Введение к работе
Актуальность проблемы. К настоящему времени белки нашли широкое применение в различных отраслях промышленности, медицине и для научных исследований. Поскольку белки используются, как правило, в условиях, отличных от тех, в которых они обычно функционируют, одной из актуальных задач является направленное изменение специфичности их действия, активности, стабильности, или, как в случае белковых вакцин, иммуногенности.
Для создания новых белков или изменения свойств уже существующих используется целый ряд методов. Наиболее важными являются методы проб и ошибок, направленного мутагенеза и управляемой эволюции. Метод проб и ошибок использует статистический мутагенез для получения библиотек мутантных молекул, среди которых проводится поиск белков с необходимыми свойствами. Использование перетасовки генов улучшило результативность метода, позволило в ряде случаев существенно повысить активности биокатализаторов (Williams et al., 2004). Еще в первых работах Фершта с соавторам (Eisenstein, 2004) было показано, что знание структурно-функциональной организации белка позволяет направленным мутагенезом получать молекулы с нужными свойствами. Результативность такого подхода весьма высока, поскольку при его использовании поиск целевых белков проводится среди ограниченного числа вариантов. Однако расшифровка структурно-функциональной организации белка является очень сложной задачей, которая для многих молекул не решена до сих пор. С 1997 г. начал активно развиваться метод управляемой эволюции белков (Holmberg et al., 2005). Для его реализации необходимо установить химическую или физическую связь между геном и продуктом его экспрессии. Для таких целей в настоящее время широко используется любой из вариантов дисплея. Затем проводится дивергенция гена методами статистического мутагенеза и среди полученной библиотеки отбираются нужные варианты с помощью соответствующих методов селекции.
Поскольку одним из наименее трудоемких вариантов получения белков с нужными свойствами является направленный мутагенез молекул с известной структурно-функциональной организацией, основной целью нашей работы явилось совершенствование методов расшифровки структурно-функциональной организации и применение полученных знаний для создания белковых молекул с новыми свойствами.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования -разработка рациональной методологии направленного изменения белков и ее применение для получения мутантных у-интерферонов. Для ее достижения необходимо было решить следующие задачи:
Создать эффективные методы направленного мутагенеза.
Обосновать стратегии применения статистического мутагенеза для картирования функциональных районов белковой молекулы.
Разработать стратегии получения стабильных белков направленным мутагенезом по нефункциональным районам молекул.
Создать методы усиления иммуногенных свойств белков путем слияния тестируемого белка с у-интерфероном.
Научная новизна. Предложена рациональная методология получения искусственных белков, основанная на знании их структурно-функциональной и доменной организации. Основными направлениями при ее реализации являются: сокращение числа остатков лизина, аргинина в нефункциональных участках, введение дополнительных связей между субъединицами белковой молекулы, междоменное слияние. В рамках предложенной методологии разработаны эффективные методы локализованного мутагенеза и стратегия определения структурно-функциональной организации белка, основанная на использовании библиотек мутантных генов с множественными мутациями, полученными либо в результате локализованного мутагенеза по всему гену, либо по консервативным последовательностям в неструктурированных участках белковой молекулы.
Впервые на примере у-интерферона человека продемонстрирована возможность повышения у молекулы белка протеолитической стабильности, растворимости, снижения образования телец включения путем частичной замены аргининовых и лизиновых аминокислотных остатков, не входящих в состав функциональных сайтов молекулы.
Для лейкоцитарного и иммунного интерферонов показана возможность получения вариантов белков с новыми свойствами путем междоменного слияния. Доказано, что слияние доменов у-интерферона и сла-боиммуногенного альфа-фетопротеина человека (AFP) приводит к стимуляции высокого уровня гуморального ответа на AFP.
Впервые экспериментально доказано, что высокая мутагенность 4-аминооксибутиламина обусловлена его взаимодействием с остатками цитозина в ДНК и устойчивостью модифицированного цитозина к ферментам репарации. В результате реакции образуется N4-(4-aMH-нобутокси)-дезоксицитидин, способный индуцировать С->Т транзи-ции. Синтезирован новый мутаген Ш-(4-аминобутокси)-дезоксицити-дин-5'-трифосфат, который включается при синтезе ДНК in vitro как вместо dCTP, так и dTTP. В первом случае индуцируются G-»A, а во втором - A-*G транзиции. Разработаны три варианта локализованного мутагенеза с использованием 4-аминооксибутиламина: введение G-»A транзиции в район, комплементарный модифицированному олигонук-леотиду; введение С->Т транзиции в одноцепочечные участки ДНК дуплексов обработкой их аминооксибутиламином; введение G-»A и A-»G транзиции при включении №-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин-5'-трифосфата в ходе синтеза ДНК in vitro. Предложенные методы локализованного мутагенеза были использованы для получения библиотек мутантных генов «2- иу-интерферонов человека, содержащих мутации как по всей длине гена, так и в отдельных его районах.
Впервые исследованы мутагенные свойства олигонуклеотидов, содержащих пирофосфатное, фосфамидное (этилендиамин, 2,6-диамино-гексановая кислота, гексаметилендиамин) звено. Индуцируемые мутации предопределены нуклеотидной последовательностью олигонукле-отида, но присутствие в его структуре пирофосфатного или гексамети-лендиаминового звена наиболее сильно (в несколько раз) повышает выход мутантов. Доказано, что мутации возникают в ходе репарации промежуточного гетеродуплекса ДНК, включающего олигонуклеотид-мутаген.
Практическая значимость. В результате проведенных исследований получен ряд аналогов лейкоцитарного и иммунного интерферонов, на которые оформлены авторские свидетельства и патенты.
Аналоги у-интерферона - дельтаферон, эсферон, а также биферон -обладают протеолитической стабильностью, высокой активностью, на их основе разрабатываются новые иммуномодулирующие лекарственные препараты.
Разработанная стратегия определения структурно-функциональной организации белков отличается универсальностью и может быть применена в молекулярной биологии, вирусологии, микробиологии, биотехнологии, белковой инженерии и других областях биологии для решения широкого круга задач, связанных с определением структурно-функциональной организации белковых молекул.
Созданные методы локализованного мутагенеза 4-аминооксибути-ламином и К4-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин-5'-трифосфатом могут использоваться везде, где требуется получить мутантные микроорганизмы, гены или белки.
Предложенная методология создания искусственных белков может быть положена в основу конструирования новых ферментов, цитоки-нов и других белковых молекул. Например, принцип повышения про-теолитической стабильности молекул путем сокращения числа остатков лизина, аргинина в нефункциональных районах был успешно применен при разработке устойчивого к протеазам аналога фактора некроза опухоли (Корепанова и др., 1994).
Положения, выносимые на защиту:
Библиотеки мутантных генов с множественными мутациями могут быть использованы для определения функционально важных остатков экспрессируемых ими белков. Остатки, замена которых встречается исключительно в инактивированных молекулах, как правило, входят в состав функциональных центров. Роль остатков, встречающихся и в инактивированных, и в активных молекулах, невозможно определить анализом библиотек белков с множественными мутациями.
Консервативные мотивы в петлевых участках белковых молекул содержат функционально важные остатки.
Замена лизина, аргинина в нефункциональных участках белковой молекулы повышает ее протеолитическую стабильность, уменьшает образование телец включения в ходе биосинтеза.
Введение остатков с отрицательно заряженными боковыми группами в соседние а-спирали гидрофобного ядра белка не влияет в целом на его пространственную структуру, но повышает ее стабильность и может привести к усилению удельной активности.
Гибридный белок IFN-AFP, включающий домен у-интерферона, вызывает более сильный гуморальный иммунный ответ, чем его отдельные составляющие.
Модифицикация олигонуклеотидов 4-аминооксибутиламином индуцирует G-»A замены в комплементарных районах ДНК, а обработка одноцепочечных участков ДНК приводит к появлению С-»Т транзиций.
Синтезированный Ж-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин-5'-три-фосфат включается in vitro в ходе синтеза комплементарной цепи ДНК-полимеразами вместо тимидина или цитидина и индуцирует транзиций G->A или A-*G.
Достаточно введения всего лишь одного пирофосфатного или гексаметилендиаминового звена в олигонуклеотид для повышения его мутагенных свойств в несколько раз.
В ходе олигонуклеотид-направленного мутагенеза по схеме Зол-лера-Смита мутации индуцируются преимущественно по репарационному пути и рядом расположенные неспаренности могут удаляться независимо друг от друга.
Апробация результатов диссертации и публикации. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции «Итоги и перспективы теоретических, практических и клинических исследований по проблеме интерферона» (Тбилиси, 1985), Всесоюзном съезде микробиологического общества «Достижения микробиологии - практике» (Алма-Ата, 1985), Всесоюзной конференции «Новые направления в биотехнологии» (Пущино, 1988), Всесоюзном совещании «Молекулярные механизмы мутагенеза» (Новосибирск, 1988), Всесоюзном совещании по НК-дуплексам (Киев, 1989), на I Всесоюзной конференции «Геном человека» (Переяславль-Залесский, 1990), Международном симпозиуме «Synthetic oligonucleotides: problems and frontiers of practical application» (Москва, 1991), Международном симпозиуме по белковой инженерии «Seventh International symposium on metabolism and enzymology of nucleic acids including gene and protein engineering» (Братислава, 1991), Международной конференции «Medical biotechnology immunization and AIDS» (Ленинград, 1991), Всесоюзной конференции «Современные аспекты применения интерферонов и других иммуномодуляторов» (Киев, 1991), Всероссийской отчетной конференции по направлению «Белковая инженерия» (Москва, 1993), на семинаре кафедры природоведения Университета Братиславы (Братислава, 1993), на семинаре Университета г. Виттен (Германия, 1995), Международной конференции «The 26th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, ISOBM 1998» (Швеция, 30 августа-4 сентября 1998), а также на научных конференциях ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово Новосибирской области, с 1984 г.).
По материалам диссертации опубликовано 48 работ.
Работа выполнена в 1984—1999 гг. в ГНЦ ВБ «Вектор» в рамках научно-технических тем и государственных научно-технических программ: «Новейшие методы биоинженерии», «Ген-направленные биологически активные вещества»; по гранту РФФИ № 96-04-49-426 «Структурно-функциональный анализ эукариотического белкового фактора (eRFl), контролирующего освобождение полипептидных цепей в рибосомах при трансляции» (1996-1998 гг.).
На разных этапах в работе принимали участие О.Ю. Смирнова, Р.Ю. Цивковский, М.Ш. Азаев, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ, а также Н.Н. Карпышев, А.М. Ерошкин, Г.П. Кищенко, В.А. Куличков, Г.А. Кузьмичева, Л.Н. Семенова, Г.Ф. Сиволобова, П.И. Поздняков, Г.В. Кочнева, А.А. Граж-данцева, О.И. Серпинский, В.М. Блинов, А.Н. Болдырев, Л.И. Карпенко, А.И. Закабунин, Л.Р. Лебедев, В.И. Масычева, Е.Д. Даниленко, В.А. Иванисенко и другие сотрудники ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» - автор приносит им искреннюю благодарность.
Особую признательность автор выражает д.б.н. профессору В.А. Петренко, который был инициатором исследования структурно-функциональной организации лейкоцитарного интерферона, уделял много внимания развитию работы на всех ее последующих этапах, а также академику РАН профессору Л.Л. Киселеву и д.б.н. Л.Ю. Фроловой, которые привлекли внимание автора к проблеме структурно-функциональной организации эукариотического фактора терминации трансляции, предоставили возможность работы с этим белком, впервые выделенным ими, и всесторонне исследовали свойства полученных мутантных факторов терминации, наконец, сыграли решающую роль в подготовке результатов работы к публикации.
Автор также хотел бы выразить признательность академику РАН профессору Л.С. Сандахчиеву и Т.Н. Шубиной, без чьей поддержки он не смог бы приступить к исследованиям в области применения направленного мутагенеза для получения новых белков.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, главы «Материалы и методы», трех глав, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждение, и выводов. Работа изложена на 263 страницах, включая 13 таблиц и 66 рисунков. Список литературы из 471 наименования включает 60 отечественных работ.
