Введение к работе
Актуальность проблемы
Основной каталитической функцией ДНК-зависимой РНК-полимеразы (РНКП) является образование фосфодиэфирной связи в ходе полимеризации РНК. Кроме того, РНКП обладает эндонуклеазной активностью, благодаря которой происходит гидролитическое отщепление-З'-концевого фрагмента РНК. Эта реакция осуществляется в тех случаях, когда в процессе элонгации 3'-конец РНК-транскрипта утрачивает контакт с активным центром в результате «соскальзывания» РНКП в обратном направлении (процесс бэктрэкинга), в результате чего элонгационный комплекс временно или необратимо инактивируется. Гидролитическое отщепление перешедшего в одноцепочечное состояние З'-концевого фрагмента РНК приводит к образованию нового 3'-концаРНК, способного к дальнейшему удлинению.
Прокариотические белковые факторы GreA, GreB (~ 19 kDa) и их эукариотический аналог TFIIS, взаимодействуя с РНКП, резко увеличивают скорость эндонуклеазного расщепления РНК. В их присутствии увеличивается эффективность и точность транскрипции in vivo и in vitro, а также существенно уменьшается время прохождения транскрипционных пауз (Borukhov et al., 1993; Izban and Luse, 1992a, Erie etal, 1993).
По аналогии с односубъединичными ДНК- и РНК-полимеризующими ферментами было предположено, что многосубъединичные РНКП осуществляют полимеризацию РНК с участием двух ионов двухвалентных металлов (Steitz, 1998). Однако, полученные к началу данной работы структурные и биохимические данные позволили надежно идентифицировать только один каталитический ион Mg2+, прочно удерживаемый в активном центре тремя абсолютно консервативными остатками аспартатов универсального мотива NADFDGD. Ни одна из полученных в настоящее время трёхмерных структур РНКП, в том числе структура тройного комплекса дрожжевой РНКП, четкого доказательства присутствия в активном центре второго иона Me , участвующего в полимеризации РНК, не представила. В различных структурах он либо отсутствует, либо связан в разных положениях
COC. НАЦИОНАЛЬНА*! БИБЛИОТЕКА I
относительно первого иона Mg * и не удовлетворяет условиям катализа с участием двух ионов Ме2+. Роль ионов магния в реакции эндонуклеазного расщепления к началу данной работы была практически не изучена.
Когда данная работа начиналась, в нашей лаборатории была обнаружена реакция 3'-5' экзонуклеазного расщепления РНК-транскрипта РНКП Е. coli. Было установлено, что 3'-5' экзонуклеазное расщепление происходит с низкой скоростью и требует высоких концентраций ионов Mg2+. В присутствии некомплементарного NTP реакция резко ускоряется и требует значительно меньших концентраций ионов Mg2+ (Сосунов, 2003). Эти наблюдения свидетельствуют о присутствии в активном центре второго, слабо связанного каталитического иона Mg2+, стабилизируемого некомплементарным NTP. Эти дашше послужили отправной точкой для выдвижения в нашей лаборатории гипотезы единого механизма всех реакций, катализируемых РНКП, в основе которой лежит предположение о том, что второй слабосвязашгый каталитический ион Mg2+ во всех реакциях, катализируемых РНКП, располагается в одном и том же месте активного центра, и требует дополнительной стабилизации, специфичной для каждого типа реакций.
Цель работы и задачи исследования
Целью работы являлась проверка двуметаллической модели единого активного центра РНКП E.coli, в котором катализируются все известные активности этого фермента, и построение молекулярных моделей для реакций эндонуклеазного расщепления РНК в присутствии и в отсутствие Gre факторов, катализируемых РНКП с участием двух ионов Mg2+.
В работе ставились следующие задачи:
Выяснить природу эффекта стимуляции эндонуклеазной активности РНКП'.со/;транскрипционными факторами расщепления GreB и GreA
Изучить роль З'-концевого фрагмента РНК в удержании второго иона Mg2+ при эндонуклеазной реакции в присутствии и в отсутствие факторов расщепления.
3. Выяснить влияние аминокислотных остатков, расположенных в непосредственной близости от активного центра РНК-полимеразы, на каталитическую активность РНКП в различных реакциях: экзо- и эндонуклеазного расщепления, полимеризации и пирофосфоролиза.
Научная новизна и практическая ценность работы
В работе продемонстрировано, что прокариотические факторы расщепления GreA и GreB резко увеличивают константу связывания второго каталитического иона Mg2+ (Mg-П) в активном центре РНКП Е. coli. На основании биохимического и мутационного анализа, а также молекулярного моделирования комплекса РНКП с GreB, предложен механизм стимулирующего эндонуклеазное расщепление действия Gre белков, согласно которому два инвариантных аминокислотных остатка D41 и Е44, расположенных в концевой петле N-концевого домена Gre фактора, непосредственно участвуют в координации каталитического иона Mg-П в активном центре РНКП и катализе реакции в процессе эндонуклеазного расщепления.
Продемонстрировано, что первый неспаренный З'-концевой нуклеотидный остаток РНК-транскрипта, расположенный в +1 положении относительно i+1 сайта активного центра РНКП, способствует Gre—независимой «внутренней» эндонуклеазной реакции, катализируемой РНКП в отсутствие Gre факторов: 1) путем предоставления фосфатной группы для дополнительной стабилизации и координации каталитического иона Mg-II и катализа; 2) в случае, если в указанном положении находится остаток пуринового нуклеотида, - путём предоставления атома N7 пуринового основания для катализа реакции.
Показано, что в присутствии каталитически неактивных Gre факторов с мутационными заменами D41N и E44Q ингибируется Gre-независимая эндонуклеазная реакция. Предположено, что в присутствии Gre факторов изменяется положение фосфатной группы в +1 положении относительно /+/ сайта активного центра, в результате чего происходит ингибирование Gre-независимой эндонуклеазной реакции.
Изучена роль фосфатной группы первого неспареного З'-концевого нуклеотидного остатка РНК в реакции эндонуклеазного выщепления динуклеотида в присутствии Gre факторов. Показано, что присутствие фосфатной группы в этом положении (+1 положение относительно i+1 сайта активного центра) необходимо для действия Gre факторов.
С учетом двуметаллической модели активного центра РНК-полимеразы Е. coli построены молекулярные модели для Gre-независимой и Gre-зависимой эндонуклеазных реакций.
Проведен мутационный анализ активного центра РНКП Е. coli и изучена роль остатков Е813, D814, R1106, R678, К1073 р-субъединицы и остатков N458 и R731 р'-субъединицы в реакциях расщепления и удлинения РНК-транскрипта.
Результаты данной работы подтверждают развиваемую в нашей лаборатории концепцию единого двуметаллического механизма всех реакций, катализируемых единственным активным центром РНКП, в формировании которого кроме РНК-полимеразы принимают участие различные компоненты транскрипционного элонгационного комплекса.
Апробация работы: Материалы диссертационной работы были представлены на Международных конференциях "Prokaryotic transcription initiation", 2001 и 2003, Saxtons River, Vermont, USA.
Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора
