Содержание к диссертации
Введение 7
Методические аспекты процедуры SELEX 8
Аффинность и специфичность аптамеров 11
Химические модификации аптамеров 12
Отличия РНК- и ДНК-аптамеров 14
Аптамер-свяшвающие эпитопы белков и "сложныхмишеней" 14
Структурные особенности аптамеров 16
Структура комплексов аптамеров с мишенями 19
Аптамеры к белкам, взаимодействующим in vivo с нуклеиновыми кислотами 23
Механизмы инициации транскрипции у прокариот 26
Основные события инициации 26
а-факторы прокариот 27
Бактериальные промоторы 27
Строение а-субъединицы, кор- и холофермента прокариотической РНКП 28
Узнавание —35 элемента промотора 29
Узнавание —10 элемента промотора 30
Промоторы с удлинённым —10 элементом 32
Роль а-субъединицы на ранних этапах элонгации 33
Взаимодействие свободной а-субъединицы с ДНК. 34
Применение синтетических ДНК-конструкций для изучения РНК-подимеразы 35
Матрицы с однонитевым «хвостом»....'. 35
Матрицы с расплавленным участком 36
Минимальные нуклеиново-кислотные каркасы 38
Промоторы с нарушениями структуры спирали ДНК 39
Однонитевые ДНК-олигонуклеотиды 40
ДНК-<(вилки» 41
Транскрипция на однонитевых и шпилечных ДНК-структурах 42
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 45
Бактериальные штаммы, плазмиды и антибиотики 45
Электрофорез нуклеиновых кислот в денатурирующем геле 45
Проведение электрофореза белков в ПААГ 46
Выделение кор-фермента РНКП 46
Выделение а-субъединицы РНКП 48
Получение радиоактивно-меченых олигонуклеотидов 49
Получение аптамеров к кор-РНКП .50
Получение аптамеров к а-субъединице РНКП Т. aquaticus 53
Определение нуклеотидной последовательности ДНК. 54
Измерение Кд комплексов олигонуклеотидов с РНКП 54
Измерение кинетики диссоциации комплекса аптамера с РНКП 55
Эксперименты с минимальным нуклеиново-кислотным каркасам 55
Футпринтинг гидроксильными радикалами 56
Получение дцДНКдля проведения экспериментов по транскрипции in vitro 56
Транскрипция in vitro 57
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 59
АПТАМЕРЫ К КОР-ФЕРМЕНТУ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ 59
Получение и общая характеристика аптамеров 60
Влияние а-субъединицы и фактора GreB на взаимодействие аптамеров с кор-ферментом 62
Специфическое и неспецифическое взаимодействие аптамеров с главным каналом РНКП 63
Аптамеры к ст-субъединице РНКП Т. aquaticus 64
Получение и общая характеристика аптамеров 64
Сравнение последовательности аптамеров и бактериальных промоторов 69
Ингибирование синтеза РНК in vitro аптамерами к а-субъединице 70
Взаимодействие аптамеров к изолированной а-субъединице с холоферментом РНКП 71
ДНУНИТЕВАЯ ДНК, С0ДКРЖА1ЦАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ АПТАМЕРОВ К CF-СУБЪЕДИНИЦЕ РНКП Т.
AQUATICUS, ЯВЛЯЕТСЯ ПРОМОТОРОМ НОВОГО ТИПА, СПЕЦИФИЧНЫМ ДЛЯ РНКП Т. AQUATICUS 72
Температурная зависимость активности РИКП Т. aquaticus и Е. coli на аптамерном промоторе73 Активность гибридных холоферментов. Влияние гепарина на активность РИКП на аптамерном
промоторе 15'. 75
Активность холоферментов, содержащих мозаичную сигма-субьединицу Т. aquaticus с районом 2
о^субъединицы Е. coli 76
Роль консервативных элементов аптамерного промотора 18'в инициации транскрипции 78
Транскрипция на однонитевых ДНК аптампрах к а-сУБъедипшш РИКП 79
Роль о-субъединицы при транскрипции на однонитевых аптамерах 81
Транскрипция на однонитевых аптамерах при повышенной ионной силе 82
ВЫВОДЫ 84
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 85
БЛАГОДАРНОСТИ 86
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 87
Список используемых сокращений
BSA - бычий сывороточный альбумин
DTT- дитиотрситол
dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфат
EDTA - этилендиаминтетраацетат
IPTG - изопропил-р-тио-О-галактопиранозид
NTP - рибонуклеозидтри фосфат
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
SDS - додецилсульфат натрия
а.к. - аминокислотный остаток
НК - нуклеиновые кислоты
нт. - нуклеотндов
оцДНК - одноцепочечная ДНК
п.н. - пар нуклеотидов
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразная цепная реакция
Введение к работе
Актуальность темы
РНК-полимераза (РНКП) в процессе синтеза РНК осуществляет специфические и неспецифические контакты с однонитевой и двунитевой ДНК. Изучение функционально важных контактов РНКП с ДНК необходимо для детального понимания процесса транскрипции. В клетках бактерий РПКП присутствует в двух формах. Кор-фермснт обладает каталитической активностью, но не способен к инициации транскрипции. Узнавание промоторов и инициация синтеза РНК осуществляются холоферментом РПКП, который содержит дополнительную а-субъединицу. Несмотря на то, что о играет главную роль в узнавании промоторов, в свободном виде она находится в неактивной конформации и не способна узнавать промотори ые последовательности. Было показано, что в маскировании ДНК-связывающих центров а большую роль иірает N-концевой участок белка. При образовании холофермента происходят структурные превращения о-субъединицы, в результате которых происходит экспонирование её ДНК-связывающих сайтов. Детальные механизмы автоингибирования ДНК-связывающей активности а-субъединицы, а также механизмы конформационньгх перестроек о, происходящих при образовании холофермента и в ходе инициации транскрипции, остаются неизвестными.
В процессе взаимодействия с промотором холофермент сначала узнает ддДПК, после чего происходит плавление ДНК около стартовой точки транскрипции и устанавливаются контакты с оиДПК. Структура контактов РНКП с промоторными последовательностями на разных этапах узнавания промотора остается не изученной. При переходе к элонгации транскрипции контакты с промоторными последовательностями разрываются, происходит диссоциация о-субъединицы. Элонгация транскрипции осуществляется кор-ферментом РНКП. 11а этой стадии полимераза контактирует с ДНК (однонитевой и двунитевой) и РНК в основном сиквенс-неспецифически - эти контакты позволяют ферменту довольно прочно удерживать матрицу и, в тоже время, быстро по ней перемещаться. В процессе этого движения, при добавлении новых нуклеотидов в растущую цепь РНК, а также на стадии терминации фермент претерпевает конформационные изменения, детальные механизмы которых изучены плохо.
Аптамерами называют однонитевые РНК- или ДПК-лиганды к различным мишеням, получаемые направленным отбором из большого числа различных последовательностей. Метод отбора аптамеров заключается в проведении нескольких циклов связывания библиотеки случайных последовательностей с молекулой-мишенью с разделением свободных олигонуклсотидов и комплексов олигонуклсотидов с мишенью и последующей амплификацией связавшихся последовательностей. Было показано, что аптамеры, полученные к белкам, in vivo контактирующим с нуклеиновыми кислотами (ПК), обычно имитируют природные НК-бслковые взаимодействия. Кроме того, аптамеры часто оказываются ингибиторами своих мишеней. Таким образом, аптамеры к РНК-полимеразе могут послужить удобной модельной системой для изучения взаимодействий этого белка с нуклеиновыми кислотами.
Цель работы и задачи исследования
Целью работы являлось получение аптамеров к кор-ферменту и сг-субъединине РНКП и изучение их взаимодействий с РНКП. В работе ставились следующие задачи:
1) Получить ДІ 1К-аптамеры к кор-ферментам РНКП Escherichia coli и Thermus aquaticus, а также к а-субъединице РНКП Thermus aquatkus.
2) Исследовать механизмы узнавания аптамеров кор-ферментом и с- субъединицей РНКП.
Проанализировать действие аптамеров на активность РНКП.
Изучить транскрипционные свойства аптамеров в однонитевом и двунитевом состоянии.
Научная новизна и практическая ценность работы
Получены и охарактеризованы высокоаффинные ДНК-алтамеры к кор-ферментам РНКП Escherichia coli и Thermus aquaticus. Показано, что аптамеры являются эффективными ингибиторами транскрипции, cj-субъединица, а также фактор элонгации транскрипции GreB подавляют связывание аптамеров с РНКП. При помощи аптамеров к РНКП Е. coli показано, что фактор GreB вызывает конформационные изменения кор-РИКП. Получены ДНК-алтамеры, которые взаимодействуют с изолированной <т-субъединицей Т. aquaticus. Аптамеры к с-субъединице содержат последовательность -10 области промотора, окруженную дополнительными консервативными мотивами. Таким образом, впервые показано, что а-субъединица в свободном состоянии способна узнавать промотори ые последовательности ДНК. На основе однонитевых аптамеров к а-субъединице Т. aquaticus получен и охарактеризован двунитевой промотор нового типа, специфичный для РНКП 71 aquaticus. Отобранные в работе аптамеры предполагается использовать в дальнейших структурно-функциональных исследованиях РНКП. Кроме того, результаты работы могут найти практическое применение для создания высокоэффективных промоторов нового типа, а также для получения новых ингибиторов транскрипции.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Эволюция олигонуклеотидов in vitro и аптамеры By this art you may contemplate the variation of the 23 tetters...
Введение
Метод SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) позволяет получать олигонуклеотидные лиганды, обладающие высоким сродством и специфичностью, практически к любой молекулярной мишени. Такие лиганды получили название аптамеров (от лат. aptus - подходить). Метод был придуман в 1990 году Голдом и Шостаком, одновременно и независимо (Tuerk and Gold, 1990; Ellington and Szostak, 1990).
Одноцепочечная нуклеиновая кислота длиной п нуклеотидов может образовывать 4" = Ю0,6п вариантов различных последовательностей. Аптамеры отбираются in vitro из комбинаторной библиотеки олигонуклеотидов, которая содержит обычно около 1015 различных молекул. Последовательность олигонуклеотида определяет его трёхмерную структуру и способность взаимодействовать с другими молекулами. Вполне вероятно, что среди такого многообразия найдется олигонуклеотид, который окажется хорошим лигандом к конкретной молекулярной мишени. Отбор в методе SELEX (эволюция in vitro) состоит из повторяющихся циклов связывания библиотеки с мишенью и амплификации связавшихся последовательностей.
Уникальная трёхмерная структура аптамеров обеспечивает их способность связывать различные молекулы - от неорганических ионов, до сложных белковых комплексов. Сродство и специфичность к некоторым мишеням превышает таковые у моноклональных антител. В данном обзоре предпринята попытка рассмотреть применение метода SELEX в биологических ислледованиях, особое внимание будет уделено получению и свойствам аптамеров к белковым молекулам.
Это искусство позволит вам созерцать различные сочетания из двадцати трёх букв... (англ,) Анатомия меланхолии, ч.2, сект. II, м. IV (X, Л. Борхес, Вавилонская библиотека)
