Введение к работе
Актуальность темы. Многие ДНК-полимеразы (ДНКП) помимо функции синтеза ДНК обладают рядом дополнительных активностей. Все ДНКП способны осуществлять пирофосфоролиз — реакцию обратную полимеризации. Кроме того, у многих полимераз имеется отдельный экзонуклеазный активный центр, осуществляющий 3'—>5'-экзонуклеазную реакцию. Подобная активность описана для прокариотических ДНКП I типа (Joyce and Steitz, 1994) и эукариотических ДНКП 8, б, и С, (полимераза а обладает такой активностью лишь у некоторых видов) (Михайлов, 1999). ДНКП I прокариот обладают также дополнительной 5'—З'-экзонуклеазной активностью, осуществляемой отдельным активным центром.
Клеточные РНК-полимеразы (РНКП) также способны катализировать реакцию пирофосфоролиза. Кроме этого, они обладают эндонуклеазной активностью, которая существенно стимулируется в присутствии белковых факторов GreA и GreB у прокариот (Borukhov et al., 1993) и TFIIS у эукариот (Reines, 1992; Izban and Luse, 1992). Предполагается, что эндонуклеазное расщепление РНК осуществляется в том же активном центре, что и реакции полимеризации и пирофосфоролиза. Для эукариотической РНКП П описана также экзонуклеазная активность, которая как и эндонуклеазная стимулируется белковым фактором TFIIS (Wang and Hawley, 1993). Было показано, что фактор-стимулируемая экзонуклеазная активность РНКП П играет важную роль в процессе коррекции синтеза РНК in vitro (Thomas et al., 1998).
Недавно была обнаружена новая реакция, катализирумая различными ДНК-полимеразами. Реакция заключается в выщеплении З'-концевого нуклеотида растущей цепи ДНК в присутствии относительно высоких концентраций некомплементарных r/dNTP либо r/dNDP (например, величина Кт в этой реакции для rATP ~ 1.6 мМ), с образованием, соответственно, динуклеозид-5',5"-тетра- и -трифосфатов (Meyer et al.,1998; Sosunov et al., 2000).
Механизм этой реакции, названной нами реакцией псевдопирофосфоролиза, по-видимому, аналогичен механизму реакции пирофосфоролиза; при этом в роли пирофосфата выступают сцР-фосфаты стимулирующего NDP, либо р,у-фосфаты стимулирующего NTP:
5'-...pNpNpNpN'oH+ ppp(r/d)N" * 54.^^^ + (^)1^-5444^-5^ 5'-...pNpNpNpN'oH + pp(r/d)N" -» 5'-...pNpNpN0H + (гМ)М"-5'-ррр-5'->Г
:. НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА J С Петербург г/, . I
ОЭ ?М- "
Предполагается, что эта реакция лежит в основе механизма резистентности вируса иммунодефицита человека (HIV) к азидотимидину (AZT) - нуклеозидному ингибитору обратной транскриптазы HTV (HTV RT). Показано (Meyer et al., 1999), что HIV RT, содержащие замены, обусловливающие устойчивость вируса к AZT in vivo, существенно эффективней, чем фермент дикого типа, выщепляют 3'-концевой терминирующий остаток AZTMP ДНК-праймера в присутствии высокой концентрации АТР и смеси четырех природных нуклеозидтрифосфатов; при этом происходит разблокирование праймера и продолжение синтеза ДНК.
Кроме этого, роль реакции псевдопирофосфоролиза может заключаться в коррекции синтеза ДНК, что особенно важно для ферментов, не обладающих корректирующей 3'—б'-экзонуклеазной активностью (например, обратные транскриптазы ретровирусов, в том числе и HIV RT, эукариотические ДНКП а, р и другие).
Для РНКП реакция псевдопирофосфоролиза не известна. Поиск подобной реакции для РНКП интересен, особенно с точки зрения возможного ее участия в процессе коррекции синтеза РНК.
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы являлся поиск и выяснение механизма реакции нуклеотид-зависимой деградации РНК, катализируемой мультисубъединичной клеточной РНКП JE coli. В работе ставились следующие задачи:
Выяснить, являются ли субстратами для ДНК- и РНК-полимераз продукты реакции псевдотфсфхфоролиза-дввуклеозвд-5\5"-три-итетрафосфаты.
Поиск реакции нуклеотид-зависимой деградации РНК для РНКП coli и, в случае ее обнаружения, выяснение детального механизма этой реакции.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе продемонстрировано, что динуклеозид-5'Д"-три- и -теграфосфаты, являющиеся продуктами реакции псевдопирофосфоролиза, могут служить субстратами для четырех классов ДНК-полимераз -обратных транскриптаз (HTV RT), ДНКП аир эукариот (ДНКП аир человека), прокариотических ДНКП I типа (ДНКП Rcoli и T.aquaticus). Наиболее эффективными субстратами для всех ДНКП оказались динуклеозид-5*,5"-тетрафосфаты. Для HTV RT субстратная активность этих соединений оказалась близкой к активности соответствующих dNTP, в то время как для остальных ферментов они были в той или иной степени менее эффективными, чем dNTP. Показано также, что динуклезид-5',5"-тетрафосфахы являются субстратами для РНКП фага Т7 и мультисубъединичной РНКП Ecoli, при этом их эффективность'оказалась сопоставимой с эффективностью соответствующих NTP. Таким
образом, в работе обнаружен новый класс субстратов для ДНК- и РНК-полимераз -динуклеозид-5',5"чмшгофосфаты.
Продемонстрировано, что РНКП Е. соН обладает 3'—б'-экзонуклеазной активностью, которая существенно стимулируется в присутствии некомплементарных r/dNTP. То есть, в отличие от ДНКП, в случае РНКП 3'-концевой нуклеотидный остаток растущей цепи РНК в присутствии некомплементарных r/dNTP выщепляется не в виде динуклеозид-5',5"-тетрафосфата, а в виде нуклеозид-5'-монофосфата.
Показано, что для проявления этой активности необходимы два иона Ме2*, координированных в активном центре фермента.
Демонстрируется, что все каталитические активности РНКП (полимеризация, пирофосфоролиз, эидо- и экзонуклеазные реакции) осуществляются одним активным центром.
Полученные результаты свидетельствуют о наличии дополнительного сайта связывания нуклеотида в районе активного центра РНКП, который, возможно, является предварительным сайтом связывания входящего NTP при синтезе РНК, участвующим в процессе отбора субстратов.
На основе трехмерной структуры тройного элонгапионного комплекса РНКП П S. cerevisiae (Gnatt et al., 2001) и полученных экспериментальных данных нами была построена молекулярная модель активного центра РНКП Е. coli, включающего в себя два иона Mg2+, который осуществляет как полимеризацию/пирофосфоролиз, так и экзо- и эндонуклеазные расщепления РНК.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на VI Международной конференции "Тонкие химические технологии", 1999, Москва; на Международной конференции "Современные проблемы молекулярной генетики и клеточной биологии", 2000, Москва и на Международных конференциях "Prokaryotic transcription initiation", 2001 и 2003, Saxtons River, Vermont, USA.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит рисунков. Библиография включает названия.
