Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 7
2. Обзор литературы
2.1 Общая характеристика метилирования ДНК 9
2.2 Геномный импринтинг и Х-инактивация 12
2.3 Абнормальное метилирование при канцерогенезе 22
2.4 Метил-ДНК-связывающие белки 24
2.5 Гены-мишени MBD-белков 29
2.6 Гистоновый код 31
2.7 Строение и возможные функции метил-ДНК-связывающего белка Каизо (Kaiso) 38
3. Материалы и методы
3.1 Работа с культурами эукариотических клеток 45
3.2 Получение радиоактивно меченных ДНК-зондов для экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле 45
3.3 Метилирование ДНК-зондов для экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле 46
3.4 Получение радиоактивно меченных ДНК-зондов для Саузерн- и Нозерн-блот анализа 46
3.5 Выделение ядерных экстрактов 47
3.6 Получение рекомбинантно-экспрессированных белков 47
3.7 Выделение тотальной ДНК из тканей 48
3.8 Выделение тотальной РНК из тканей 49
3.9 Полимеразная цепная реакция 49
3.10 Клонирование ПЦР-продукта в p-GEM-T вектор 50
3.11 Рестрикционный анализ 50
3.12 Трансформация E.coli и выделение плазмидной ДНК 51
3.13 Исследование ДНК-белкового взаимодействия методом торможения ДНК-белкового комплекса в геле 51
3.14 Иммунопреципитация хроматина 52
3.15 Обратная транскрипция 54
3.16 Бисульфитное секвенирование 54
3.17 Саузерн-блот анализ 55
3.18 Нозерн-блот анализ 56
3.19 ПНР в реальном времени 56
3.20 Количественный обсчёт результатов иммунопреципитации хроматина с последующей «ПНР в реальном времени» 57
3.21 Производство нокаута 57
3.22 Олигонуклеотиды 61
3.23 Компьютерный анализ 64
4 Результаты и их обсуждение
4.1 Метилзависимое взаимодействие Каизо с широким спектром последовательностей ДНК in vitro 65
4.2 Каизо взаимодействует с регуляторными областями «молчащих» генов ріб, IAP и генов, расположенных на неактивной Х-хромосоме, но не гена Матрилизин 68
4.3 Каизо взаимодействует с областью Н19 DMR in vitro 69
4.4 Каизо дифференциально взаимодействует с разными участками H19DMR 73
4.5 Определение профиля связывания Каизо в H19Agf2^0Kyce 73
4.6 Каизо взаимодействует с отцовским метилированным районом H19DMR 76
4.7 Делеция Каизо приводит к изменению структуры хроматина в районе Н19 DMR 77
4.8 Делеция Каизо не влияет на экспрессию генов HI9 и Igf2 81
4.9 Экспрессия IAP-элемента, а также генов Xist и Wntl 1 не зависит от взаимодействия Каизо с их регуляторными последовательностями 84
4.10 Делеция Каизо приводит к усилению экспрессии гена Tctexl 86
4.11 Каизо взаимодействует с геном Tctexl только на 17, но не на 6 хромосоме 88
4.12 Разница в экспрессии Tctexl не зависит от разницы в строении Т-комплекс содержащего локуса 91
4.13 Делеция Каизо не приводит к изменению метилирования ЦфГ-островка гена Tctexl 91
Заключение 95
- Геномный импринтинг и Х-инактивация
- Получение радиоактивно меченных ДНК-зондов для экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле
- Олигонуклеотиды
- Делеция Каизо приводит к усилению экспрессии гена Tctexl
Введение к работе
Актуальность проблемы
Регуляция экспрессии генов у высших эукариот — сложный процесс, включающий контроль синтеза РНК и белков на всех возможных уровнях: от связывания транскрипционных факторов и внутриядерной локализации кодирующей последовательности до посттрансляционных модификаций белков. Важную роль в этом процессе играют и механизмы, связанные с изменением/поддержанием структуры хроматина, в которых участвуют хроматин-ремоделирующие факторы: гистондеацетилазы, гистон-ацетилтрансферазы, метил-ДНК-трансферазы и др. Важную роль в большинстве процессов эпигенетической регуляции экспрессии генов, таких как Х-инактивация, геномный импринтинг, репрессия транскрипции мобильных элементов, репрессия транскрипции генов-супрессоров опухолевого роста, играет метилирование ДНК. Оно связано с негативной регуляцией экспрессии генов и может оказывать непосредственное влияние на транскрипцию, блокируя взаимодействие активирующих белковых факторов с регуляторними последовательностями [Clark et al., 1997]. Однако существует и другой механизм - привлечение к метилированной ДНК так называемых метил-ДНК-связывающих белков.
Описанный недавно новый метил-ДНК-связываюший белок Каизо имеет два функциональных домена: BTB/POZ и «цинковые пальцы» [Prokhortchouk et al., 2001]. Последний обеспечивает специфическое взаимодействие с метилированной ДНК, тогда как BTB/POZ-домен может принимать участие в образовании комплексов с другими белками того же семейства. Исходно Каизо был охарактеризован как белок, взаимодействующий с катенином р120 [Daniel, Reynolds, 1999]. Таким образом, Каизо является фактором, способным как взаимодействовать с метилированной ДНК, так и участвовать в других внутриклеточных процессах, обеспечивая связь между событиями в цитоплазме и регуляцией экспрессии генов в ядре.
Кроме того, известно, что BTB/POZ-белки играют важную роль в процессах органогенеза, являются супрессорами опухолевого роста [Deweindt et al., 1995]. Следовательно, поиск генов, экспрессия которых зависит от Каизо, представляет интерес для общего понимания эпигенетической регуляции экспрессии генов, а также может оказаться полезным при изучении явлений Х-инактивации, геномного импринтинга, канцерогенеза и т.д.
БИБЛИОТЕКА. СПетер^ 09
'IMOltKA j
2 Цель работы: изучение возможной роли нового метил-ДНК-связывающего белка Каизо в процессах эпигенетической регуляции экспрессии генов.
Задачи исследования:
1. Охарактеризовать способность Каизо взаимодействовать in vitro и in vivo с
регуляторными последовательностями ДНК, подвергающимися метилированию в
живом организме:
5'-LTR мобильных элементов (на примере мобильного элемента IAP -intracistirnal A-particle);
промоторными областями генов-супрессоров опухолевого роста (на примере гена р 16);
областями контроля локуса импринтных генов (на примере H19/Igf2^oKyca).
-
Исследовать влияние нокаута метил-ДНК-связывающего белка Каизо на транскрипцию этих генов.
-
Исследовать влияние нокаута Каизо на изменение эпигенетических маркеров в исследуемых районах.
Научная новизна
В работе впервые был проведен поиск генов-мишеней нового метил-ДНК-связывающего белка Каизо, а также исследовано влияние делеции гена, кодирующего Каизо у мыши, на экспрессию генов-мишеней в живом организме. Кроме того, впервые было изучено влияние нокаута Каизо на структуру хроматина в районе Н19 DMR и уровень метилирования ДНК в районе промотора reHaTctexl.
Теоретическое и практическое значение работы
В работе показано, что метил-ДНК-связывающий белок Каизо способен взаимодействовать с широким спектром последовательностей-мишеней как in vitro, так и in vivo. При этом было продемонстрировано, что отсутствие Каизо приводит к изменению гистонового кода в районе Н19 DMR, а также установлено, что Каизо подавляет транскрипцию гена Tctexl.
Полученные результаты представляют интерес как при изучении механизмов интерпретации сигналов метилирования ДНК, так и при общем рассмотрении процессов регуляции экспрессии генов. Кроме того, учитывая, что белок, кодируемый геном Tctexl, важен в процессах роста аксона и формирования дендритов у созревающих нейронов [Chuang et al., 2005], можно предположить,
з что нарушение функций Каизо связано с какими-либо психическими расстройствами и нейродегенеративными заболеваниями. Продолжение работы в этом направлении может указать пути лечения подобных заболеваний.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертации были представлены на: III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003), International congress of medical sciences for students and young doctors (8-11 May 2003; Sofia, Bulgaria), Eighteenth IGB Meeting: Epigenetic Bases of Genome Reprogramming (Capri, Italy, 2005).
Структура диссертации
Диссертационная работа представлена на -Ц страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий 20- источника. Материал проиллюстрирован 20 рисунками.
Геномный импринтинг и Х-инактивация
Небольшая часть ЦфГ-островков в норме всё же подвергается метилированию - это ЦфГ-островки, связанные с импринтными генами и генами на неактивной Х-хромосоме [Ке, Collins, 2003]. Промоторы, ассоциированные с подобными последовательностями, остаются «молчащими» на протяжении всей жизни организма. Однако, если метилирование ЦфГ-островков Х-связанных генов происходит во время эмбрионального развития [Takagi, 2003], то статус метилирования импринтных генов остаётся неизменным с момента созревания гамет [Mann, 2001]. Геномный импринтинг - процесс, при котором экспрессия гена зависит от того, на отцовском или материнском аллеле он расположен. Как правило, различные аллели импринтных генов различаются по таким признакам, как метилирование ДНК, структура хроматина (как модификации гистонов [Grandjean et al., 2001], так и сайты гиперчувствительности к ДНКазе I [Khosla et al., 1999]), время репликации [Gribnau et al., 2003]. Важными свойствами импринтинга являются также наследуемость и обратимость при наследовании. Как правило, импринтные гены расположены в геноме в виде кластеров [Verona et al., 2003; Caspary et al., 1998]. Вероятно, экспрессия ряда генов, существующих внутри одного кластера, может находится в зависимости от какого-либо общего регуляторного элемента. Наиболее хорошо охарактеризованными являются импринтные локусы, расположенные на 7,17 хромосомах в геноме мыши, а также на Х-хромосоме. Кластер импринтных генов, расположенных на хромосоме 7F мыши, состоит из двух субдоменов: (1) более теломерно расположенный НІ9 домен, включающий три гена НІ9, Igf2 и Ins2, и (2) лежащий ближе к центромерной области Kcnqlotl домен, состоящий из Cdknlc, Kcnql, Kcnqlotl и ряда других генов [Verona et al., 2003]. Нарушение экспрессии некоторых генов этого кластера приводят к развитию синдрома Бекуиза-Вайдемана, характеризующегося избыточной массой развивающегося организма в пре- и постнатальный период, повышенной предрасположенностью к ряду эмбриональных опухолей, а также некоторыми другими патологическими признаками [Maher, Reik, 2000]. Показано, что основными аномалиями, приводящими к развитию синдрома, являются нарушения в экспрессии генов Igf2 и Cdknlc [там же]. Механизм поддержания импринтинга в субдомене HI9 будет рассмотрен ниже. Можно только упомянуть, что, как и в большинстве импринтных локусов, ведущую роль здесь играет метилирование ДНК в так называемых DMR (от Differentially Methylated Regions) . Основным регуляторным элементом второго поддомена является, ЦфГ-островок, расположенный в промоторе гена Kcnqlotl, - так называемый KvDMRl [Lee et al., 1999b]. Ген Kcnqlotl экспрессируется только с отцовского аллеля и кодирует нетранслируемую РНК, синтезирующуюся как антисенс к РНК гена Kcnql [Engemann et al., 2000].. Делеция отцовского аллеля KvDMRl приводит к потере импринтинга генов, расположенных как в 5 -, так и в 3 -положении относительно KvDMRl: Tssc3, Slc22all, Cdknlc, Kcnql, Tssc4 и Ascl2 [Fitzpatrick et al., 2002]. Таким образом, KvDMRl является центром контроля локуса для Kcnqlotl домена импринтных генов. Очевидно, что РНК гена Kcnql otl и KvDMRl играют важную роль в регуляции экспрессии генов субдомена, однако, полностью механизм поддержания нормального статуса импринтинга пока остаётся неясным. Большой кластер импринтных генов - около двух миллионов пар оснований - расположен также на хромосоме 7С мыши. Аналог этого кластера у человека находится на 15 хромосоме [Verona et al., 2003]. Нарушения регуляции импринтинга генов этого кластера ведут к развитию таких синдромов, как синдром Прадера-Вилли (Prader-Willi syndrome) и синдром Ангельмана (Angelman syndrome) [Shemer et al., 2000]. Оба синдрома характеризуются широким спектром неврологических, поведенческих аберраций, а также наличием дефектов развития. В качестве примера нарушений при синдроме Прадера-Вилли можно назвать ожирение, задержку умственного развития, гипотонию и т.д. [Nixon, Brouillette, 2002] Синдром Ангельмана характеризуется менее выраженной задержкой умственного развития, агрессивным поведением, беспричинным смехом, отсутствием речи [Nicholls, Knepper, 2001]. Показано, что в развитие этих синдромов вносят вклад нарушения в работе генов, экспрессирующихся с отцовского и материнского аллелей данного локуса соответственно. Делеция 3 -области расположенного на расстоянии примерно в 35 тысяч пар оснований от промотора экспрессирующегося с отцовского аллеля гена Snurf центра контроля локуса приводит к развтию синдрома Ангельмана [Buiting et al., 2003], тогда как делеция расположенного в районе промотора гена Snurf приводит к возникновению синдрома Прадера-Вилли [Nicholls, Knepper, 2001]. Стоит отметить, что метилирование ДНК несущественно для контроля генов, экспрессирующихся с материнского аллеля. Однако нарушение импринтинга экспрессирующихся с отцовской хромомсомы генов Snurf-Snrpn, Ndn и МкгпЗ свидетельствует в пользу важности метилирования дистальной части центра контроля локуса [Hata et al., 2002; Howell et al., 2001]. Ha 17 хромосоме мыши расположен кластер генов, включающих экспрессирующиеся с материнской хромосомы гены Igf2r, Slc22a3, Slc22a2 и единственный экспрессирующийся с отцовской хромосомы ген Air [Verona et al., 2003]. Экспрессия Igf2r начинается в раннем эмбриональном периоде и продолжается во взрослом состоянии [Ни et al., 1998]. Показано, что в регуляции импринтинга этого гена играет роль метилирование ДНК [Hata et al., 2002; Howell et al., 2001]. В большинстве тканей экспрессируется исключительно материнский аллель гена Igf2r. Это обусловлено наличием DMR во втором интроне этого гена [Wutz et al., 1997]. Высокий уровень метилирования ДНК на материнском аллеле данного DMR (DMR2) формируется в ооцитах и поддерживается во всех соматических тканях [Stoger et al., 1993]. С неметилированного отцовского аллеля экспрессируется антисмысловой транскрипт Air, необходимый для репрессии транскрипции с отцовского (смыслового) промотора гена Igf2r [Zwart et al., 2001]. Показано, что делеция участка ДНК, кодирующего ген Air приводит не только к потере импринтинга гена Igf2r, но и близлежащих генов Slc22a3 и Slc22a2 [там же]. В качестве предположительного механизма регуляции импринтинга в данном локусе рассматриваются две гипотезы [Sleutels et al., 2002]: (1) нетранслируемая РНК гена Air может связываться с ДНК в цис-положении, что ведёт к привлечению различных факторов, например, комплексов, ремоделирующих структуру хроматина, и (2) Air РНК необходима для прямой репрессии транскрипции гена Ig2r, а репрессия генов Slc22a3 и Slc22a2 является вторичной. Механизм импринтинга в H19/Igf2 локусе. Одной из наиболее широко известных моделей, используемых при изучении процессов геномного импринтинга, является система генов H19flgf2 - двух связанных и реципроктно импринтированных генов, расположенных на дистальном конце седьмой хромосомы мыши на растоянии примерно 90 тысяч пар оснований друг от друга: ген HI9 экспрессируется с материнской хромосомы, но неактивен на отцовской [Bartolomei et al., 1991; Zhang, Tycko, 1992], Igf2 - наоборот [DeChiaraetal., 1991]. Первоначально обсуждались две модели регуляции экспрессии гена Igf2. Первая предполагала зависимость экспрессии Ig2 от транскрипционного статуса HI 9. В пользу этой теории говорили следующие факты: делеция участка, содержащего ген Н19, приводила к нарушению импринтинга [Leighton et al., 1995а], а наличие последовательностей, кодирующих нетранслируемую мРНК, было продемонстрировано для многих импринтых локусов [Peters, Beechey, 2004]. Вторая модель, получившая название «модель соперничества за энхансер», предполагала, что промотор гена Igf2 является более слабым и не может соперничать с активным неметилированным промотором гена HI9. Существенный вклад в развитие этой теории внесли работы по обнаружению, а также по делеции общих для двух генов энхансеров, лежащих downstream от гена HI9 [Leighton et al., 1995b].
Получение радиоактивно меченных ДНК-зондов для экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле
Проводили мечение ДНК-зондов радиоактивным изотопом фосфора (32Р) в 5 -положении. Условия мечения: 2-3 пМоль ДНК-зонда, 10 ед. Т4полинуклеотидкиназы (Fermentas; ЕК0031), їх буфер «PNK buffer А -forward buffen (50 мМ Трис-НСІ рН7.6, 10 MMMgCl2, 5 мМ DTT, О.ІмМспермидин и 0.1 мМ ЭДТА), 20 - 30 uCi 32Р (а-32Р дезокси-АТФ); инкубировали 1 час при +37С. Меченные фрагменты очищали с помощью набора реактивов для очистки ПЦР-продукта QAIquick PCR-purification kit согласно протоколу фирмы-производителя. В случае мечения двуцепочечных олигонуклеотидов полученные ДНК-зонды очищали в акриламидном геле. Для этого продукты реакции разделяли в 12% акриламидном геле (40:1; 1х ТВЕ) и вырезали полоску геля, содержащую меченные олигонуклеотиды. ДНК-зонд элюировали высокосолевым буфером (1 мМ ЭДТА, ЗО мМ Трис-НСІ рН 8.0, 300 мМ NaCl) в течении ночи при +37С, после чего осаждали двумя объёмами этанола с добавлением 1/20 объёма 5М NaCl и 10 мкг тРНК в качестве соосадителя. Метилирование ДНК-зондов проводили в следующих условиях: 5-10 пМоль ДНК-зонда, lx NE буфер 2 (50 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl рН 7.9, 10 мМ MgCl2, 1 мМ DTT), 10 ед. Sss I метилазы (New England Biolabs, Cat.№ M0226L), 3.7 мМ S-аденозилметионин; инкубировали 1 час при +37С. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до 5 мМ с последующей инкубацией при +65С в течение 10 мин. Метилированный ДНК-зонд осаждали этиловым спиртом. Полноту метилирования проверяли рестрикционным анализом с использованием метилчувтвительной рестриктазы НраІІ или метилнечувствительной рестриктазы Mspl. 3.4 Получение радиоактивно меченных ДНК-зондов для Саузерн- и Нозерн-блот анализа Для включения в тело ДНК-зонда радиоактивного изотопа фосфора ( Р) использовали набор реактивов DecaLabel DNA Labeling Kit (Fermentas, Cat.№ K0622). Реакционную смесь, из 200-500 пг ПЦР-продукта и 1х буфера, содержащего случайные декануклеотиды (0.05 М Трис-HCl рН 8.0, 5 мМ MgCb, 1 мМ DTT) инкубировали при +95С в течение 5 мин для денатурации ДНК. Затем смесь охлаждали во льду и добавляли смесь дНТФ без аденина до концентрации 1.5 мМ, 30-50 цСі 32Р (у-32Р дезокси-АТФ) и 5 ед. фрагмента Клёнова. Инкубировали в течение 5 мин при температуре +37С, после чего добавляли смесь 4 дНТФ до концентрации 1.5 мМ и дополнительно инкубировали в течение 10 мин при температуре +37С. Полученный ДНК-зонд очищали с помощью набора реактивов для очистки ПЦР-продукта QAIquick PCR-purification kit (Cat.№ 28106) согласно протоколу фирмы-производителя. Затем зонд денатурировали при температуре +95С в течение 5 мин и добавляли в буфер для гибридизации.
Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, а также антибиотиков пенициллина и стрептомицина. При достижении 80% плотности культуры на чашке Петри диаметром 15 см клетки промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ рН7.4: 1.7 мМ КН2РО4, 5.2 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCl), отделяли с поверхности чашки, осаждали центрифугированием при 1 200 g и повторно промывали ФСБ. Все дальнейшие операции производили при температуре +4С. Клетки с 10 чашек ресуспендировали в 10 мл буфера А (2 М сахароза, 15 мМ Трис-НС1 7.9, 140 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 0.5 мМ ЭГТА, 0.15 мМ спермидин, 0.5 спермин, 1 мМ DTT, 25 мМ КС1, 0.4 мМ PMSF, 2 мМ MgCl2) и инкубировали в течение 10 мин, после чего осаждали центрифугированием и повторно ресуспендировали в 10 мл буфера А. Суспензию «прокачивали» через гомогенизатор Даунса 15-20 раз, а затем 4-6 раз пропускали через шприц с размером иглы 19G. Полученные ядра осаждали при 3000 g в течение 20 мин, затем ресуспендировали в 5 мл буфера А и далее центрифугировали при 10000-15000 об/мин в течение 20-30 мин. Осадок ресуспендировали в 1.5 мл буфера С (0.35 М NaCl, 20 мМ HEPES 7.9, 0.23 М сахароза, 0.15 мМ спермин, 0.5 мМ спермидин, 1мМ DTT, 25 мМ КС1, 0.4мМ PMSF), «прокачивали» через гомогенизатор Даунса и инкубировали при +4С в течение часа при постоянном покачивании. Далее экстракты центрифугировали на 13000-14000 g при +4С в течении 20-30 мин. Супренатант расфасовывали в микроцентрифужные пробирки по 50 мкл и замораживали в жидком азоте. Концентрацию тотального белка проверяли по методу Брэдфорд. 3.6 Получение рекомбинантно-экспрессированных белков Векторные плазмиды pGEX-2T (Amersham Biosciences), содержащие в качестве вставок конструкции Каизо-GST или Каизо-ZF-GST, трансформировали в экспрессионный штамм E.coli BL21. Отдельные клоны отбирали и растили в жидкой среде LB в течение ночи при +37С. Ночную культуру разбавляли в соотношении 1:100 и доращивали до концентрации А(600) = 1, после чего индуцировали экспрессию добавлением изопропил-тио-Р-галактозида (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ, после чего дополнительно инкубировали культуру в течение 4 часов. Клетки осаждали центрифугированием с охлаждением при 3000 g, ресуспендировали осадок в ледяном ФСБ из расчёта 50 мкл/мл среды. Клетки разрушали короткими импульсами на ультразвуковом дезинтеграторе Brunswick Scientific, после чего к суспензии добавляли ТритонХ-100 до конечной концентрации 1%. Инкубировали 30 мин на льду, затем центрифугировали с охлаждением при 12000 g в течение 20 мин.
Осадок отбрасывали, а супернатант использовали для очистки рекомбинантного белка. Супернатант инкубировали с GST-сефарозой в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего трижды промывали 10-ю оюбъёмами ФСБ. Элюцию проводили в три стадии в течение 10 мин каждая 10 мМ глутатионом в 50 мМ Трис-HCl (рН 8.0). Полученные фракции анализировали в денатурирующем полиакриламидном геле. 3.7 Выделение тотальной ДНК из тканей Образец ткани гомогенизировали с помощью гомогенизатора Даунса в лизирующем буфере (100 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl рН 8.0, 25 мМ ЭДТА, 0.5% SDS, 0.1 мг/мл протеиназы К) из расчёта 1 мл на 100 мг ткани и инкубировали 12-18 часов при температуре +37С. Очистку ДНК проводили смесью фенол/хлороформ (1:1): добавляли 1 объём смеси «фенол/хлороформ», тщательно перемешивали, центрифугировали 3-5 мин в настольной центрифуге при 13000 g. Затем отбирали водную фазу и добавляли к ней 1 объём хлороформа. Повторяли центрифугирование, отбирали водную фазу, из которой затем осаждали ДНК двумя объёмами этанола с добавлением 1/20 объёма 5 М NaCl. Инкубировали в течение 1 часа при -20С, после чего центрифугировали раствор в настольной центрифуге при 13000 g в течение 15 мин. Супернатант отбрасывали; осадок промывали 75% этанолом, дополнительно центрифугировали в течение 5 мин и отбрасывали супернатант. Полученную ДНК высушивали на воздухе при комнатной температуре и растворяли в деионизованной воде (mQ Н2О). 3.8 Выделение тотальной РНК из тканей Образец ткани гомогенизировали с помощью гомогенизатора Даунса в TRIzol Reagent (Invitrogen, 15596-026) из расчёта 1 мл на 100 мг ткани. Инкубировали 5 мин при комнатной температуре и добаляли 0.2 мл хлороформа на 1 мл TRIzol Reagent. Тщательно перемешивали и дополнительно инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем образцы центрифугировали в настольной центрифуге при 12000 g в течение 15 мин. Водную фазу переносили в новую микропробирку; туда же добавляли изопропиловый спирт из расчёта 0.5 мл на 1 мл TRIzol Reagent, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. После этого раствор центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин при температуре +4С. Осадок промывали 75% этанолом, высушивали на воздухе при комнатной температуре и растворяли в деионизованной воде, предварительно обработанной диэтилпирокарбонатом (НгОвЕРс)- 3.9 Полимеразная цепная реакция Специфическую амплификацию фрагментов ДНК производили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Олигонуклеотиды
Для синтеза зондов для экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле, а также для анализа результатов иммунопреципитации хроматина были использованы следующие олигонуклеотиды: XistFl: 5 - CACGCGTCATGTCAC, и комплементарный ему XistRl: 5 - CCACGGGAAACGAGC - для специфической амплификации фрагмента ДНК, соответствующего участку промоторной области гена Xist. IAP СЫР F: 5 - AGCCGCCCCCACATTCGCCGT, и комплементарный ему IAP СЫР R: 5 - TCACTCCCTGATTGGCTGCAGC - для специфической амплификации фрагмента ДНК, соответствующего 5 -1ЛТ11АР-элемента. Fpl6-island: 5 - GGGCTCTCACAACTAGGAA, и комплементарный ему Rpl6-island: 5 - CGGAGGAGGTGCTATTAACTC - для специфической амплификации фрагмента ДНК, соответствующего промоторной области гена р16. MatprF: 5 - TCTTTCTTGGCATTGGTGGTGTTGT, и комплементарный ему MatprR: 5 - CAGCCCTGAATGTGGAAATAG - для специфической амплификации фрагмента ДНК, соответствующего промоторной области гена Matrilysin. DMD 56/1: 5 - GTGCAACAAGGGAACGGATGC, и комплементарный ему DMD 78/1: 5 - AACCGCAATTTTGGTCACCT - для анализа аллель-специфичного взаимодействия Каизо в районе HI9 DMR. TctexlF: 5 - CACGGCGTCGGGAGGATGA, и комплементарный ему TctexlR: 5 - AGGGAGCGCCGCACTGAAGGAC - для анализа взаимодействия Каизо с промоторной областью гена Tctexl, а также для синтеза пробы для Нозерн-блот анализа.
Для специфической амплификации фрагментов ДНК, соответствующих участкам области контроля локуса импринтных генов H19/Igf2 использовали следующие праймеры: hi9-1: 5 - GGAACATGCTACATTCACAC, и комплементарный ему hl9-2: 5 -CACAGCATTGCCATTTGTG hi9-3: 5 - CACATGCATTTTCTAGGCTG, и комплементарный ему Ы9-4: 5 -GACTATGGGATCATAGATGG Ы9-5: 5 GACCTCCCTACCCAAAGAA, и комплементарный ему Ы9-6: 5 -CACCCAAGGCTTGATGTAGG DMD-1: 5 - CTTATGGCAAAGTTGGGGTT, и комплементарный ему DMD-2: 5 - GCTTTTGTGCTTTCTGGCAT DMD-3: 5 - ATGCCAGAAAGCACAAAAGC, и комплементарный ему DMD-4: 5 - GTTCCAACCTCTTATAAACC DMD-5: 5 - GCTGTTATGTGCAACAAGGG, и комплементарный ему DMD-6: 5 -GCACACATCTTACCACCCCT DMD-7: 5 - ACTTGACTCATTCCCTACAC, и комплементарный ему DMD-8: 5 - GAGTGACCCATGAGTTTGCC DMD-9: 5 - GGCAAACTCATGGGTCACTC, и комплементарный ему DMD-10: 5 - AGCTATAGCCAAATCTGCAC DMD-11: 5 - GTGCAGATTTGGCTATAGCT, и комплементарный ему DMD-12: 5 TGTTGAACCTGGGGTACTC DMD-13: 5 - GGGATCAGGCATTTGTGCAC, и комплементарный ему DMD-14: 5 - CTGCTTTTATGGCTATGGGG DMD-15: 5 - CCCCATAGCCATAAAAGCAG, и комплементарный ему DMD-16: 5 - CTACCCACCCTCCTGCTTCA DMD-17: 5 - GGAGCATAGCGGGTGTGGCA, и комплементарный ему DMD-18: 5 -CATTATGCCCCCGCTATGCC hi9-7: 5 - GAGGCGAACGTGCGCTGGAA, и комплементарный ему ПІ9-8: 5 -CCTCCCACACCCGGTGCTTC Для определения профиля связывания Каизо в Н19/І0-локусе: DMR1-C1F: 5 - CGGGAGACTACAACAAGCTAGGA, комплементарный ему DMR1-C1R: 5 - AGACTTACCCACTAAGCC DMR1-C2F: 5 - GTTCATCTCCGGGGTGT, и комплементарный ему DMR1-C2R: 5 - AGGGCAGCAATCACAACC DMR1-C3F: 5 - TCGCCCTGTCTAGGTCCCCACAC, и комплементарный ему DMR1-C3R: 5 - AACCACCCGTAGAGGATG DMR2F: 5 - ACGACTTCCCCAGATACCC, и комплементарный ему DMR2R: 5 - GGGTCTTTGGGTGGTAACA H3F: 5 - TATGAGGACACCTGACCTCCCT, и комплементарный ему H3R: 5 - GCCCCATTGAGAGAGAATGC D3F: 5 - GCATAGAAGCTGTTATGTGCAA, и комплементарный ему D3R: 5 - CTGGGAATGAATCGCTCC D6F: 5 TCACTCTCCACGCTGTGC, и комплементарный ему D6R: 5 - CCTGATCCCTTTGTTGAACC H4F: 5 - AGGCGAACGTGCGCTGGAA, и комплементарный ему H4R: 5 - CTCCCACACCCGGTGCTTC Для анализа экспрессии генов методом обратной транскрипции были использованы следующие олигонуклеотиды: Н19Р1: 5 - AAGAGCTAACACTTCTCTG, и комплементарный ему Н19Р2: 5 - CAGGTAGTGTAGTGGTTCTGAT - для анализа аллель-специфической экспрессии гена HI9. Ig2P3: 5 - AGTGGGGAAGTCGATGTTGG, и комплементарный ему Igf2P2: 5 - AGTGGAGCAGAGAGATCTTAGT - для анализа аллель-специфической экспрессии гена Igf2. Deneinl: 5 TAAAGATGGAAGACTTCCA, и комплементарный ему Denein2: 5 - GGAAAGTTAGTGTATCTGAA - для анализа экспрессии reHaTctexl.
Для анализа экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени были использованы следующие олигонуклеотиды: IAP Q-PCR F: 5 - TGTACCCCGAGCACCAAGAGT, и комплементарный ему IAP Q-PCR R: 5 - ATAGGATCCGGGCCATACCAT - для анализа экспрессии и числа копий 1АР-элемента. 18S rRNA Q-PCR F: 5 - AGACGATCAGATACCGTCGTA, и комплементарный ему 18S rRNA Q-PCR R: 5 - TGAGGTTTCCCGTGTTGAGTCA - для анализа экспрессии 18SpPHK. Wntll QF1: 5 - AGCTGGAGGGCCTGGTGTCTGC, и комплементарный ему Wntll QRl: 5 AGGCCCGGGCGATGGTGTG - для анализа экспрессии гена Wntll. Для аллель-специфичной ПНР в реальном времени были использованы следующие праймеры и зонды: Н19 Nla Taq F: 5 - GTAGAAGCCGTCTGTTCTTTCAC, и комплементарный ему HI9 Nla Taq R: 5 - TGATTCAGAACGAGACGGACTT H19 Nlalll dom: 5 - FAM - TACCCAGCTCATGTCTGGGCCTTT AMRA - для транскрипта, соответствующего Mm. domesticus аллелю. H19 Nlalll spr: 5 - VIC - TACCCAGCTCATATCTGGGCCTTTG AMRA- для транскрипта, соответствующего M. spretus аллелю. Для бисульфитного секвенирования были использованы следующие праймеры: Tctexl up BS Fl: 5 - TAGGTAGTTATTGGTAGTGGTTAG, и комплементарный ему Tctexl up BS Rl: 5 - CAAAAACCTAAAAATCTTCCATCT - для анализа «района 1» ЦфГ-островка гена Tctexl. Tctexl BS Fl: 5 - TAAGGATATTTTGAGGGAAGAGTAAGA, и комплементарный ему Tctexl BS Rl: 5 - САТАССАСААСААААТАССТССТ -для анализа «района 2» ЦфГ-островка гена Tctexl. 3.23 Компьютерный анализ Компьютерный анализ последовательностей проводили с помощью пакета программ DNASTAR. Количественную обработку полученнных данных проводили в программе Microsoft Excel. Для определения потенциальной способности Каизо участвовать в основных процессах, связанных с метилированием ДНК, был применен метод «торможения ДНК-белкового комплекса в геле». Синтез ДНК-зонда проводили полимеразной цепной реакцией с последующим кинированием ПЦР-продукта по 5 -концу с помощью Т4-полинуклеотидкиназы. В экспериментах использованы фрагменты ДНК, соответствующие: участку 5 -LTR ретротранспозонного элемента IAP, фрагменту промоторной области гена Xist и ЦфГ-богатому участку промоторной области гена р16, часто подвергающейся так называемому «ненормальному» метилированию в различных типах опухолей. При использовании ядерных экстрактов из линии клеток КСМЛ-0, характеризующихся высоким уровнем содержания Каизо-зависимого ДНК-связывающего комплекса [Prokhortchouk et al., 2001], было детектировано метилзависимое связывание со всеми тремя использованными фрагментами ДНК. Для доказательства того, что наблюдаемый ДНК-белковый комплекс образуется с участием Каизо, реакционная смесь была дополнительно проинкубирована со специфическими к данному белку (ZFH6) или нерелевантными (анти-1кВ) антителами. Добавление поликлональных антител к Каизо приводило к уменьшению подвижности комплекса в геле, тогда как наличие антител к IkB никак не отражалось на массе комплекса (рис. 7).
Делеция Каизо приводит к усилению экспрессии гена Tctexl
Методом гибридизации на микрочипах был проведён глобальный анализ изменения уровня экспрессии 30 тыс. генов у Каизо-нокаутных мышей. Идентифицирован ряд генов, транскрипция которых оказалась изменена при отсутствии Каизо. Геном с наиболее выраженным увеличением уровня экспрессии оказался ген Tctexl, кодирующий лёгкую цепь динеинового комплекса [Tai et al., 1998]. Данные гибридизации были подтверждены Нозерн-блот анализом, для которого была использована РНК, полученная из органов (печени и мозга) мышей дикого типа и нокаутных по Каизо (рис. 18А.). Уровень экспрессии Tctexl оказался в 4,4±0,6 раза выше в печени нокаутных животных, чем в печени животных дикого типа и в 2,6±0,2 раза выше в мозге животных с делецией гена, кодирующего Каизо, чем в мозге животных дикого типа (рис. 18Б.). При анализе базы данных Entrez Map Viewer было установлено, что в геноме мыши содержится два гена Tctexl: на 17 и 6 хромосомах. При этом ген, находящийся на 17 хромосоме имеет сложную интрон/экзонную структуру и включает 5 экзонов, тогда как кодирующая часть гена, расположенного на 6 хромосоме состоит из одного экзона (рис 19А.). С помощью иммунопреципитации хроматина было показано, что Каизо взаимодействует только с ЦфГ-островком гена Tctexl, расположенного на 17ромосоме. Интересно отметить, что ацетилирование гистонов НЗ и Н4, являющееся маркером активного хроматина, было детектировано в той же области одновременно со связыванием Каизо. При этом ни взаимодействия Каизо, ни ацетилирования гистонов в районе промотора гена, расположенным на 6 хромосоме детектированно не было (рис. 19Б.). Компьютерный анализ последовательностей генов Tctexl позволил идентифицировать рестрикционный полиморфизм в последовательностях мРНК. Замена цитозина на тимин приводит к исчезновению в мРНК гена, расположеного на 17 хромосоме, сайта узнавания рестриктазой Mspl. Была проанализирована тотальная РНК, полученная из печени мышей дикого типа, а также нокаутных по Каизо. С использованием метода обратной транскрипции с последующей ПЦР были получены ПЦР-фрагменты, соответствующие участку мРНК, содержащему полиморфизм. Рестрикционный анализ этих фрагментов показал, что в препаратах тотальной РНК, полученной как из органов животного дикого типа, так и из органов Каизо-нокаутной мыши не содержится транскрипт, соответствующий гену Tctexl, расположенному на 6 хромосоме (рис. 19В.).
Поскольку данный ген имеет только один экзон, препарат геномной ДНК мыши был использован в качестве контроля для теста: ПЦР-продукт, полученный с использованием той же пары праймеров, что и для ОТ-ПЦР, был полностью расщеплён рестриктазой Mspl. Таким образом, можно заключить, что Каизо взаимодействует только с геном Tctexl, расположенным на 17 хромосоме, тогда как на 6 хромосоме, вероятно, находится нетранскрибируемый псевдоген. Структура локуса, содержащего ген Tctexl, а также ряд сцепленных с ним генов (Т-комплекс), сильно варьирует у разных линий мышей. Скрещивание между линиями также может приводить к хромосомным перестройкам внутри данной области. Потенциально, разница в структуре локуса может стать причиной разного уровня экспрессии Tctexl. Поскольку Каизо-нокаутные животные исходно были получены из ЭС клеток, выделенных из мышей линии 129/01а, было продемонстрировано, что разница в экспрессии гена Tctexl не зависит от разницы в структуре локуса у животных дикого типа и нокаутных по Каизо. Кроме того, было показано, что все проанализированные животные имели структуру, характерную для животных линии С57, но не для линии 129 (рис. 20Б.). 4.13 Делеция Каизо не приводит к изменению метилирования ЦфГ- островка гена Tctexl. Поскольку Каизо взаимодействует с метилированной ДНК, методом бисульфитного секвенирования был проанализирован уровень метилирования в районе ЦфГ-островка гена Tctexl. Для исследования использована ДНК, полученная из печени мышей дикого типа и с делецией гена, кодирующего Каизо. Были проанализированы две области: «-189; -57» и «+160; +460» по отношению к точке старта транскрипции. В области «-189; -57» метилирование ДНК детектировано не было (проанализировано по 10 клонов для ДНК животных дикого типа и Каизо-нокаутных). Область «+160; +460» характеризуется малым процентным содержанием метилированных ЦфГ-динуклеотидов (проанализировано 20 клонов для ДНК животных дикого типа и 21 - для Каизо-нокаутных), причем уровень метилирования ДНК не зависит от присутствия Каизо (рис. 20А.). Поскольку ген Tctexl экспрессируется и в нормальном организме, можно предположить, что Каизо является модулятором активности гена Tctexl, взаимодействуя с остаточным метилированием ДНК в промоторной области. Таким образом, в результате проведенных исследований продемонстрирована возможность взаимодействия Каизо-содержащего белкового комплекса с последовательностями ДНК, подвергающимися метилированию в результате таких процессов, как геномный импринтинг, опухолеобразование и подавление транскрипции мобильных элементов.
То, что нокаут Каизо не приводил к изменению в экспрессии большинства исследованных генов, может быть объяснено наличием «избыточного» количества метил-ДНК-связывающих белков. Кроме того, недавно было охарактеризовано семейство Каизо-подобных белков (KL-белки - от Kaiso-like proteins). В геноме мыши были картированы два гена, кодирующие белки, в структуре которых имеется домен «цинковые пальцы», гомологичный домену Каизо [Filion et al., 2006]. Оба белка способны взаимодействовать с метилированной ДНК и подавлять транскрипцию с метилированных матриц. Таким образом, можно предположить, что отсутствие Каизо компенсируется другими членами KL-семейства. Стоит отметить, что один из гомологов Каизо также найден и у Xenopus laevis, однако его делеция не приводит к столь существенным нарушениям, как нокаут Каизо [Рузов и др., персональное сообщение]. Разница в последствиях делеции кодирующего Каизо гена у Xenopus laevis и Mus.musculus может иметь две причины. Во время раннего эмбрионального развития мыши происходит резкое существенное деметилирование генома, после чего уровень метилирования ДНК восстанавливается. Подобного процесса не наблюдается в эмбриональном развитии Xenopus laevis. Возможно, Каизо выполняет важные функции именно во время одной из стадий раннего эмбрионального развития амфибии - т.н. МВТ (mid-blastula transition). Отсутствие белка на данной стадии приводит к увеличению экспрессии ряда зависящих от метилирования ДНК генов. Поскольку Mus. musculus не имеет в своём развитии подобной стадии, наличие Каизо оказывается не столь существенным для формирования организма. Тем не менее, обнаружен ряд генов, транскрипция которых напрямую связана с присутствием исследуемого метил-ДНК-связывающего белка. Это позволяет предположить, что Каизо играет роль в более тонких процессах регуляции экспрессии генов. Так, зависимость экспрессии гена Tctexl от присутствия данного фактора позволяет предположить, что наличие Каизо может оказаться важным при таких сложных процессах как, например, созревание нервной системы.
