Введение к работе
Актуальность проблемы. Транскрипция генов является первым этапом реализации генетической информации у всех живых организмов. Ключевыми ферментами, катализирующими этот процесс в эукариотических и прокариотических клетках, являются многосубъединичные ДНК-зависимые РНК полимеразы (РНКП). Сложность транскрипции и необходимость ее координации для множества генов во время клеточного роста и в ответ на различные изменения внешней среды в бактериальных клетках требует строгого контроля активности РНКП. Принято считать, что основная регуляция этого процесса осуществляется ДНК-связывающими белками на стадии взаимодействия РНКП с промотором и инициации синтеза РНК. Однако, существует еще один класс регуляторов -белковые факторы, взаимодействующие с РНКП в области ее вторичного канала и непосредственно влияющие на процесс катализа. В эту группу входят белки семейств Gre (GreA, GreB и Gfhl), DksA (DksA, TraR) и Rnk, которые обладают структурной гомологией, но сильно различаются функционально.
Gre-подобные белки, для которых накоплен большой объем генетических и биохимических данных, являются прекрасными моделями для изучения регуляции транскрипции через вторичный канал РНКП. В экспериментах in vitro Gre-белки стимулируют синтез РНК за счет (1) ускорения перехода от инициации к элонгации, (2) предотвращения образования пауз транскрипции и арестованных комплексов, (3) повышения точности транскрипции. Действие Gre-белков основано на индукции и модуляции собственной транскриптрасщепляющей активности РНКП [Borukhov 2005]. Для более полного понимания их биологической роли, требуется понять, какие из выявленных in vitro эффектов, имеют физиологическое значение, а так же определить этапы транскрипции, на которых эти эффекты наиболее выражены. В то же время, Gfhl из Thermits thermophilus, являясь антагонистом GreA и GreB, ингибирует все активности РНКП. Его биологическая роль Gfhl пока мало понятна. Предполагается, что Gfhl может специфично ингибировать синтез РНК в определенных условиях жизни клетки [Laptenko 2006].
В настоящее время структуры высокого разрешения комплексов бактериальных РНКП с факторами вторичного канала не описаны. Существует только несколько спорных моделей, созданых на основании криоэлектронных структур низкого разрешения, и биохимических данных с использованием мутантных форм Gre-белков [Opalka 2003; Sosunova 2003; Laptenko 2003]. Отсутствие детальных структурных данных затрудняет понимание молекулярных механизмов, определяющих взаимодействие этих факторов с компонентами вторичного канала РНКП, а возможные функционально активные состояния их комплексов с РНКП остаются неизученными. Для создания целостной картины регуляции активности РНКП Gre-подобными белками необходимо получить как можно более детальную структурную модель комплексов РНКП-Gre, учитывающую их конформационные изменения на различных стадиях транскрипционного цикла.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось определение структурно-функциональной организации комплексов бактериальной РНКП с факторами транскрипции GreA и GreB Е. coli, а также изучение функциональной роли GreA Е. coli и Gre-подобного транскрипционного ингибитора Gfhl из Thermus thermophilus на разных этапах транскрипции.
В работе были поставлены следующие задачи:
картировать и исследовать расположение Gre-белков в комплексах с РНКП;
определить пространственное расположение регуляторного домена - G-петли Р'-субъединицы РНКП относительно Gre-белка, ДНК и элементов вторичного канала РНКП в элонгационном комплексе;
создать детальную модель комплекса Gre-белков с РНКП;
исследовать роль транскрипт-расщепляющей активности GreA в стимуляции транскрипции, инициированной с разных промоторов Е. coli;
определить этап транскрипции, на котором действует Gre-подобный транскрипционный ингибитор Gfhl из термофильной бактерии Thermus thermophilus.
Научная новизна. Впервые предложена структурная модель комплекса РНКП-Gre, которая описывает расположение Gre-белков и G-петли относительно структурных модулей РНКП, ДНК и Gre-белков в элонгационном комплексе и учитывает возможные функциональные состояния Gre-белков. Впервые продемонстрирована необходимость расщепляющей активности GreA для стимуляции транскрипции, инициированной с пяти промоторов Е. coli. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что GreA активирует переход абортивного комплекса к продуктивному синтезу РНК. Впервые установлен промотор-специфичный ингибирующий эффект Gre-подобного фактора транскрипции Gfhl, который наиболее выражен на стадии абортивного синтеза и обусловлен прямой конкуренцией Gfhl с нуклеозидтрифосфатами (НТФ).
Научно-практическая ценность. Предложенная в данной работе структурно-функциональная модель РНКП-Gre позволяет понять важнейшие аспекты регуляции транскрипции и открывает рад возможностей для дизайна новых эффективных регуляторов транскрипции и антибиотиков, мишенью которых, также как и для Gre, могут стать подвижные структурные элементы активного центра фермента. Описанная модель вносит определенную ясность в понимание механизма передачи регуляторных сигналов, обеспечивающих фактор-зависимую регуляцию активности РНКП. Обнаружение стадии транскрипции, на которой действуют факторы вторичного канала РНКП - GreA Е. coli и Gfhl Т. thermophilus — позволяет предположить, что биологическая роль GreA заключается в повышении общего уровня синтеза РНК за счет уменьшения количества абортивных продуктов. Согласно полученным данным, Gfhl должен ингибировать синтез РНК в клетке, преимущественно действуя на танскрипционные комплексы, которым для начала синтеза РНК необходимы высокие концентрации субстратов. Такая регуляция может быть востребована для адаптации аппарата транскрипции клетки к изменяющемуся уровню источников питания.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на международной конференции International Е. coli alliance (Hinxton, UK, 2008), конференции UMDNJ Biomedical Sciences Conference (Stratford, NJ, USA, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008). Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, из них 2 статьи и 4 тезисов стендовых сообщений на конференциях. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего н29 источников. Работа изложена на
