Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1.Искусственная эволюция белков 10
1.1.1. Цели и задачи искусственной эволюции белков 11
1.1.2. Искусственная эволюция белков методами случайного мутагенеза 14
1.1.2.1. Радиационный и химический мутагенез 14
1.1.2.2. Метод подверженной ошибкам ПНР 15
1.1.3. Искусственная эволюция белков методами направленного мутагенеза 16
1.1.3.1. Сайт-специфический мутагенез 16
1.1.3.2. Сайт-сосредоточенный мутагенез 17
1.1.3.3. Мутагенез рандомизированными олигонуклеотидами 17
1.1.4. Искусственная эволюция белков, основанная на рекомбинационных методах мутагенеза 22
1.1.4.1.Метод перетасовки ДНК 22
1.1.4.2. Метод геномной перетасовки 25
1.1.4.3. Метод прерывистой элонгации 26
1.1.4.4. Случайное образование химерных молекул на временной матрице 27
1.1.4.5. Гетеродунлекс 28
1.1.4.6. Сборка соответствующих олигонуклеотидов 28
1.1.4.7. Мутагенная и однонаправленная повторная сборка 29
1.1.4.8. Метод экзонной перетасовки 30
1.1.4.9. Негомологичная рекомбинация 31
1.2. Аллостерические ферменты 32
1.2.1. Аллостерическая регуляция 32
1.2.2. Ретроингибирование 34
1.2.3. N-ацетилглутамат-синтетаза 36
1.2.4. N-ацетилглутамат киназа 39
1.2.5. Карбамоилфосфат синтетаза 40
1.2.5.1. Механизм действия CPSase 40
1.2.5.2. Аллостерическая регуляция CPSase 44
1.2.5.3. Регуляция транскрипции оперонасагАВ 46
Глава 2. Материалы и методы 48
2.1.Бактериальные штаммы 48
2.1.1. Конструирование штамма B7::argA-ral3::argGH 48
2.2. Среды и условия культивирования штаммов 49
2.2.1. Условия культивирования штаммов TG1, В16-4, В3083 и В6969 49
2.2.2. Условия культивирования штаммов-продуцентов оротовой кислоты и аргинина 49
2.3. Эксперименты с рекомбинантной ДНК 50
2.3.1. Генно-инженерные методики 50
2.3.2. Конструирование плазмиды pUCl 8-argI 52
2.3.3. Конструирование плазмиды pKK-argA-wt 53
2.3.4. Конструирование плазмиды pM!V-5-Pi-argA-ml3 53
2.3.5. Конструирование плазмиды pMIV-5-PrargGH 54
2.3.6. Конструирование плазмиды pET-Piac 55
2.3.7. Конструирование плазмиды pEL-carAB-wt 55
2.3.8. Конструирование малокопийных плазмид, содержащих гены сагАВ 56
2.4. Создание библиотек мутантных генов 56
2.4.1. Создание библиотеки мутантных argA генов 56
2.4.2. Создание библиотеки мутантных сагВ генов 57
2.5. Отбор активных мутантов , 59
2.5.1. Отбор вариантов, синтезирующих активную NAGS в клетках Е. соН штамма TG1 59
2.5.2. Отбор вариантов, синтезирующих активную NAGS в клетках E.coliBl 6-4...59
2.5.3. Отбор вариантов, синтезирующих активную CPSase 59
2.6. Выделение и очистка белка NAGS 60
2.7. Измерение ферментативных активностей 62
2.7.1. Анализ ферментативной активности мутантных NAGS 62
2.7.2, Анализ ферментативной активности мутантных CPSase 63
Глава 3. Результаты и обсуждение 65
3.1. Метод комбинаторного мутагенеза 65
3.2. Получение мутантов N-ацетилглутамат синтетазы 68
3.2.1. Конструирование рандомизированной библиотеки генов argA 68
3.2.2. Селекция "активных вариантов" мутантных ферментов NAGS в клетках E.coli штамма TG1 69
3.2.3. Селекция мутантных ферментов NAGS в клетках E.coli штамма В16-4 69
3.2.4. Активности мутантных ферментов в клеточных экстрактах 70
3.2.5. Очистка и кинетические свойства мутантных NAGS 72
3.2.6. Применение полученных fbr-мутантов NAGS в процессе создания штамма-продуцента аргинина 77
3.3. Применение метода комбинаторного мутагенеза для изменения аллостерической регуляции карбамоилфосфат синтетазы из Е. coli 78
3.3.1. Конструирование библиотеки мутантных генов сагВ 79
3.3.2. Селекция fbr мутантов CPSase 80
3.3.3. Применение полученных Пэг-мутантов CPSase в процессе конструирования штамма-продуцента оротовой кислоты 85
3.3.4. Применение полученных fbr-мутаитов CPSase в процессе конструирования штамма-продуцента аргинина 87
Выводы 90
Список литературы 91
- Искусственная эволюция белков, основанная на рекомбинационных методах мутагенеза
- Условия культивирования штаммов-продуцентов оротовой кислоты и аргинина
- Селекция мутантных ферментов NAGS в клетках E.coli штамма В16-4
- Применение полученных Пэг-мутантов CPSase в процессе конструирования штамма-продуцента оротовой кислоты
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
В настоящее время аминокислоты приобрели огромное промышленное значение. Область их применения необычайно широка, от использования в качестве компонентов пищевых добавок до создания на их основе лекарственных форм и разнообразной косметики. Современное производство аминокислот исчисляется миллионами тонн в год, а совокупный объем продаж - миллиардами долларов. Очевидно, что стремительно развивающийся рынок аминокислот и продуктов, созданных на их основе будет требовать адекватного увеличения их производства (Bongaerts et al., 2001). На сегодняшний день практически безальтернативным способом массового производства большинства аминокислот является их микробный синтез. Эффективность этого биотехнологического процесса во многом зависит от характеристик используемого бактериального штамма-продуцента. В процессе его конструирования необходимо решать множество задач, связанных с различными сторонами жизнедеятельности бактерий. К ним можно отнести оптимизацию экспрессии генов биосинтеза целевой аминокислоты, энергетическое обеспечение биосинтеза, повышение эффективности транспорта в клетку питательных веществ и экспорта целевой аминокислоты в культуральную жидкость, и т.д.
Одним из важнейших аспектов общей стратегии создания штаммов-продуцентов аминокислот и других биогенных молекул является модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов их биосинтеза. Частный случай аллостерической регуляции, ретроингибирование, является одним из основных способов контроля скорости биосинтеза аминокислот и других биогенных молекул. Этот процесс основан на принципе отрицательной обратной связи, когда продукт биосинтетической цепи подавляет активность фермента, катализирующего первую стадию. Как правило, подобной регуляции подвержены ферменты, катализирующие практически необратимые биохимические реакции. Перераспределяя потоки ключевых молекул между клеточным метаболизмом и синтезом данного вещества (например - аминокислоты или нуклеотидов) в зависимости от его концентрации, эти белки выполняют функцию своеобразных "метаболических клапанов", обеспечивающих клеточный гомеостаз.
Очевидно, что для создания высокоэффективных штаммов-продуцентов аминокислот необходимо конструирование таких мутантньгх белков, аллостерическое иигибирование которых конечными продуктами реакций было бы нарушено {fbr, feed back resistance фенотип). Как правило, fbr фенотип фермента достигается как результат замены одного аминокислотного остатка на другой в одном или нескольких сайтах белковой последовательности.
Поиск и идентификация fbr мутантов всегда являлось достаточно трудоемкой задачей. Эти мутации обычно возникают спонтанно при благоприятных для этого условиях и соответствующей системе отбора (Vyas and Maas, 1963; Гаврилова и соает., 1988; Di Girolamo et ah, 1988). С другой стороны, основываясь на анализе трехмерной структуры белка, можно вводить те или иные замены аминокислотных остатков, изменяя его кинетические характеристики. Однако, современный уровень понимания структурно-функциональных связей в белках пока еще недостаточен для проведения успешного рационального дизайна ферментов и полученные таким образом мутанты имеют существенно более низкую удельную активность по сравнению с ферментом дикого типа (например, в случае мутантов фермента SAT, Nakamori et ah, 1998; мутантов пантотенат киназы, Rocket at, 2003; мутантов префенат дегидротазы, Hsu et ah, 2004).
Таким образом, получение ферментов со снятым ретроингибированием и одновременным сохранением его основных кинетических параметров во многом определяется экспериментальным везением. В этой связи, весьма актуальной представляется задача разработки новых методологических подходов к проблеме получения модифицированных аллостерических ферментов с заданными функциональными параметрами.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
Целью данной работы являлись разработка метода комбинаторного мутагенеза и его применение для модификации аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы (NAGS) и карбамоилфосфат синтетазы (CPSase) из Е. coli.
В ходе работы были решены следующие задачи; разработка метода эффективного направленного мутагенеза, позволяющего получать "библиотеку" мутантных генов, кодирующих белки, которые различаются по нескольким аминокислотам в одном заданном участке аминокислотной последовательности; получение fbr мутантов NAGS, обладающих высоким уровнем удельной активности и исследование их основных кинетических параметров; получение fbr мутантов CPSase, нечувствительных к ингибированшо UMP и обладающих высоким уровнем удельной активности; применение модифицированных ферментов в процессе создания штаммов-продуцентов аргинина и оротовой кислоты на основе Е. coli.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ
Разработана оригинальная методика эффективного направленного мутагенеза (метод комбинаторного мутагенеза), позволяющего получать библиотеку генов, кодирующих представительную выборку белков, различающихся по нескольким аминокислотам в одном специфическом участке,
Впервые была показана возможность применения данного метода для получения не подверженных ретроингибированию ферментов; NAGS и CPSase из Е. coli. В каждом случае из совокупности мутантных белков удалось отобрать ферменты с заданными свойствами без использования специальных методов селекции.
На примере NAGS показано, что предложенный подход позволяет получать серию мутантов с измененными в широком диапазоне основными кинетическими параметрами ферментов (К.м, Vmax). Полученная коллекция мутантных белков может быть использована для дальнейших экспериментов по изучению их структуры и функций.
Впервые показано, что представленная методика может быть эффективно использована при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот (нуклеотидов) на этапе оптимизации экспрессии генов аллостерических ферментов, что нашло отражение в соответствующем патенте.
Искусственная эволюция белков, основанная на рекомбинационных методах мутагенеза
Метод подверженной ошибкам ПЦР (error-prone PCR) основан на проведении амплификации целевого фрагмента с помощью полимеразной цепной реакции, при которой искусственно повышается вероятность встройки ошибочного, то есть некомплементарного нуклеотида. Одна из наиболее часто используемых методик проведения подверженной ошибкам ПЦР заключается в частичной замене ионов Mg2+ меньшим количеством ионов Мп2+, в условиях несбалансированных количеств различных дезоксинуклеозидтрифосфатов (Cadwell and Joyce, 1994; Cirino et al, 2003). Частота мутаций может меняться в зависимости от концентрации ионов Мп + и числа циклов амплификации. Как правило, реакционные смеси подобраны так, что чтобы частота мутаций была около 10"3. Введение в реакционную смесь аналогов дезоксинуклеозидтрифосфатов может повысить частоту мутаций на два порядка (Zaccolo et al., 1996).
Примерами удачного применения этого метода могут служить работы по получению чувствительных к понижению температуры мутантов фактора инициации трансляции IF1 Escherichia coli (Croitoru et al, 2004); мутантов липазы из Pseudomonas aeruginosa с повышенной амидазной активностью (Fujii et al, 2005); устойчивых к щелочным условиям мутантов ксиланазы (Shibuya etal, 2005); мутантних бежов IspA (famesyl diphosphate (FPP, С15) synthase Escherichia coli) с повышенной удельной активностью {Lee et al, 2005). Изучение всей совокупности полученных мутантов позволило исследователям лучше понять механизм действия ферментов, особенно если эти мутации попадали в консервативные участки белка.
В 1993 г. была вручена Нобелевская премия К.Мюллису и М.Смиту за разработку метода сайт-специфического (олигонуклеотид-направленного) мутагенеза (site-directed mutagenesis). Благодаря появлению этого метода произошел кардинальный пересмотр стратегий мутагенеза, поскольку ранее исследователям приходилось тратить много времени на поиск среди мутагенизированных химическими агентами рекомбинантных клонов тех, что содержали именно нужный вариант. Принцип сайт-специфического мутагенеза заключается в отжиге на клонированном фрагменте ДНК специально синтезированного олигонуклеотида, подобранного так, что в его средней части должен находиться измененный (желаемый) нуклеотид, отличающийся от комплементарного тому, что находится в исходной последовательности. Сайт-специфический мутагенез позволяет одновременно заменять не только единичный нуклеотид или их группу, но и образовывать делецию или, наоборот, вставку из нескольких нуклеотидов, причем их протяженность может быть довольно большой и зависит, главным образом, от общей длины синтезированного олигонуклеотида.
Поскольку частота «полезных» мутаций часто существенно ниже, чем «вредных», на каждом этапе мутагенеза удается отобрать очень немного белков с улучшенной функцией. При этом методики, основанные на введении точечных мутаций, обычно ограничены несколькими циклами мутагенеза и имеют небольшую эффективность и скорость эволюции. Следовательно, для более быстрой и эффективной эволюции необходимо использовать не единичные, а множественные мутации. На данный момент описано множество методик введения в искомый белок и даже организм множественных направленных мутаций, некоторые из которых будут рассмотрены далее.
Сайт-сосредоточенный мутагенез (site-saturation mutagenesis) - это метод мутагенеза, являющийся логическим продолжением сайт-специфического мутагенеза. Метод введения мутаций вполне аналогичен предыдущему, за исключением того, что синтезированный олигонуклеотид является частично вырожденным. Это позволяет вводить в последовательность белка не конкретную аминокислотную замену, а получать целый спектр мутантных белков, имеющих в интересующем исследователя положении любой из возможных аминокислотных остатков (O Donohue and Kneak, 1996). Использование для синтеза библиотеки мутантных генов нескольких частично вырожденных олигонуклеотидов позволяет получать мутантные белки, имеющие несколько аминокислотных замен в заранее выбранных сайтах (Airaksinen andHovi, 1998).
Метод нашел широкое применение для получения различных мутантных белков, в частности он использовался для получения штамма Neisseria gonorrhoeae, более устойчивого к пенициллину и тетрациклину (Olesky et ah, 2002), мутантных вариантов р-глюкоронидазы (GUS) Escherichia coli с увеличенной р-галактозидазной активностью (Geddie and Matsumura, 2004) и многого другого .
Метод мутагенеза рандомизированными олигонуклеотидами (random oligonucleotide mutagenesis) - один из самых распространенных методов искусственного ускорения эволюции белков (Sneeden and Loeb, 2003). Это метод используется для получения большого количества разнообразных мутантов, различающихся по нескольким аминокислотным остаткам в специфическом участке гена. Мутации в этом случае кодируются рандомизированным синтетическим олигонуклеотид ом. Количество мутаций в индивидуальном белке определяется длиной и степенью рандомизации мутагенизированного олигонуклеотида в процессе синтеза фрагмента гена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Sneeden and Loeb, 2003).
Этот метод имеет ряд преимуществ. Во-первых, с помощью этого метода мутации вносятся случайно, но в специфический, выбранный исследователем участок гена. Также метод позволяет быстро получать большое количество разнообразных вариантов белка, отличающихся только структурой выбранного региона. Если введение точечной мутации, как правило, позволяет определить только влияние данной аминокислотной замены на свойства фермента, введение множественных замен при наличии соответствующей системы отбора может позволить исследователю отобрать белок с заданным фенотипом. Такие библиотеки могут найти применение в исследованиях роли конкретных аминокислотных участков в структуре фермента или при поиске мутантов с новыми свойствами, отсутствующими в природе.
Степень рандомизации выбранного участка гена может быть различной. При полной рандомизации участка белка длиной, например, 5 аминокислотных остатков (15 нуклеотидов) получается 415 (109) различных нуклеотидных последовательностей, около 25% из которых кодируют содержащие стоп-кодоны белки. Мы получаем 205 (3 200 000) различных аминокислотных последовательностей (только одна из которых является последовательностью дикого типа). Технически сложно проверить такое количество разнообразных вариантов, поэтому исследователи, как правило, или ограничиваются небольшой выборкой мутантных вариантов, или уменьшают степень рандомизации.
Так как конструирование библиотеки со 100% рандомизацией часто приводит к появлению большого количества нефункциональиых белков (в особенности, если это касается высоко консервативных областей белка), то в некоторых случаях представляется целесообразным проводить частичную рандомизацию выбранной последовательности. Для библиотек с заданной частотой нуклеотидных замен (р) относительно просто может быть вычислено ожидаемое среднее количество аминокислотных замен A (Suzuki et а!., 1996):
Условия культивирования штаммов-продуцентов оротовой кислоты и аргинина
Синтез карбамоилфосфата состоит из четырех отдельных химических реакций: фосфорилирование бикарбоната с получением карбоксифосфата; гидролиз глутамина до глутамата и аммония; взаимодействие аммония и карбоксифосфата с получением карбамата; фосфорилирование карбамата с получением карбамоилфосфата. Исследования кристаллической структуры CPSase Е.соїі позволили предположить, что сайт связывания глутамина расположен внутри малой субъединицы, в то время как каталитические сайты фосфорилирования бикарбоната и карбамата локализованы внутри большой субъединицы (Thoden et ah, 1997; Thoden et al, 1999a). Однако те же исследования показали, что эти активные сайты физически разделены в пространстве и расстояние между ними составляет около 100 А. Следовательно, существует механизм транспортировки аммония и карбамата внутри белковой глобулы от одного активного сайта к другому {Raushel et al, 1998b; Holden et al, 1998; Raushel et al, 1999).
Аммоний, полученный в реакции гидролиза глутамина в активном сайте малой субъединицы, может перемещаться по туннелю и надлежащим образом реагировать с карбоксифосфатным интермедиатом, сформированном в активном сайте фосфорилирования бикарбоната, находящимся на большой субъединице. Карбаматный интермедиат может перемещаться по второй части этого туннеля в другой АТР-связывающий сайт на большой субъединице, где подвергается фосфорилированию.
Такая туннельная модель перемещения интермедиатов аммония и карбамата полностью согласуется с результатами биохимических исследований свойств фермента. Эксперименты с меченым аммонием ( NH3) и немеченым глутамином однозначно показали, что аммоний, получающийся в результате гидролиза глутамина, не покидает внутреннего пространства белковой глобулы и его дальнейшие превращения проходят без диссоциации от малой субъединицы с последующей ассоциацией с большой субъединицей {Huang and Raushel, 2000а). Так как ионы NH/ не могут быть субстратами для синтетазной реакции (Cohen et al, 1985; Rubino et al, 1986), зависимость активности фермента от рН также свидетельствует об изоляции связанного с ферментом NH3 от основной массы растворителя, что является дополнительным аргументом в пользу существования внутримолекулярного туннеля между двумя субъединицами, Отсутствие изотопного обмена между кислородом и его тяжелым изотопом О во всех углеродсодержащих интермедиатах (карбоксифосфате и карбамате) на всем протяжении реакции синтеза карбамоилфосфата также свидетельствует о полной изоляции этих интермедиатов от окружающей среды и не подверженности их гидролизу (Raushel et ah, 1998a). Более того, время полураспада для карбамата при нейтральных рН составляет всего 70 мс {Wang et ah, 1972), что делает крайне маловероятной возможность его диссоциации от первого сайта фосфоршшрования и последующей реассоциации со вторым сайтом фосфоршшрования большой субъединицы, Это также подтверждает существование внутримолекулярного туннеля между двумя активными сайтами большой субъединицы.
Некоторые эксперименты позволяют предположить существование альтернативного пути к сайту фосфоршшрования бикарбоната при использовании внешних источников азота. Например, эксперименты по определению молекулярных механизмов действия внутримолекулярного туннеля для интермедиатов реакции синтеза карбамоияфосфага показали, что в мутантных ферментах, имеющих аминокислотные замены Gly359Tyr и Gly359Phe в малой субъединице, происходит блокирование действия канала для аммония (Huang and Raushel, 2000b). В то время как в ферменте CPSase дикого типа гидролиз одной части глутамина и двух частей АТР однозначно приводит к дальнейшему образованию одной части карбамоилфосфата, в полученных мутантах процесс гидролиза АТР и глутамина не сопровождается получением карбамоилфосфата. Однако, при полной неспособности к использованию глутамата для синтеза карбамоилфосфата, эти мутанты были способны синтезировать карбамоилфосфат, используя в качестве источника азота внешний аммиак. В то же время мутантный фермент CPSase Е. coli, имеющий две аминокислотные замены Gln273Glu и Leu270Lys в малой субъединице белка, был практически неспособен к гидролизу глутамина, но способен утилизировать свободный аммоний, что показывает существенность именно этих аминокислотных остатков для амидотрансферазной активности белка (Saeed-Kothe and Powers-Lee, 2002).
Аллостерическая регуляция фермента осуществляется посредством связывание орнитина, IMP и UMP с соответствующими сайтами, расположенными в карбокситерминальной области большой субъединицы белка, аминокислотные остатки которой образуют 5 параллельных р-слоев (Rubio et ah, 1991; Cervera et ah, 1996; Thoden et ah, 1997 Thoden et ah, 1999a).
Показано, что орнитин связывается с участком на поверхности между аллостерическим и карбамоилфосфат-синтезирующим доменами. А-аминогруппа этого соединения расположена около От ТугЗ 040 в аллостерическом домене, в то время как 5-аминогруппа орнитина расположена в пределах 3,0 А от карбоксилатных групп аминокислотных остатков Ghi783 и Glu892 и кислорода Asp791, которые принадлежат к карбамоилфосфат-синтезирукщему домену. Более того, было показано взаимодействие карбоксилатной группы орнитина с обоими атомами азота и атомом 0у в аминокислотном остатке Тугі 042.
Первоначально IMP был описан как активатор CPSase, a UMP как ингибитор (Boettcher and Meister, 1981; Boettcher and Meister, 1982; Kasprzak and Villqfranca, 1988), однако Braxton и соавторы показали, что действие IMP зависит от температуры (Braxton et al, 1992). При высоких температурах наблюдается активация CPSase IMP, в то время как при низких температурах активность фермента в присутствии данного вещества уменьшается. Было показано существование единственного сайта связывания молекул мононуклеотидфосфатов (рис, 1.6) и их конкурентное влияние на активность фермента. В то же время орнитин и один из мононуклеотидфосфатов могут связываться с ферментом одновременно, хотя активациониое действие орнитина полностью доминирует над ингибирующим влиянием UMP или IMP (Braxton et al, 1999). Сайт связывания этих мононуклеотидфосфатов находится полностью внутри аллосгерического домеиа. Регуляторные свойства IMP и UMP обусловлены рядом водородных связей, возникающими между связанным в аллостерическом сайте IMP (UMP) и аминокислотными остатками, примыкающими к сайту фосфорилирования карбамата. Так как этот интермедиат является нестабильным, даже небольшие изменения в геометрии данного активного сайта являются существенными для активности фермента.
Было показано также, что два аминокислотных остатка, серии 948 и треонин 1042 оказываются существенными для аллостерической регуляции фермента (Delannay et al, 1999). Замена Ser948Phe в CarB приводит к нечувствительности фермента (/&г-феногипу) к IMP и UMP, а активация орнитином сохраняется, хотя и в меньшей степени. Замена Thrl042Ile приводит к существенному снижению активации орнитином, но фермент остается чувствительным к UMP и IMP, хотя действие этих регуляторов уменьшается. Обе мутации расположены в области, находящейся между сайтами связывания для орнитина и для UMP/IMP, следовательно, могут воздействовать иа эффективность связывания регуляторов с этими сайтами.
Селекция мутантных ферментов NAGS в клетках E.coli штамма В16-4
В основе метода комбинаторного мутагенеза лежит идея о возможности компенсировать негативное влияние одной аминокислотной замены на активность фермента за счет одновременного изменения нескольких соседних аминокислотных остатков (Птицын Л. Р. и соавт., 1998). Количество варьируемых аминокислот зависит от конкретного белка и должно определяется опытным путем или на основе структурного анализа исследуемого белка (если это возможно).
С методической точки зрения, для реализации данного метода необходимо уметь эффективно вводить множественные мутации в заданный участок структурной части гена. При этом, необходимо получить представительную библиотеку фрагментов ДНК с рандомизированным локусом, удобную для последующего клонирования. Схема предложенного нами оригинального решения этой задачи представлена на рисунке 3.1.
На первом этапе синтезируется специальный олигшуклеогидный праймер PI (точнее - библиотека праймеров, однако далее, для краткости, мы будем использовать выражение-праймерРІ), первичная структура которого состоит из трех элементов: 1 - полностью (или частично) рандомизированный участок структурной части гена, кодирующий варьируемые аминокислотные остатки; 2 и 3 - 5 и 3 - фланкирующие олигонуклеотидиые последовательности полностью гомологичные участкам гена, непосредственно примыкающим к варьируемому локусу. Например, структура типичного праймера для варьирования 5 аминокислотных остатков выглядит следующим образом (5 -15H.-15N-20H.-3 ) Используя библиотеку праймеров Р1 и олигонуклеотид Р2, проводят синтез библиотеки фрагментов ДНК содержащих рандомизированный локус (рисунок 3.1, I стадия ПНР). Как правило, в структуру праймера Р2 вводится последовательность уникального сайта рестрикции с целью последующего клонирования. Начальные концентрации матричной ДНК и праймеров PI, Р2 выбираются таким образом, чтобы к концу ПЦР практически все праймеры были израсходованы, а количество синтезированного фрагмента (в молях) превосходило количество матричной ДНК не менее чем в 10 раз. При этом, очевидно, должна быть обеспечена представительность синтезированной библиотеки ДНК фрагментов. Например, упомянутой выше библиотеке PI (5 -15H.-15N-20H.-3 ) соответствует степень вырождения - 415 =1Дх 10 . Таким образом, в реакционной смеси должно присутствовать не менее (а реально, -существенно больше) 10 молекул матричной ДНК (0,002 пмоль) с тем, чтобы обеспечить равновероятный отжиг всех возможных вариантов олиго-праймера в каждом цикле ПЦР. Например, если в качестве матричной ДНК используется вектор размером 5 т.п.н., то в реакцию необходимо добавить как минимум 7 нг плазмидной ДНК.
На втором этапе, одна из цепей амплифицированного фрагмента используется в качестве праймера для амплификации библиотеки одноцепочечных молекул ДНК, содержащих структурную часть гена с рандомизированным участком (рисунок 3.1, II стадия ПЦР). Для амплификации используется реакционная смесь, полученная на предыдущей стадии. Как правило, проводят 10 -20 дополнительных циклов, используя "холодный отжиг" (Т отжига = 37 С).
Время достройки выбирают таким образом, чтобы пролонгировать синтез одно цепочечной ДНК как минимум до 5 -конца структурной части гена или (если это возможно) - до ближайшего уникального сайта рестрикции.
На последнем этапе проводят амплификацию библиотеки ДНК- фрагментов, содержащих структурную часть гена с рандомизированным участком и фланкированных уникальными сайтами рестрикции (рисунок 3.1 III стадия ПЦР). Поскольку в этом случае происходит одновременное праймирование как модифицированной одноцепочечной ДНК, так и интактной матричной ДНК, то в результирующей реакционной смеси будут присутствовать ДНК фрагменты, соответствующие исходному гену. Именно поэтому, на первом этапе амплификации необходимо получать 10 и более - кратный избыток амплифицированного фрагмента по отношению к матричной ДНК. Это позволяет минимизировать представленность интактного гена в полученной библиотеке.
Наличие уникальных сайтов рестрикции позволяет легко клонировать полученную совокупность фрагментов ДНК в подходящий экспрессионный вектор. В результате получают совокупность плазмид, кодирующих мутантные белки со случайными аминокислотными заменами в строго определенном участке, которые могут быть использованы для дальнейшего отбора функциональных мутантов.
Полная рандомизация нуклеотидного фрагмента гена кодирующего N аминокислотных остатков соответствует библиотеке из 4 генов кодирующих 20 различных вариантов белков. Простой подсчет показывает, что уже при N=4 общее число клонов, включающих в себя полный объем библиотеки рандомизированных белков, составляет около 1,6x10 , что создает трудности при их анализе. С другой стороны, интуитивно понятно, что чем больше рандомизированный участок, тем больше вероятность добиться хорошего компенсаторного эффекта за счет увеличения вероятности "взаимогашения" негативных влияний варьируемых аминокислотных остатков. Таким образом, выбирая N достаточно большим, мы с одной стороны, увеличиваем вероятность создания комбинации аминокислотных остатков дающих компенсаторный эффект, а с другой - уменьшаем вероятность обнаружить эту комбинацию из-за возможности анализа только небольшой выборки рандомизированных генов. Однако достаточно большой опыт применения метода комбинаторного мутагенеза в нашей лаборатории показал, что при N=5 (3 200 000 вариантов белка), достаточно лишь небольшой выборки "активных вариантов" модифицированного белка (порядка 102 -Ю3), чтобы получить фермент с заданным уровнем удельной активности. Термин "активные варианты" в данном случае обозначает мутантные белки, продукция которых способна комплементировать делецию соответствующего интактного гена в штамме реципиенте.
В качестве первого объекта для модификации методом комбинаторного мутагенеза в данной работе был использован фермент NAGS из Е, соН, катализирующий первую реакцию в пути биосинтеза аргинина.
Ретроингибирование этого фермента аргинином создает серьезные проблемы на пути создания высокоэффективного штамма-продуцента этой аминокислоты. Ранее были локализованы две fbr мутации (HislSTyr, Tyrl9Cys) NAGS, присутствие которых существенно снижало удельную активность фермента (Rajagopal et a!., 1998). Целью нашей работы было получить fbr мутант NAGS с высокой удельной активностью методом комбинаторного мутагенеза.
Конструирование рандомизированной библиотеки генов argA проводили согласно методу комбинаторного мутагенеза, как описано в Материалах и Методах (см. разд. 2.4.1.). В качестве матрицы была использована плазмида pUC19-ArgA, несущая интактный ген argA, а в качестве праймеров олигонуклеотиды PI: 5 -cgagggattccgcblNNNNNNNNNNNNNNatcaatacccaccggg-3 , частично комплементарный последовательности гена argA; 2, комплиментарный последовательности плазмидного вектора расположенной downstream относительно структурной части гена argA и РЗ; 5 gccatggtaaaggaacgtaaaacc-3 5 гомологичный 5 -концу последовательности гена argA,
Применение полученных Пэг-мутантов CPSase в процессе конструирования штамма-продуцента оротовой кислоты
Другие полученные варианты CPSase были полностью нечувствительны к использованной концентрации UMP, но их удельная активность была в 2 - 4 раза меньше, чем активность фермента дикого типа. Более того, введение различных мутаций в район 947-951 а.о. в определенной степени изменяло субстратную специфичность мутантных белков к источникам аммония. Уровень синтеза СР мутантними CPSase при замене 5 мМ Gin как источника аммония на 200 мМ (NH4)2S04 снижался в 2 - 7 раз в зависимости от последовательности аминокислотных остатков в участке 947-951 а.о. мутантного фермента. Эти данные также показывают, что несмотря на некоторое изменение сродства к свободному аммиаку у разных вариантов CPSase, ферменты используют его в качестве субстрата в среднем примерно на два порядка менее эффективно, чем глутамин.
Для исследования влияния присутствия мутаций на устойчивость белка к деградации клеточными протеазами (как произошло с мутантом NAGS-rll) мы проанализировали представленность различных мутантных белков СагВ в соответствующих клеточных экстрактах штамма В6969 (pEL-carAB-NN) (рис. 3.7, А). На рисунке 3.7,В представлен пример сканирования дорожки электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS на денситометре CDC-2000 (Beckman, USA). Так как сканирование различных дорожек геля с клеточными лизатами штамма В6969, содержащего рекомбинантные плазмиды не выявило существенных изменений концентрации СагВ в клеточных экстрактах, можно предположить, что мутации в районе 947-951 а.о. в анализированных препаратах не влияют на устойчивость мутантных белков к протеолитической деградации.
Селекция среди множества вариантов, несущих замены аминокислотных остатков в непосредственной близости от ранее идентифицированной мутации Ser948Phe, позволила отобрать варианты мутантных белков, обладающих высокой активностью и сохраняющих fbr фенотип. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют, что фрагмент белка от 947 до 951-го аминокислотного остатка ответственен не только за ингибироваиие активности CPSase UMP и уровень ее каталитической активности, но мутации в этом регионе приводят также к определенному изменению субстратной специфичности белка (к глутамину или аммонию).
Несмотря на то, что при селекции мутантных CPSase был проведен скрининг около 1% теоретически возможных вариантов, нам удалось получить несколько высокоактивных fbr вариантов фермента, значительно превосходящих по каталитическим свойствам известный ранее мутант Ser948Phe. Полученные белки были нечувствительны к ингибированию UMP, а уровень их удельной активности был близок к уровню активности CPSase дикого типа.
Синтез СР является ключевой стадией для биосинтеза пиримидиновьгх нуклеотидов de novo (см. рис. 1.4.). Первым пиримидиновьш нуклеотидом в этой цепочке является оротидиловая кислота, декарбоксилирование которой приводит к образованию уридиловой кислоты (уридин монофосфата). UMP служит предшественником цитидиловых нуклеотидов, причем в E.coli соответствующее превращение происходит на уровне трифосфатов, сначала из UMP образуется UTP, аминирование которого приводит к возникновению СТР.
Мы попытались оценить влияние экспрессии одного из полученных fbr мутантов фермента, CPSase-34, на синтез оротовой кислоты в соответствующем штамме-продуценте. Экспрессионные ппазмиды pMW-carAB-wt и pMW-carAB-34 кодирующие последовательности CPSase-wt и CPSase-34 были сконструированы на основе малокопийного вектора pMW119, как описано в Материалах и Методах (см. разд. 2.3.8.). Данными плазмидами трансформировали штамм E.coli К-12 В8085 - продуцент оротовой кислоты.
Штамм В8085, устойчивый к аналогу пиримидиновых нуклеотидов, 6 азаурацилу (1 мг/мл), был получен методом мутагенеза нитрозогуанидином из штамма E.coli К12 argA::Tn\0. Как правило, устойчивость к 6-азаурацилу приводит, с одной стороны, к появлению мутантов со снятым ретроингибированием ферментов пути биосинтеза пиримидииов, а с другой - к усилению транспорта этих веществ из клетки. Следовательно, устойчивость к этому веществу позволяет говорить о активировании пути биосинтеза пиримидинов, а инактивация гена argA дает возможность использовать весь синтезированный СР для их биосинтеза.
Результаты ферментации в пробирках штаммов, производных В8085, (в присутствии уридина для увеличения внутриклеточной концентрации UMP) приведены в Таблице 3.7 (концентрацию оротовой кислоты оценивали с помощью ВЭЖХ). Введение десенсибилизированного мутанта CPSase-34 привело к существенному повышению синтеза целевого вещества. Видно, что при ферментации штамма B8085(pMW-carAB-34), несущего плазмиду с мутантньтм геном сагВ-34, концентрация оротовой кислоты в 2,5-5 раз больше, чем в исходном штамме B8085(pMW119) или в штамме B8085(pMW-carAB-wt), содержащем плазмиду с геном carB-wt. При этом экспрессия мутантных CPSase не токсична для рекомбииантных клеток, так как оптическая плотность культур существенно не снижалась.
Так как оротовая кислота является прямым предшественником пиримидиновых нуклеотидов, входящих в состав нуклеиновых кислот, ее соли рассматриваются, как вещество анаболического действия и применяются в фармацевтике при нарушениях белкового обмена, как общие стимуляторы обменных процессов {Степура и соавт., 2002; Classen, 2004). Обычно применяют калиевую или магниевую соли оротовой кислоты в сочетании с другими средствами (витаминами и др.) при заболеваниях печени, дистрофии миокарда, прогрессирующей мышечной дистрофии. Калия оротат применяют также для улучшения анаболических процессов при напряженных физических нагрузках,
В свете этих данных штамм-продуцент оротовой кислоты может использоваться не только как родительский штамм при создании продуцентов пиримидиновых нуклеотидов, но и иметь самостоятельное практическое значение для микробиологической промышленности.
Похожие диссертации на Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом комбинаторного мутагенеза
