Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Взаимодействие матричной РНК с рибосомами 12
1.1.1. Введение 12
1.1.2. Условия комшюксообразования и стабильность комплексов 13
1.1.3. Взаимодействие мРНК с 16 S РНК 15
1.1.4. Роль белка S1 в процессе взаимодействия мРНК с рибосомой 17
1.1.5. Взаимодействие мРНК с рибосомными белками 23
1.1.6. Количественное изучение взаимодействия синтетических и естественных матриц с рибосомами 27
1.1.7. Выводы 33
1.2. Роль гипермодифицированных оснований, расположенных с 3*-стороны антикодона тРНК, в процессе биосинтеза белка 35
1.2.1. Введение 35
1.2.2. Роль гипермодифицированных оснований в амино-ацилировании и во взаимодействии с EF-Tu фактором 36
1.2.3. Влияние модификации 3'-соседнего основания антикодона на взаимодействие комплементарных оли-гонуклеотидов с антшсодоном тРНК 37
1.2.4. Влияние модификации 3'-соседнего антикодону основания на, взаимодействие тРНК с комплементарными антикодонами 38
1.2.5. Влияние гипермодифицированного основания на взаимодействие тРНК с рибосомами 43
1.2.6. Неспособность модифицированных оснований образовывать пары Крика-Уотсона 47
1.2.7. Модифицированные основания участвуют в связывании иона магния, расположенного в антикодоновой петле тРНК 48
1.2.8. Выводы 52
1.3. Заключение. Задачи данного исследования 54
Глава II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДИКИ 56
2.1. Выращивание клеток для выделения рибосом и тРНК 56
2.2. Выделение рибосомальных субчастиц 57
2.2.1. Выделение неочищенных 70 S рибосом 57
2.2.2. Выделение рибосомальных 30S и 50S субчастиц .. 57
2.3. Выделение фракции суммарных аминоацил-тРНК синтетаз 58
2.3.1. Выделение фракции суммарных аминоацил-тРНК син-тетаз из E.coll 58
2.3.2. Выделение фракции суммарных аминоацил-тРНК син-тетаз из дрожжей 61
2.4. Выделение транспортной РНК 62
2.4.1. Выделение немеченной тРНК 62
2.5. Препаративное аминоацилирование тРНК 64
2.5.1. Препаративное аминоацилирование тРНК из E.coll 64
2.5.2. Препаративное аминоацилирование тРНК из дрожжей 64
2.6. Обогащение фенилаланил-тРНК из Е. со 11 64
2.7. Обогащение фенилаланил-тРНК из дрожжей 65
2.8. Обогащение фенилаланил-тРНК из дрожжей, лишенной Y-основания 68
2.9. Химический синтез N -ацетил- Phe-тРНК 71
2.10. Выделение фракции поли(и) со средней молекулярной массой 30 000 дальтон 71
2.11. Выделение фракционированной [ Н] поли(и) .... 72
2.12. Выделение рибосомного белка S1 и 30S субчастиц , обедненных по этому белку 73
2.13. Связывание [Н]поли(и) с 30 S субчастицами и 70S рибосомами 74
2.14. Измерение связывания тРНК с рибосомами 77
Глава III. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОЛИУРИДИЛОВОЙ КИСЛОТЫ С 30S СУБЧАСТИЦАМИ И 70S РИБОСОМАМИ Escherichia coll 79
З. I. Цель исследования 79
3.2. Причины гетерогенности комплекса субчастица 80
3.3. Измерение изотермы адсорбции [ Н] поли(и) с белком S1 83
3.4. Влияние внешних условий на стабильность комплекса [ЗОБсубчастица + поли(и )] 3.5. Связывание [Н]поли(U ) с 70S рибосомами .... 93
3.6. Влияние канамицина на взаимодействие [ Н] поли( U ) с 70S рибосомами 99
3.7. Обсуждение результатов 99
3.8. Выводы НО
Глава ІV. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ АМИНОАЦИЛ-И ПЕПТИДИЛ-тРНК С Р САЙТОМ 70 S РИБОСОМ Escherichia coll 112
4.1. Цель исследования 112
4.2. Взаимодействие Phe-тРНК^ ,. и N -ацетил- E.COIL Phe-тРНК ;, ,. с Р сайтом рибосом E.coli
4.2.1. Дискриминация связывания аминоацил-тРНК и пептцдил-тРНК с А и Р сайтами 70 S рибосом ИЗ Phe
4.2.2. Измерение констант ассоциации 70S-TPHK и N -ацетил- Phe-тРНК е с Р сайтом 70 S рибосом 116
4.3. Связывание Phe-тРНК+у и N-ацетил-PheтРНК±уЄ с рибосомами E.coli 121
4.3.1. Взаимодействие Phe-TPHK±yC с 30S субчастицами 121
4.3.2. Дискриминация связывания Phe-тРНК+у и N -ацетил- Phe-тРНК +у с А "и Р сайтами 70 S рибосом 123
4.3.3. Измерение констант ассоциации Phe -тРНК+у и N -ацетил- Phe-тРНК ±у с Р сайтом 70 S рибосом 127
4.4. Обсуждение результатов 138
4.5. Выводы 145
ОБЩИЕ ВЫВ0ДД 147
ПРИЛОЖЕНИЕ 150
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 152
- Взаимодействие матричной РНК с рибосомами
- Выращивание клеток для выделения рибосом и тРНК
- Причины гетерогенности комплекса субчастица
- Взаимодействие Phe-тРНК^ ,. и N -ацетил- E.COIL Phe-тРНК ;, ,. с Р сайтом рибосом E.coli
Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование процесса биосинтеза белка в рибосомах является одной из фундаментальных проблем молекулярной биологии. К настоящему времени выяснены основные этапы этого процесса, их последова.тельность, но многие его аспекты остаются до сих пор неразрешенными. В частности, далеки от ясности такие вопросы как: высокая точность трансляции, механизм транслокации вновь образованной пептидил-тРНК из аминоацильного (А) сайта в пептидилышй (Р) сайт. Очевидно, что понимание молекулярных механизмов такого сложного процесса как биосинтез белка невозможно без количественного изучения кинетики и термодинамики взаиглодействия основных его участников, то есть тРНК, мРНК и рибосомы.
Основная цель работы состояла: во-первых, в количественном изучении взаимодействия одной из наиболее часто используемых в бесклеточных системах матрицы - поли(и) с 30 S субчастицами и 70S рибосомами E.coli , то есть в измерении констант ассоциации поли(и) с 30S субчастицами и 70S рибосомами при различных внешних условиях и влияния на них рибосом-ного белка Si ; во-вторых, в исследовании кодон-зависимого взаимодействия различных видов аминоацил- и пептидил-тРНК с Р сайтом 70S рибосом и выяснении роли модифицированного 3»-соседа антикодона - Y -основания в кодон-антикодоновом взаимодействии.
Научная новизна результатов и практическая ценность работы. Взаимодействие матрицы с рибосомой - важный этап как в процессе инициирования синтеза, определения начала и фазы считывания матрицы, так и при элонгации, при строго дискретной транслокации матрицы в каждом акте синтеза пептидной свя- -га- зи на три нуклеотида. Однако в литературе подробные термодинамические данные о взаимодействии матрицы с рибосомами имеются только для коротких олигонуклеотидов, для натуральных же и синтетических матриц значительной длины (более 40 нук-леотидов), достаточной для взаимодействия со всей областью связывания мРНК на рибосоме, имеются только фрагментарные сведения.
В настоящей работе впервые измерены константы ассоциации поли(и) с 30S субчастицами и 70 S рибосомами Escheria-chia coll при различных внешних условиях и определены термодинамические параметры взаимодействия этой матрицы с рибосомой. Показано, что главной причиной гетерогенности комплекса [ 30S субчастица + поли(и)] по стабильности является присутствие или отсутствие в субчастицах рибосомного белка S1 Обнаружено сильное влияние ионной силы на взаимодействие по-ли(и) с 30Sсубчастщшли и 70S рибосомами, что свидетельствует о существенном вкладе электростатических взаимодействий в этот процесс. Полученные количественные данные позволили оценить электростатическую и "неэлектростатическую" компоненты свободной энергии образования комплекса [поли (и) + рибосома]. Установлено, что 50 S субчастица в составе полной рибосомы не вносит существенного вклада во взаимодействие рибосомы с матрицей.
Исследовано кодон-зависимое и безматричное взаимодействие различных видов аминоацил- и пептидил-тРНК с Р сайтом 70S рибосом, что позволило дать количественную оценку вклада. Y -основания в эти взаимодействия. В отличие от модельных кодон-антикодоновых взаимодействий вне рибосомы, удаление Y -основания не приводит к сильному изменению энтальпии комплексообра- - II - зования, что, по-видимому, свидетельствует о непосредственном взаимодействии самого Y -основания с гидрофобным центром Р сайта рибосомы.
Бее перечисленные результаты получены впервые. Практическое и теоретическое значение работы заключается в том, что выяснен целый рад деталей механизма взашлодействия мРНК и тРНК с рибосомой, что делает более завершенной общую схему биосинтеза белка.
Взаимодействие матричной РНК с рибосомами
Конечным этапом в реализации генетической информации в клетке является процесс трансляции. Суть трансляции . заключается в сборке белковой макромолекулы из отдельных аминокислот, последовательность которых задается последовательностью нуклеотидов матричной РНК. Этот сложный многоступенчатый процесс происходит на рибосомах и вовлекает в себя множество компонентов: мРНК, тРНК, аминокислоты, аминоацил-тРНК синтетазы, белковые факторы трансляции, АТФ, ГТФ. Трансляцию можно разбить на ряд основных стадий (инициирование, элонгация, терминация), в которых участвуют те или иные компоненты белоксинте зирующей системы.
Взаимодействие матричной РНК с рибосомами, являющееся одним из основных этапов биосинтеза белка, происходит во время процесса инициирования. В настоящее время этот процесс подробно охарактеризован (см. ряд недавних обзоров и статей /1-5/): изучены последовательность событий при инициировании, компоненты, принимающие участие в образовании ишщиаторного комплекса. Очевидно, что знание величин и природы сил взаимодействия мРНК с рибосомой является важным моментом в изучении процесса биосинтеза белка. Однако энергетические характеристики взаимодействия как всей матрицы, так и ее отдельных частей (в частности, инщиаторной области), с рибосомой не определены. В настоящей работе глы предприняли попытку определить эти величины для поли(и), синтетической матрицы, широко используемой при изучении механизма биосинтеза белка in vitro
Поскольку в задачи данной работы входит количественное изучение взаимодействия поли (и ) с Jos субчаствдами и 70s рибосомами E.coli и роли белка si в этом процессе остановимся более подробно на условиях образования комплексов [мРНК + рибосома] и факторах, влияющих на стабильность этих комплексов.
Условия комплексообразования и стабильность комплексов.
Рибосомы Eschericha coli связывают естественные МРНК и многие синтетические полинуклеотиды при концентрации ионов магния 5 10 М и выше /6-9/. Когда рибосомы представлены в молярном избытке над полинуклеотидом, то образуются полирибосомы, то есть к одному полинуклеотиду оказывается прикреплено несколько рибосом. Участок для связывания мРНК расположен на 30S субчастице, поскольку, отдельно взятая, она способна взаимодействовать с мРНК, в отличие от os субчастицы /8-Ю/.
Вторичная структура мРНК препятствует связыванию последней с рибосомами. Так, полинуклеотиды, обладающие ярко выраженной вторичной структурой (ПОЛИ(Ї?Т ), поли (А), поли(ли ), рибосомальная РНК),весьма слабо или вообще не связываются с рибосомами, в отличие от хорошо связывающихся полинуклеоти-дов со слабой вторичной структурой (поли(и), поли(С), поли (ис ) /8,11/. Однако, когда вторичная структура разрушается обработкой формальдегидом, они оказываются способны взаимодействовать с рибосомами /8/. С другой стороны, мРНК фага Т4 /12/, вирусные РНК /13/ и многие другие естественные матрицы, обладающие некоторой вторичной структурой, также связываются с рибосомами в отсутствие факторов инициации.
Выращивание клеток для выделения рибосом и тРНК
Рибосомы выделяли из клеток E.coli MRE-600, тРНК из клеток Е.coll В . Штаммы хранили на агаровом столбике, клетки сначала пересевали на наклонный агар (косяк), который готовили на максимальной среде, содержащей аминопептид, разбавленный физиологическим раствором в три раза, а с него в небольшой объем ростовой среды, которая віл содержала: 30 г Na2 НР04 12 Н20, 3 г КН2Ю4, I г Ш4СЄ , 0,2 г MgS04, 0,5 г NaCe , 10 г глюкозы и 100 мл аминопептида. рН среды был 7,5. Растили ночь в термостате при 37 С. Затем аликвоты по 100 мл инокули-ровали в 5 бутылей по 15 л с той же средой. Культуру растили в теплой комнате при 37 С с аэрацией. Концентрацию клеток периодически измеряли на спектрофотометре (I ед. А д соответствует I09 іслет/мл). Период генерации культуры при 37 С был равен 30 мин.
При достижении поздней логарифмической фазы аэрацию прекращали, и культуру медленно охлаждали в течение 1-2 часов до 15 С, чтобы не было возможности инициации синтеза новых полипептидных цепей, в то время как синтезирующиеся цепи достраиваются до конца /154/. Следовательно, рибосомы уже в клетке оказываются свободными от пептидил-тРНК и мРНК. Затем клетки собирали в пасту, ресуспендировали в буфере: 0,02 М трис-НС2 рН 7,5; 0,01 М MgCB2 ; 0,1 М NH4C для отмывки от остатков питательной среды, и снова центрифугировали. Далее клеточную пасту замораживали порциями по 15 г в жидком азоте. Из 15 л культуры получали около 60 г клеток.
Поскольку взаимодействие матричной РЕПС с рибосомами обратимо/13-15/, процесс образования двойного комплекса [30S субчастица + поли (и)] должен описываться изотермой Лэнгмюра
где п - среднее количество молекул поли(и), связанных с одной 30Sсубчастицей, [и] - концентрация поли(и) в растворе, N -количество сайтов для поли(и) на одной субчастице, Ка - константа ассоциации поли (и) с 30 S субчастицей. В обратных координатах зависимость между 1/п и 1/Си] должна быть линейной.
По пересечению прямой с осью абсцисс можно найти N , а из ее наклона - I/N Ка и, следовательно, К&.
Однако, экспериментально получаются нелинейные зависимости 1/п от I/Cu], которые хорошо апроксимируются комбинацией двух типов комплексов с различной стабильностью доли субчастиц, образующих два типа комплек т сов, а Ка и Ка - константы ассоциации для соответствующих-комплексов. Проведя касательную к экспериментальной кривой в обратных координатах в области 1/[иЗ—««», можно найти К и N2 , а затем,, вычитая из экспериментальной зависимости стабильную компоненту, определить Kg и N, /90/.
На рис.3.I, А (кривая I) приведена зависимость 1/п от I/CU] для стандартного препарата 30 S субчастиц, которая ап-роксимируется двумя типами комплексов с N, =0,43, N2= 0,57, К = 1,5 -її)6 м"1, к = 2,3 Ю8 М""1. С каждой 30 S субчастицей связывается, в конечном счете, одна молекула поли (и.),. так как 1/п —- I при I/CU] — -0;_ это подтверждает данные Мура, полученные ранее для 70 S рибосом /172/. При достаточно низких концентрациях поли(и) величину п =1 также можно получить, если добавить [Ї2С] Phe-тРНК (рис.3.1, Б): происходит тРНК-зависимое связывание мРНК. Ранее подобную стимуляцию наблюдали Хатфилд и Ниренберг для случая олигонуклеотидов и аминоацил-тРНК /16/.
Наблюдаемую гетерогенность комплексов можно объяснить тем, что не все 30 S субчастицы in vitro содержат белок S1 который, как известно, необходим для связывания поли(и) /172/, или, более конкретно, увеличивает константу связывания поли(и) с 30S субчастицами /61/. Этот белок никогда не находят в рибосомах в стехиометрических количествах /32,174,175/, он легко обменивается как между рибосомами, так и с белком, находящимся в растворе /176/. Поэтому в зависимости от условий выделения субчастиц на градиентах концентрации сахарозы (концентрации Mg , NH4 , рибосом, величины центробежного ускорения и т.д.) можно получать 30 S субчастицы с сильно различающимся содержанием белка S1 . Например, если 30 S субчастицы выделять аналогично стандартным, но в процессе отделения от 50 S субчас-тиц на градиенте концентрации сахарозы понизить концентрацию NH4CE с 0,5 до 0,2 М, то доля более стабильного компонента возрастает до 80$ (рис.3.I, А, кривая 2).
Взаимодействие Phe-тРНК^ ,. и N -ацетил- E.COIL Phe-тРНК ;, ,. с Р сайтом 70S рибосом E.coli
Ранее было показано, что и пептидил-тРНК, и аминоацил-тРНК имеют большее сродство к Р сайту, чем к А сайту комплекса [70S рибосома + поли (U)] : отношение К / Kg было оценено в 30-50 для пептидил-тРНК и в 10-10 для аминоацил-тРНК /186-188/. При избытке рибосом обе формы тРНК связываются исключительно с Р сайтом /186,188,189/. Исходя из этого ограничения, мы выбрали и соответствующий способ измерения величин К - способ переменного объема, когда соотношение рибосомы/тРНК I поддер-жива.ется постоянным во всех смесях (зависимость I/g от I/r , см. раздел 2.14).
В отсутствие поли(и) N -ацетил- Phe-тРНК связывается только с Р сайтом /186,187/, то же верно и для Phe-тРНК В опыте на. рис.4.1, А после достижения равновесия при 0 С (не показано) температуру повысили и добавили пуромицин. Часть двойного комплекса диссоциировала, при повышенной температуре (-о-), но вся оставшаяся связанной аминоацил-тРНК вступила в реакцию с пуромицином (--). Далее, на. рис.4.1, Б, показано, что, если в отсутствие поли(и) титровать 70S рибосомы [ C]Phe тРНКр"е, то мы видим, что заполняется только один сайт (\) — I, когда с- - » ),причем тетрациклиннечувствительный (-Д-; -А-). В то же время в контрольном опыте - в присутствии поли (и) - . : заполняются оба сайта ( - - 2, когда С- - « , -о-), и тетрациклин ингибирует связывание одной молекулы аминоацил-тРНК (--). Из этих опытов следует, что не только для деацилированной и пепти-дил-тРНК/186Д87/, но и для аминоацил-тРНК, А сайт в отсутствие поли(и) не реализуется, возможно из-за слишком малой величины Р - К . В этом случае мы можем измерять консталты ассоциации с Р сайтом, давая любые соотношения рибосомы/тРНК, для этого удобнее пользоваться методом постоянного объема (зависимость I/NJ от I/C, см. раздел 2.14).
Время (мин.) MC-PhfcRNAPh?nMOAb
Рис.4.1. А. Реакция предварительно связанной [14С]РЬс-тРНКphG с пуромицином в отсутствие поли(и). Инкубационные смеси содержали в 0,2 мл буфера I: ЗОпмоль 30 S субчастиц, 45 пмоль 50 S субчастиц и 10 пмоль [I4C]PhePHKPhc. После 60 минут инкубации при О С температуру повышали до 30 С и рН доводили до 7,5 I М трис (гидроксиметил) аминометаном. Затем в половину смесей добавляли пуроми-цин до конечной концентрации 2ТО"4 М и измеряли кинетики связывания (-о-) и образования [ ClPhe-пуромицина
Б. Титрование комплекса [70S рибосома + поли(и)] [ С]РЬе-тРНК е. Смеси содержали в I мл буфера I: 10 пмоль 30Sсубчастиц, 15 пмоль 50S субчаетиц, 10 мкг поли(ц) и переменное количество [I4C]PhePHKPhe. Инкубацию проводили 90 минут при О С в отсутствие (-о-) или в присутствии (--) тетрациклина, е концентрацией 2 10 u М. В эксперименте без поли(и) объем смеси был 0,2 мл ((-д-) - в отсутствие тетрациклина, (-А-) - в Присутствии тетрациклина).
Измерение констант ассоциации Phe-тРНК и N -ацетил РЬ 2-тРНКРЬс с Р сайтом 70S рибосом. На рис.4.2. показано измерение величин К в отсутствие по ли(и). В этих условиях Р сайты 70S рибосом были активны в связывании различных видов тРНК на 60-90%. Константа ассоциации для пептидил-тРНК, примерно в два раза выше, чем для аминоацил тРНК. Однако, в присутствии поли(и) мы наблкщаем неожиданный р результат: Щ оказалась в 2-3 раза выше для аминоацил-тРНК, чем для пептидил-тРНК (рис.4.2, Б). Это различие намного превышает случайную ошибку в определении констант ассоциации, составляющую обычно 15-20%; систематические ошибки были сведены к минимуму тем, что все измерения были сделаны с одними и теми же препаратами рибосом и тРНК.
