нуклеозид), и существованием асимметричного типа метилирования NpC. Все известные до настоящего времени функции метилирования ДНК растений установлены при исследовании CpG-типа ее метилирования, в то время как функциональная роль других типов сайт-специфического метилирования ДНК практически не изучена. Не исключено, что эти типы метилирования ДНК могут выполнять в клетках растений особые специфические функции.
Факультативные галофитные растения Mesembryanthemum crystallinum L. являются хорошо изученной физиологической моделью для исследования адаптации растений к засолению и водному дефициту. Особенностью этого растения является его способность в условиях водного дефицита, вызываемого засухой или засолением, переключаться с Сз-пути фотосинтеза на САМ-путь С4-фотосинтеза (Crassulacean acid metabolism, или метаболизм органических кислот по типу толстянковых) [Bohnert et al., 1988]. Эти два пути ассимиляции ССЬ существенно различаются биохимически и физиологически, причем САМ-путь сопровождается обратным суточным циклом функционирования устьиц: они закрыты днем и открыты ночью, что эффективно защищает САМ-растепия от потери воды в условиях ее дефицита. В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем обеспечения устойчивого роста и развития растений является выяснение генетико-биохимических механизмов адаптации растений к экстремальным условиям окружающей среды. М. crystallinum, благодаря своим физиолого-биохимическим особенностям и сравнительно небольшому размеру генома (около 350 000 т.п.н.), является удобным модельным организмом для исследования адаптации растений к условиям солевого стресса и водному дефициту.
САМ-специфическая форма фосфоенолпируват карбоксилазы (РЕР-карбоксилазы) является "диагностическим" маркером функционирования САМ-пути у растений М. crystallinum. В условиях водного дефицита или засоленности количество РЕР-карбоксилазы и соответствующей мРНК в клетках этих растений резко возрастает. В этих условиях у растений происходит индукция транскрипции гена Ppcl семейства генов РЕР-карбоксилазы, а также других генов САМ-пути ассимиляции СО2 [Bohnert et al., 1988]. В то же время, механизмы индукции экспрессии этих генов остаются не выясненными. В этих механизмах специфическую функцию может играть энзиматическое метилирование ДНК. Однако до настоящего времени отсутствует информация о специфических особенностях метилирования ДНК растений М. crystallinum в условиях солевого стресса и о возможном его участии в регуляции САМ-специфических генетических программ.
Целью этой части работы является анализ уровня сайт-специфического метилирования ядерной ДНК и исследование специфичности метилирования некоторых генов растений М. crystallinum (рис. 17), растущих в условиях солевого стресса. 1 Определение уровня метилирования последовательностей CCWGG в ДНК Mesembryanthemum crystallinum. Определение уровня метилирования цитозина в нуклеотидных последовательностях ДНК относящихся к CpNpG-метилированному мотиву, проводили по методу, основанному на применении ДНК-метилтрансфераз EcoRll и BstNl (раздел 3.1.3). С помощью этого энзиматического метода обнаружено, что в условиях засоления (0,5 М NaCl), при переключении Сз-фотосинтеза на САМ-метаболизм наблюдается двукратное повышение уровня метилирования последовательностей CCWGG в ядерном геноме растений М. crystallinum (табл. 6). Поиск мишеней для CpNpG-гиперметилирования в геноме Mesembryanthemum crystallinum. Было проведено исследование специфичности метилирования некоторых генов растений М. crystallinum, растущих в условиях засоления. В первую очередь был проведен анализ картины метилирования гена ppcl семейства генов фосфоенолпируват карбоксилазы (РЕР-карбоксилазы), ключевого фермента САМ-метаболизма.
САМ-специфическая форма РЕР-карбоксилазы является «диагностическим» маркером функционирования САМ-пути у растений М. crystallinum. В условиях водного дефицита или засоленности количество РЕР-карбоксилазы и соответствующей мРНК в клетках этих растений резко возрастает. В этих условиях у растений происходит индукция транскрипции гена Ppcl семейства генов РЕР-карбоксилазы, а также других генов САМ-пути ассимиляции СО2 [Bohnert et al., 1988]. В то же время, механизмы индукции экспрессии этих генов до сих пор остаются не выясненными. В этих механизмах специфическую функцию может играть энзиматическое метилирование ДНК. Однако до настоящего времени отсутствовала информация о специфических особенностях метилирования ДНК растений М. crystallinum в условиях солевого стресса и о возможном его участии в регуляции САМ-специфических генетических программ.
Проведенный нами блот-гибридизационный анализ ДНК контрольных и подвергнутых солевому стрессу растений М. crystallinum не показал различий в картине CpNpG-метилирования 5 -регуляторно-промоторной области гена Ppcl РЕР-карбоксилазы. В то же время, CpNpG-метилирование этого гена имеет место, о чем свидетельствуют различия в картине гидролиза гена рестриктазой EcoRll (рис. 18, дор. 2, 4) и рестриктазой BstNl (рис. 18, дор. 1,3).
