Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 7
1.1. Методы направленного мутагенеза 7
1.2. Мутагенез и репарационные процессы в клетке 25
Глава 2. Материалы и методы 55
2.1. Материалы 55
2.2. Методы 57
Глава 3. Результаты и обсуждение 68
3.1. Результаты 68
3.2. Обсуждение 98
Заключение 120
Выводы 123
От автора 125
Литература 126
Введение к работе
Методическая база молекулярной биологии в течение последнего десятилетия пополнилась рядом новых методов, позволяющих производить направленные перестройки генетического материала. Проблема клонирования генов сведена в настоящее время к решению конкретных генноинженерных задач. Практически любой ген, выделенный из природных организмов или искусственно синтезированный,может быть встроен в заранее выбранную векторную молекулу при соответствующем подборе рестрик-таз.
Актуальной в настоящее время является проблема устойчивой экспрессии клонированных генов в клетках штаммов продуцентов. В рамках этой проблемы стоит задача об оптимальном синтезе целевого продукта.
Для решения этой задачи необходимо "отрегулировать взаимоотношения" клонированного гена и клетки таким образом, чтобы получение целевого продукта, кодируемого этим геном, было экономически оправдано.
Уровень экспрессии клонированного гена в какой-либо клеточной системе должен быть приведен в соответствие с условиями ее размножения: чрезмерный синтез чужеродного белка может отрицательно сказаться на жизнеспособности клеток. В этом случае будет трудно осуществить устойчивый технологический процесс. Другим крайним случаем является низкий уровень экспрессии данного белка, что также неприемлемо для практического использования.
Использование эндогенных клеточных систем для регуляции синтеза целевого продукта не всегда возможно, т.к. они предназначены для клеточных нужд. Введение мутаций в операторно промоторную область, под контролем которой находится клонированный ген, дает возможность варьировать уровень его экспрессии в клетке. Для решения этой задачи необходим метод, с помощью которого можно с высокой эффективностью вводить мутации в указанную область ДНК.
Целью данной работы является разработка метода направленного введения мутаций в операторно-промоторную область ДНК. Новизна предлагаемого метода заключается в использовании свойства РНК-полимеразы избирательно связываться с опе-раторно-промоторными сайтами ДНК с образованием локально расплетенных участков двойной спирали (Никифоров, Зограф, 1977; Rodriques et al.,I979). Обработка такого белково-нук-леинового комплекса мутагеном, модифицирующим основания в местах, где нарушена регулярная структура двойной спирали ДЩ позволяет с высокой эффективностью отбирать необходимые мутанты. Для этой цели в работе впервые применен мутаген из ряда алкилпроизводнык гидроксиламина о-ТА, с помощью которого достигнут 10-процентный выход мутантов при весьма незначительной инактивации. Столь высокий уровень мутагенеза достигается в традиционной постановке эксперимента при инактивации фага не менее, чем на 5 порядков.
Метод отработан на ДНК фага лямбда, размер которой в 5-Ю раз превышает размеры используемых для направленного введения мутаций объектов, описанных в литературе. Последнее обстаятельство также очень важно, поскольку данный метод может быть применим к большему числу объектов, нежели методы, описанные в литературе.
В литературе нами не найдено аналогов данного метода введения мутаций в регуляторные участки ДНК. Высокий уровень мутагенеза, достигаемый при использовании этого метода, по з зволяет проводить анализ потомства модифицированной ДНК с целью выделения мутантов по операторно-промоторной области, без предварительного использования специальной селектирующей системы.
Методы направленного мутагенеза
При химическом взаимодействии мутагена и ДНК специфичность первого может проявляться в предпочтительной модификации какого-либо основания. Очевидно, что этого еще не достаточно для локализации действия мутагена на каком-либо участке ДНК.
К середине 60-х годов среди генетиков, занимающихся исследованием закономерностей мутагенеза, утвердилось представление, что специфичность действия мутагена может быть достигнута на уровне вторичных процессов, протекающих в клетке после обработки мутагеном (Ауэрбах, 1966). Это удалось четко продемонстрировать при обработке клеток МНІГ в ростовой среде (Cerda-Oimeto et ai., 1968). Мутагенный эффект MHF на фагах также проявляется только после обработки инфицированных клеток, но не исходных фагов (Baker, Tessman, 1968). Взаимодействуя с открытыми участками двух спиральной ДНК,МНГ индуцирует множественные мутации в районе репликационной вилки.
Это свойство мутагена позволяет использовать картированный в хромосоме селективный маркер для выделения мутантов по генам, расположенным на ДНК вблизи него (Oeschger, Berlin, 1974). В работе (Dawes, Carter, 1974) с помощью обработки клеток дрожжей Sacharomyces cerevisiae МНГ авторы ИССЛЄДО-вали закономерности появления мутантов, устойчивых к действию антибиотиков. Максимальный выход мутантов наблюдался в различные периоды s-фазы. Авторы предлагают использовать этот метод для определения очередности включения в репликацию индивидуальных генов в дрожжах.
Аналогичный способ локализации действия химических мутагенов на уровне отдельных генов путем обработки синхронно делящихся клеток реагентом, также преимущественно взаимодействующим с однонитевыми участками ДНК, предложен Салгаником (Салганик, 1968). Используя синхронизированные клетки Е.coil, авторы (Воронина и др., 1968) "проследили" действие мутагена на разные участки ДНК. Множественные ауксотрофные мутанты Е. coli обрабатывали 15 минут гидроксиламином или формальдегидом в различные моменты цикла реплакации ДНК. После удаления реагента и завершения деления клеток выделялись на селективной среде ревертанты. Временная последовательность появления ревертантов совпадала с очередностью вовлечения соответствующих генов в процесс репликации.
Описанные методические приемы не отличаются высокой эффективностью и поэтому для выделения мутантов, как и при использовании традиционных методов мутагенеза, требуется хороший селективный маркер. Достоинством рассмотренных работ является не методическая ценность, но экспериментальное подтверждение тезиса о том, что селективность действия мутагена in vivo может быть достигнута при использовании свойств биологической системы,
В дальнейшем,развитие методов направленного введения мутаций происходило по принципиально новому пути. Генноинже-нерные операции, получившие за последнее десятилетие широкое распространение, стали возможны после открытия эндонуклеаз рестрикции - рестриктаз (Nathans, Smith, 1975), Высокая специфичность рестриктаз, расщепляющих двунитевую ДНК в строго определенных местах, нашла отражение и в методах мутагенеза. Суть методов, использующих рестриктазы для направленного введения мутаций,заключается в следующем. Небольшие кольцевые двуспиральные молекулы ДНК} с одним сайтом рестрикции обрабатываются соответствующей рестриктазой в условиях образования однонитевого разрыва. Таким образом создаются условия модификации ДРК в строго заданном районе.
В работе (Shortii, Nathahs, 1978) в качестве адресующего агента, направляющего действие мутагена в определенное место ДНК,авторы использовали эндонуклеазу НраІІ, для которой имеется один сайт рестрикции на ДНК вируса обезьян sv-40. В условиях образования однонитевого разрыва (Parker et ai., 1977) проводили рестриктазную обработку ДНК (рис. I). Далее, используя S 3 экзонуклеазную активностью ДНК-поли-меразы I (в присутствии одного трифосфата dTTP) В разорванной цепи ДНК образовывали однонитевую брешь. Модификацию оснований проводили бисульфитом. Последний реагирует с цитозином, находящимся в составе однонитевой ДНК, модифицируя его ДО урацила (Shapiro, Weisgras, 1970; Shapiro et al. , 1973). В присутствии всех трифосфатов и ДНК-полимеразы I брешь за-полимеризовывали. Обработанными таким образом молекулами ДНК трансфицировали клетки BSCL, ДНК вирусного потомства анализировали на НраІІ резистентность. Из 35 выросших негативных колоний 21 содержала вирусы, ДНК которых оказалась устойчива к действию НраІІ рестриктазы.
Другой вариант использования рестриктаз в качестве адреса предложен в работе (Muiier et ai., 1978). ДНК обрабатывали рестриктазой Eco RI (рис. 2) также в условиях образования однонитевого разрыва: с участием ДНК-полимеразы I, аналога основания
Мутагенез и репарационные процессы в клетке
Эксдизионная репарация. Процесс эксцизионной репарации принято рассматривать состоящим из следующих стадий: надрез эндонуклеазой нити ДНК вблизи повреждения, расчистка экзо-нуклеазами области повреждения, ресинтез по комплементарной цепи с участием ДНК-полимераз. Завершает процесс восстановления целостности ДНК лигазная сшивка вновь синтезированного фрагмента ДНК с родительской молекулой. Общая схема эксцизионной репарации представлена на рис. 5.
В работах (Cooper, Hanawalt, 1972; Cooper, Hanawalt, 1972a) было показано, что после УФ-облучения клеток Е. СОІІ и последующего инкубирования их в среде, содержащей радиоактивный предшественник ДНК,в составе последней появляются два типа вновь синтезированных фрагментов: короткие около 30 нук-леотидов и длинные до 1500 нуклеотидов. 6 клетках$мутантных по полимеразе I, средний минимальный размер вновь синтезированных фрагментов увеличен до 80-90 нуклеотидов (Cooper, 1982), В штаммах Е. СОІІ, мутантных по гее А белку, максимальный размер однонитевых брешей, образующихся после УФ-облучения,достигает 27000 нуклеотидов. Наконец, в двойном мутанте гее А"" и гее ВС" (этот ген кодирует эндонуклеазу I) после выщепления пиримидиновых димеров и ресинтеза в ДНК наблюдаются только короткие вновь синтезированные фрагменты.
Эти результаты послужили основой для формулировки гипотезы о двух основных путях эксцизионной репарации, зависимых от функции рої А и гее А генов соответственно (Grossman et ai., 1975). В первом случае происходит вышепление короткого фрагмента, содержащего повреждение. При этом используется 5 - 3 экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I, а сопряженная полимеразная активность сразу же застраивает брешь.
Экзонуклеазы, конкурирующие с ДНК-полимеразой за связывание с одноцепочечными разрывами, образуют протяженные бреши. Переключение с деградации цепи на ресинтез происходит при участии гее А белка. До недавнего времени функция этого белка была не совсем ясна, т.к. имелись только генетические данные о его функции. Однако, после того, как гее А ген Б. coii был клонирован, появилась возможность получать хорошо очищенные препараты белка и исследовать его свойства in vitro. Белок гее А связывается с двунитевой ДНК, содержащей одно-нитевые бреши, но не однонитевые разрывы (West et ai., 1980). Видимо, после расширения бреши экзонуклеазой rec А белок блокирует действие последней (см. рис. 5), вступая с ней в конкуренцию, а ДНК-полимер аза застраивает брешь. Не исключено также, что какую-то роль играет в этом процессе и протеолитическая функция гее А белка (Roberts et al., 1977).
Последним этапом восстановления целостности ДНК для обоих путей репарации является лигазная сшивка вновь синтезированной последовательности с родительской ДНК. Согласно Бреслеру (Бреслер, 1976) ферменты, участвующие в репарации,находятся в следующих функциональных отношениях. 1. Ферменты, участвующие в эксцизионной репарации, конкурируют друг с другом за соответствующие субстраты, 2. Момент инцизии (образование однонитевого разрыва ДНК) для рої А и гее А путем репарации является общим с использованием одних и тех же эндонуклеаз. 3. В дальнейшем развитие процесса репарации по рої А и гее А путям в клетке осуществляется независимо - отсутствие одной системы ферментов не нарушает работы другой. Детальный анализ каждого этапа репарации выявляет более сложные взаимоотношения эндонуклеаз, экзонуклеаз и ДНК-поли-мераз, которые могут образовывать мультиэнзимные комплексы. Нацример, из клеток Е. СОІІ выделен так называемый комплекс РЗ (Hendler et al., 1975), состоящий из ДНК-полимеразы I и гее ВС эндонуклеазы. Каждый из входящих в этот комплекс ферментов сам является полифункциональным. Известно, что ДНК-полимераза I обладает наряду с 3-поли-меразой также 5 - 3 и 3 - 5 экзонуклеазными активностями. Эти активности можно разделить посредством протеиназной обработки фермента. При этом образуются две субъединицы (Brut-lag et al., 1969; Klenov, Henningsen, 1970) - малая, обладающая 5 - 3 экзонуклеазной активностью (Setlow, Romberg, 1972), и большая, обладающая ДНК-полимераэной и 3 - 5 экзонуклеазной активностями (Setlow et al., 1972). Экзонуклеаза rec ВС имеет четыре активности: АТФ-зави-симые дву- и однонитевую экзонуклеазные, АТФ-зависимую одно-нитевую эндонуклеазную и АТФ-азную (Karu etai., 1973). Составным ферментов является, по-видимому, и УФнэндонук-леаза, кодируемая генами uvr A, uvr в и uvr с. По данным Сиберга (Seeberg, 1978) ген uvr А и совместно гены uvr в и uvr с кодируют две субъединицы этого фермента. Сложную группу сцепления образует локус xth А. Некоторые мутанты по этому локусу обладают пониженной активностью экзонуклеазы III, но не эндонуклеазы II. В других мутантах подавлены обе эти активности, наконец в третьей группе мутантов отсутствуют активности экзонуклеазы III, эндонуклеазы II и апуриновой эндонуклеазы (Kirtikar et ai., 1976; Waiss, 1976). He исключено, как считает Тарасов (Тарасов, 1982, с.80), что в процессе репарации некоторые белки могут выполнять и регуляторные функции.
Материалы
Для получения лизогенного штамма использовалась стандартная методика выделения чистых клонов (Миллер, 1976). Клетки Е. coii С600 засевали платиновой петлёй в 10 мл L -бульона со свежего газона, инкубировали при 37С 4 часа» Из соответствующего разведения высевали 100 мкл фага А cI857sus08 вторым слоем на газон клеток Ё. coii 0600 из расчета 10-1000 колоний на чашку. Чашки инкубировали при 34С 16-18 часов. Из мутного центра негативной колонии платиновой иглой штрихами (Миллер, 1976) проводили рассев клеток по поверхности агарового слоя чашек Петри. Чашки инкубировали при 34С 16-18 часов. Отдельные колонии клеток далее рассевали штрихами по двум чашкам с агаровым слоем. Чашки инкубировали одну при 34С, другую при 42С 16-18 часов. Для дальнейшей работы отбирали штрихи, давшие рост при 34С, но не при 42С. Материал с этих штрихов еще раз пересевали на твердый агаровый слой. Проверка на наличие в хромосоме Е.СОІІ профага cI857sus08 осуществлялась следующим образом.
Клетки засевали в 10 мл L -бульона, инкубировали при 34С до плотности 0.6 о.е./550 нм (2 10 кл/мл). Отбирали пробу I мл (остальной объем инкубировали еще 3 часа и далее использовали в качестве газона для титрования фага), выдерживали в водяной бане при 42С 5 минут, затем при 34С инкубировали 2 часа, после чего, если наблюдался лизис, проводили титрование на наличие фага 3 cI857sus08 на газонах G600, W3350 и полученных лиэогенных клетках С600 ( cI857susOQ ). Для контроля на эти же газоны высевали фаги исходный З СІ857 sus08 и У- vir LR. Полученные клетки использовали в дальнейшем в качестве лизогенного штамма G600 (0 cI857sus08 ) при условии, что: I) фаг из лизировавшей культуры образовывал на газоне w 3350 колонии с эффективностью на 5-6 порядков меньше, чем на 6600, а на газоне вновь полученного лизогена роста вообще не наблюдалось, 2) вирулентный мутант vir LR (virLvirR) образовывал колонии с одинаковой эффективностью на газона G600 и полученном штамме.
Культуру С600 (!Х cI857sus08) с твердого агара переносили петлей в 10 мл L -бульона, инкубировали 6 часов с аэрацией при 34С, затем по I мл рассевали на 10 чашек вторым слоем. Чашки инкубировали ночь при 34С, при этом на некоторых чашках формировались отдельные фаговые колонии (спонтанные слабовирулентные мутанты). Каждую колонию переносили петлей в 2 мл L-бульона, содержащего 50 мкл хлороформа, затем рассевали на газонах СбОО и 0600 ( СІ857 susOQ) чашки инкубировали ночь при 34С. В случае одинаковой эффективности роста на обоих газонах, отдельные бляшки перекалывали иглой на газоны С600, G600 О СІ857 sus08) и СбОО (jt+). Колонии, растущие с одинаковой эффективностью при 34С на первых двух и не растущие на диком лизогене использовались затем для размножения на чашках и выделения из них методом фагового скрещивания (Horiuchi, Koga, 1969) одно-операторных мутантов.
Чашки инкубировали при 34С. Фаг из бляшек, формирующих мелкие зоны лизиса на С600 Q СІ857 susOg) и нормальные на С600?впоследствии размножали и анализировали на наличие левой операторной мутации титрованием на СбОО и С6 Поскольку фаг A.susN7 не имеет ts -мутаций в CI гене, схема получения правой операторной мутации несколько усложняется. Из мутанта AcI857 susOgVirLR были получены ре-вертанты susOg - о+ высевом на su штаммы V/ 3350. Затем проведено скрещивание по схеме 2 и выделены мутанты с фенотипом susIUvirLR.
Фаг из бляшек, образующий мелкие зоны лизиса на лизоген-ном штамме и нормальные на С600 использовались для размножения и анализа на наличие virR мутации. Клетки w 3350 и С600 (Л cI857suso8) инкубировали с аэрацией в ь -бульоне до одинаковой плотности (1-2 о,е./550 нМ) при 30С, затем смешивали в отношении 1:1 по объему. Полученную смесь культур (газонVG2) использовали в качестве газона для титрования фага по методу агаровых слоев.
Для получения однооператорного мутанта исходный фаг %СІ857 высевали на газон w 3350 из расчета 10-100 фагов на чашку. Чашки инкубировали при 34С в течение 16 часов. Единичные колонии перекалывали платиновой петлей на двойной газон VG2. После 16-часового инкубирования при 34С на чашке вырастали колонии с прозрачным центром и мутной периферией. Отдельную колонию переносили в ТМ-буфер и фаг титровали на газоне w 3350. Чашки инкубировали 16 час при 37С, затем колонии перекалывали платиновой иглой на газоны из культур W 3350 и G600 ( cI857sus08) и инкубировали чашки 16 час при 34С.
Фаг из колонии, образующих мелкие зоны лизиса на С600 ( % cI857sus08) газоне и нормальные на W3350, в дальнейшем размножали и анализировали на наличие virR мутации.
Обсуждение
Следующий этап работы представлен циклом экспериментов по выбору оптимальных условий обработки мутагеном специфического белково-нуклеинового комплекса ДНК/РНК-полимеразы.
В условиях реакции (рН 5.0, 37С, 0.5 М раствор реагента) длительное инкубирование белково-нуклеинового комплекса может привести к неспецифической модификации дак в локально денатурированных участках,спонтанно образующихся в произвольном месте ДНК. Это, в свою очередь, приведет к нежелательным последствиям - инактивации и неконтролируемым мутациям. Поэтому выбор оптимального времени обработки является чрезвычайно важным моментом. Для решения этого вопроса мы воспользовались тем обстоятельством, что алкилпроизводные гидроксиламина в реакции с белково-нуклеиновым комплексом образуют в качестве промежуточных соединений обратимые ковалентные сшивки ДНК-белок, обозначенные на рис. 9 цифрой У (Киселева и др., 1977). Исследование ШГА-инактивации различных фагов, проведенные в работе (Андроникова и др., 1974), показали, что на фоне общей экспоненциальной инактивации наблюдаются экстремумы, где количество биологически активного фага обратимо уменьшается в 5-Ю раз.
В работах (Скляднева и др., 1970; Киселева и др., 1977) было показано, что экстремумы инактивации связаны с обратимым образованием, по-видимому, ковалентних сшивок ДНК с внутренними белками и белками фагового капсида. ДНК-белковые комплексы наблюдались при разрушении обработанного ШГА фага Сд нагреванием в присутствии додецилсульфата натрия и меркап-тоэтанола. Последующая обработка фаговых белково-нуклеиновнх комплексов реагентом приводила к распаду ковалентних связей ДНК-белок.
В работах другой группы авторов (Преображенская и др.» 1976) при исследовании инактивации фага Сд ШГА экстремумы наблюдать не удалось. Мы предположили» что противоречивость экспериментальных данных этих групп авторов может быть связана с тем, что в указанных работах авторы исследовали различные препараты фагов.
При длительном хранении очищенного препарата фага Л , от нескольких недель до нескольких месяцев, в стандартных условиях происходит деградация фагового капсида (Granbou lan, 1979), что приводит к дестабилизации фага и выходу ДНК из капсида. Наличие свободной ДНК должно приводить к агрегации фаговых частиц посредством опутывания нитью ДНК отдельных фагов. Это легко показать, обрабатывая суспензию фага ДНКазой»
При инкубировании свежего препарата фага в присутствии ДНКаэы происходит незначительное увеличение в І.ЗІ0.2 раза биологически активных фаговых частиц по сравнению с контролем. В препарате, хранившемся в течение 6 месяцев при 4С перед использованием, количество биологически активного фага после такой обработки возрастает в 3.2±0.6 раза. Электронномикро-скопические данные выявляют наличие агрегации фага в этом препарате за счет освободившейся ДНК (фото 1-2).При определении количества биологически активных фаговых частиц такой агрегат может адсорбироваться на одной клетке и тестироваться как одна частица. Обработка ДНКазой разрушает агрегат и количество биологически активных фаговых частиц возрастает. Средняя степень агрегации в данном случае составляет 3.2 фага на агрегат.
Установив факт деградации препарата фага в процессе хранения» мы исследовали кинетику инактивации свежего (далее I), хранившегося не более 1-2 недель, и старого (далее II), хранившегося более б месяцев при 4С перед использованием.препаратов фага (рис. 13).
При обработке препарата II фага наблюдаются ярко выраженные экстремумы на фоне общей инактивации (рис. 13 б). Экстремумы инактивации на I препарате фага можно пронаблюдать только при малом интервале отбора проб (не более 2 мин). Уже 5-минутный интервал между точками сглаживает тонкие эффекты обратимой инактивации. Этот факт позволяет пренебречь эффектами обратимой экстремальной инактивации при больших интервалах отбора проб из инкубационной смеси с I препаратом фага (см. рис. II) и для сравнения скорости инактивации на различных штаммах проводить линейную аппроксимацию экспериментальных точек.
Видимо, одной из причин, по которой экстремумы не наблюдали авторы в работе (Преображенская и др», 1976), является большой временной интервал между экспериментальными точками. В этой работе авторы указывают на то, что проводили исследование разных партий фага Сд, к сожалению, без указания конкретных их различий.
Наличие ковалентной (во всяком случае,достаточно сильной) связи ДНК-белок в экстремуме инактивации, опосредованной действием реагента, и отсутствие такой связи вне экстремума должно по разному сказаться на устойчивости фагового белково-нуклеинового комплекса.
