Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 5
Строение микротрубочек 5
Динеин-зависимый транспорт молекул и органелл по микротрубочкам 7
Структура динеин-динактинового комплекса 8
Участие динеин-динактинового комплекса во внутриклеточном транспорте 10
Взаимодействие динеин-динактинового комплекса с микротрубочками 13
Организация микротрубочек в клетке 16.
Нуклеация миктротрубочек на центросоме 19
Участие динеина в процессах нуклеации микротрубочек 21
Заякоривание микротрубочек на центросоме 22
Участие динеин-динактинового комплекса в заякоривании микротрубочек на
центросоме 25
Роль протеинкиназ в регуляции организации микротрубочек 25
Строение и функции протеинкиназы LOSK 27
Цели и задачи исследования 31
Материалы и методы 32
Молекулярное клонирование 32
RT-PCR 34
Электрофорез белков в полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинг 34
Экспрессия в бактериях и аффинная очистка белка 36
Соосаждение с микротрубочками 37
Сборка микротрубочек на центросомах in vitro 38
Киназная реакция in vitro 39
Получение поликлональной сыворотки 39.
Антитела 40
Культивирование клеток 40
Микроскопия 41
Результаты 42
- Динеин-зависимый транспорт молекул и органелл по микротрубочкам
- Взаимодействие динеин-динактинового комплекса с микротрубочками
- Электрофорез белков в полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинг
- Сборка микротрубочек на центросомах in vitro
Введение к работе
Цитоскелет животных клеток, представленный микротрубочками (МТ), актиновыми микрофиламентами и промежуточными филаментами, обеспечивает внутриклеточный транспорт молекул и органелл, а также перемещение самих клеток.
Интерфазные микротрубочки, как правило, организованы в радиалыгую систему: к периферии они отходят от центра организации, которым в большинстве случаев служит центросома и окружающий ее перицентриолярный материал. На центросоме образуются затравки для роста микротрубочек и заякориваются их «минус»-концы. Транспорт вдоль микротрубочек осуществляется при помощи моторных белков — специализированных, механохимических АТФаз, относящихся к двум семействам: динеинам и кинезинам. Динеины перемещаются по направлению к «минус»-концу микротрубочки, а кинезины — к «плюс»-концу. Таким образом, радиальная организация микротрубочек обеспечивает направленность внутриклеточного транспорта.
Регуляция активного внутриклеточного транспорта чрезвычайно важна для поддержания жизнеспособности клетки и организма в целом. Однако регуляция работы моторных белков изучена недостаточно. Считается, что основным регулятором активности динеина является динактин. Динактиновый комплекс осуществляет связь динеина с перевозимым грузом и, кроме того, обеспечивает процессивность мотора за счет одной из своих субъединиц - pl50Glued. Белок pl50Glued - взаимодействует одновременно с тубулином и с промежуточной цепью динеина, помогая удерживать моторный комплекс на микротрубочке. Это должно быть особенно важно при транспорте на протяженные расстояния, например, в случае ретроградного транспорта в аксонах. Однако до сих пор не было получено данных об особенностях регуляции работы динеин-динактинового комплекса в нервных клетках.
Наряду с обеспечением внутриклеточного транспорта динеин-динактиновый комплекс, вероятно, участвует и в организации системы микротрубочек в интерфазных клетках и во время митоза. Скопления динеина и динактина обнаруживаются на центросоме интерфазных клеток и в полюсах веретена митотического деления, а ингибирование динеина и разрушение динактинового-комплекса приводит к хаотизации микротрубочек и дезорганизации полюсов веретена деления. Однако роль динеин-динактинового комплекса в организации микротрубочек пока исследована недостаточно. В частности, не ясно, какой же из двух процессов: нуклеация микротрубочек или их
заякоривание на центросоме нарушается при ингибировании динеин-динактинового комплекса.
Организация микротрубочек зависит от локализации и активности центросомных белков, а регуляция последней может осуществляться с помощью обратимого фосфорилирования. К немногим известным протеинкиназам, регулирующим работу центросомы, относится киназа LOSK (LOng Ste20-like Kinase), ассоциированная с микротрубочками. По некоторым данным ингибирование ее активности вызывает хаотизацию микротрубочек, однако ни субстрат, ни сигнальные каскады, через которые она может участвовать в регуляции системы микротрубочек, не были до сих пор. идентифицированы.
Полученные нами результаты проясняют некоторые особенности взаимодействия динактина с микротрубочками в зависимости от типа тканей, а также предоставляют новые данные о механизме регуляции системы микротрубочек протеинкиназой LOSK и о ее участии в других внутриклеточных процессах.
Динеин-зависимый транспорт молекул и органелл по микротрубочкам
Внутриклеточный транспорт осуществляется вдоль элементов цитоскелета при помощи моторных белков - специализированных механо-химических АТФаз: гидролизуя АТФ, эти белки меняют свою конформацию и могут перемещаться по микротрубочке. Различают два основных класса моторных белков, принимающих участие в перемещении молекулярных комплексов и органелл вдоль микротрубочек, - это кинезины и динеины. Кинезины транспортируют грузы, как правило, по направлению к «плюс»-концу микротрубочки, т.е. при радиальной организации микротрубочек — от центра клетки к периферии. А за «минус»-концевой транспорт отвечают динеиновые моторы.
В животных клетках существует два пула динеина: аксонемный и цитоплазматический. Аксонемный динеин обеспечивает движение жгутиков и ресничек, а цитоплазматический осуществляет транспорт молекул и органелл по микротрубочкам, участвует в организации интерфазных микротрубочек и митотического веретена деления.
В клетке цитоплазматический динеин существует в виде многосубъединичного комплекса массой 1,2 MDa. В его состав входят две тяжелые цепи 530 kD, три промежуточных цепи 74 kD, четыре легкие промежуточные цепи 55 kD, а также несколько легких цепей 8-20 kD (Hirokawa et ah, 1998).
Динеин относится к классу AAA-белков (ATPase Associated with diverse cellular Activities). В его моторном домене, входящем в состав тяжелой цепи, локализовано 6 ААА-доменов, четыре из которых способны гидролизовать АТФ. Эти домены образуют тороидальную структуру. Имеется также длинный тонкий выступ молекулы, связывающийся с тубулином микротрубочек. Гидролиз АТФ приводит к вращению тороидальной структуры и смещению выступа. Так осуществляется перемещение динеина по микротрубочкам (King, 2000; Mallik and Gross, 2004).
Динактиновый комплекс был открыт в 1991 году как активатор динеин-зависимого движения везикул по микротрубочкам (Schroer and Sheetz, 1991). Вероятно, через него молекулярные комплексы и органеллы прикрепляются к динеину. В клетке динактин локализован на центросоме, в полюсах деления, на «плюс»-концах микротрубочек и на разнообразных мембранных органеллах: эндосомных пузырьках, мембранах аппарата Гольджи и др.
Динактин состоит из двух структурных доменов: актиноподобного минифиламента («плеча») и подвижного домена, прикрепляющегося к микротрубочкам и моторному белку («руки») (Рис. 2). Минифиламент размером 10 40 нм состоит из октамера родственного актину белка Arpl. Важной особенностью этого белка является способность связываться с рЧП-спектрином - специфическим белком мембран аппарата Гольджи. Это определяет спектр грузов, перевозимых с помощью динеин-динактинового комплекса. Один из концов минифиламента связан с CapZ (Conventional Actin-capping Protein Z), а другой - с белками p62 и Arpll. Arpll стабилизирует «минус»-конец филамента, а р62 стабилизирует взаимодействие между Arpl и Arpll за счет своего Zn связывающего мотива. С р62 ассоциированы еще два небольших белка - р25 и р27. Они относятся к редкому классу белков с р-спиральной структурой. В отличие от остальных субъединиц динактинового комплекса, р25 и р27 встречаются и в свободном виде, и, предположительно, участвуют во взаимодействии с другими клеточными компонентами, кроме аппарата Гольджи.
Взаимодействие pl50Glued с динеином осуществляется па довольно протяженном участке: в области 150-811 а.о.. Основная часть взаимодействий приходится на район СС1. Участок промежуточной цепи динеина, взаимодействующий с этим районом (1-123 а.о.) имеет в своем составе элементы альфа-спиральной структуры (1-66 а.о.), серин-богатую область (81-99 а.о.) и сайты связывания с легкими цепями динеина (цитировано по King et ah, 2003). Связывание с динактином регулируется статусом фосфорилирования промежуточной цепи динеина: pl50Gue присоединяется к нефосфорилированному динеину. Кроме динеина, pl50Glued может связываться с Eg5 (белком семейства кинезинов) (410-811 а.о.) и с кинезином II (600-811 а.о.).
В С-концевом домене pl50Glued содержится вторая последовательность со структурой скрученной спирали (СС2), она обладает способностью связываться с актином, в том числе с минифиламентом Arpl. Это взаимодействие обеспечивает присоединение pl50Glued с динактиновому комплексу. В работах McGrail была показано, что мутантный р150 ue , лишенный С-концевого домена (после 980 а.о.) не включается в динактиновый комплекс (McGrail et ah, 1995).
Связь между двумя структурными доменами динактинового комплекса осуществляется за счет динамитина р50. В состав каждого комплекса входит четыре молекулы динамитина, они взаимодействуют между собой, с pl50GIued, р24/р22 участками со структурой скрученной спирали. Сверхэкспрессия р50 вызывает диссоциацию pl50G,ucd и р24/р22 от динактинового комплекса (цитировано по Schroer, 2004 ). Важным участком динамитина является его N-конец (1-87 а.о.): при его экспрессии прекращается динеин-зависимое движение органелл (Burkhard et ah, 1997). р24/р22 - самая маленькая субъединица динактинового комплекса, имеет структуру альфа-спирали.
Взаимодействие динеин-динактинового комплекса с микротрубочками
Роль динактина в обеспечении внутриклеточного транспорта, по-видимому, не органичивается его функцией прикрепления динеина к мембранным органеллам. Так, нокдаун гена Arpl - субъединицы, отвечающей за прикрепление к мембранам, не приводит к уменьшению количества динеина, связанного с мембранными пузырьками. Интересно, что при этом нарушается перемещение органелл как в ретро-, так и в антероградном направлениях (Hagnina et ah, 2007). Это предполагает участие динактина в регуляции работы не только динеина, но и кинезина. Это регуляция может осуществляться не только на уровне прикрепления к перевозимым органеллам. Вспомним, что одна из субъединиц динактинового комплекса - pl50Gued - способна взаимодействовать с микротрубочкми и, возможно, обеспечивать удержание моторного комплекса на микротрубочке.
Еще раз обратимся к строению молекулы р150 ue . На N-конце расположен участок взаимодействия с микротрубочками. Он состоит из двух доменов: глобулярного CAP-Gly (38-115 а.о.) и домена с невыраженной структурой BMBD (basic microtubule-binding domain). CAP-Gly встречается у многих «плюс»-концевых белков микротрубочек (ЕВ1, ЕВЗ, CLIP170, CLIP115) (Reihemann et ah, 1993; Li et al., 2002)). Он связывается с отрицательно заряженным С-концом тубулина (Weisbrich et ah, 2007) и, возможно, специфично распознает GTP-тубулин. CAP-Gly у различных белков имеют различную аффинностью к тубулину; аффинность CAP-Gly у pl50Glued к тубулину невелика (Weisbrich et al., 2007). Недавно обнаруженный BMBD (115-145 a.o.) богат основными аминокислотам, что обеспечивает его взаимодействие с отрицательно заряженным тубулином микротрубочек.
Иммунофлуоресцентное окрашивание выявляет скопления динактина на «плюс»-концах микротрубочек и в области центросомы. «Плюс»-концевые белки помогают динамичному концу микротрубочек находить и связываться с везикулами, кинетохорами хромосом и др партнерами (Mimori-Kiyosue and Tsukita, 2003; Vaughan, 2005; Vaughan, 2005a). Локализация pl50Glue на растущем конце микротрубочки обеспечивается белком CLIP170, который, в свою очередь, рекрутируется туда белком ЕВ1. В клетках с нокдауном CLIP 170 pl50GIued удаляется с «плюс»-концов микротрубочек. Это сопровождается нарушением динамики микротрубочек и поляризации клеток, однако изменений в организации аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума, а также в подвжности эндо- и лизосом при этом не наблюдается (Watson and Stephens, 2006). Вероятно, аккумуляция динактина на «плюс»-конце микротрубочек облегчает взаимодействие с грузами, но не является необходимым условием. Это подтверждается и в опытах по экспрессии pl50Glued, лишенного N-концевого фрагмента (1-200 а.о.), в клетках S2 дрозофилы (D. melanogaster). Замена эндогенного pl50Glued на такой же, но не способный взаимодействовать с микротрубочками мутант, не приводит к каким-либо нарушениям транспорта мембранных органелл или РНП (Kim et al., 2007). Зато в таких клетках наблюдается нарушение радиальной звезды микротрубочек, что свидетельствует о важности взаимодействия динактина с микротрубочками для поддержания организации последних (см. след. раздел).
Наличие двух следующих друг за другом МТ-связывающих доменов в молекуле pl50Gued позволяет предположить, что они выполняют разные функции. Изучением отличий МТ-связывающих участков динактина in vitro подробно занимались в лаборатории С. Кинга (Stephen King). Для этого различные N-фрагменты pl50Glucd сорбировали на карбоксилированные полистироловые частицы, добавляли в камеру с собранными микротрубочками и наблюдали за движением частиц. Удалось показать, что BMBD способен двигаться (скользить, to skate) вдоль микротрубочек в отсутствие моторных белков, а изолированный CAP-GIy, напротив, прочно прикрепляется к микротрубочкам и не может перемещаться. Наблюдая за подвижностью индивидуальных моторных комплексов, удалось обнаружить, что BMBD увеличивает процессивность динеина (длину перемещения без диссоциации от микротрубочки) в четыре раза, a CAP-GIy полностью ингибирует перемещение динеина. Таким, образом, можно предположить, что способность BMBD к скольжению вдоль микротрубочек помогает удерживать моторный комплекс на микротрубочке, a CAP-Gly, по-видимому, необходим для прикрепления к «плюс»-концу и стабильного латерального присоединения динактина к микротрубочке, через посредство других белков (Culver-Hanlon et al, 2006).
Сродство динактина к микротрубочкам может регулироваться фосфорилированием. Кевин Вон (Kevin Vaughan) с соавторами (2002) обнаружили, что при активации протеинкиназы А происходит фосфорилирование pl50Glued по остатку серина в 19-м положении и уменьшается количество связанного с микротрубочками динактина. Эффект обращается при ингибировании протеинкиназы А. Большее сродство нефосфорилированного pl50Glucd к микротрубочкам подтверждается и прижизненными наблюдениями за мутантными формами pl50Glue , имитирующими фосфорилированное (с заменой серина 19 на глутамат) или нефосфорилированное состояние (с заменой серина 19 на аланин), которые экспрессируются в культивируемых клетках (Vaughan et al, 2002).
К сожалению, в настоящее время это почти единственные данные о регуляции работы динактинового комплекса. Мультифункциональность динактина позволяет предположить, что существуют и иные механизмы, регулирующие его работу. В конце 90-х годов были получены данные об экспрессии pl50GIued в виде нескольких изоформ, отличающихся длиной МТ-связывающего участка.
Рассмотрим строение человеческого гена pl50GIued (DCTN1) чуть подробнее. Ген расположен в 6-й хромосоме, простирается на 25 т.п.о. и состоит и 31 экзона, длиной от 15 до 482 п.о.. Было обнаружено, что в тканях мозга встречается укороченная форма белка динактина-1 массой не 150 кД, а 135 кД. Оказалось, что р135 лишен первых 150 аминокислот на N-конце и не способен связываться с микротрубочками, хотя при этом включается в динактиновый комплекс и взаимодействует с промежуточной цепью динеина (Tokito et al, 1996). Кроме того, в тканях мозга встречаются два сплайс-варианта мРНК: один их них содержит все экзоны 5 - конца, а второй — лишен 5, 6 и 7-го экзонов (Tokito et al., 1998). Эти изоформы pl50Glued, отличающиеся по длине МТ-связывающего участка, могут выполнять разные функции, например, при обеспечении процессивности динеина (экзоны 5-7 попадают в область BMBD), но их свойства до сих пор не были изучены.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинг
Тотальная РНК из образцов органов человека (спинального ганглия, тригеминального ганглия, мозжечка, гиппокампа, легких, почек, печени, селезенки, лимфатического узла) была любезно предоставлена Л. Дергуновой (Институт молекулярной генетики РАН). Тотальную РНК из органов мыши (больших полушарий мозга, ствола, мозжечка, легких, печени, почек, сердца, селезенки, диафрагмы) и клеточных культур (HeLa, Vero, первичных и трансформированных мышиных фибробластов) выделяли набором реактивов RNeasy kit (Qiagen). кДНК синтезировали с помощью First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) или с обратной транскриптазой Superscript II (Invitrogen), в обоих случаях используя случайные гексануклеотидные праймеры. Изоформу pl50Gue-lA амплифицировали с кДНК, используя следующие праймеры: Izo-for (forward): 5 -atg agt gcg gag gca age gcc-3 и Izo-var (reverse): 5 -ctt ggg teg ccg agt tgt ggt-3 . Для амплификации изоформы р150-1В использовали Izo-for (forward) и Izo-short (reverse): 5 gg gcg cgt ggg cag ttt gca g-3\ В качестве контроля амплифицировали глицеральдегидфосфатдегидрогеназу (GAPDH), используя праймеры GAPDH-for: 5 ta gca ссе ctg gec aag g-3 и GAPDH-rev: 5 -ctt act cct tgg agg cca tg-3 или Р-актин (Act-for: 5 -gaa gat caa gat cat tgc tec tcc-3 и Act-rev: 5 -ctg gtc tea agt cag tgt аса gg -З ). ПЦР проводили с помощью набора реагентов GenePak PCR Core (Изоген, Россия).
Электрофорез белков в полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинг.
Образцы тканей мыши механически гомогенизировали в 2-4-кратном избытке 4-кратного SB и прогревали при 100С в течение 6 мин. Клеточные культуры, растущие на чашках Петри, дважды промывали PBS, затем кратко водой и гомогенизировали в подходящем объеме 2-кратного SB. Электрофорез проводили в 7,5%, 10%, 12%, 15% или в градиентном 6-12% ПААГ в денатурирующих условиях (Laemmli, 1970), используя прибор для вертикального электрофореза VE-10 фирмы Хеликон (Россия). Полусухой перенос проводили, как описано Kyhse-Andersen (1984), используя прибор SEMI-DRY (Хеликон). После полусухого переноса нитроцеллюлозную мембрану окрашивали Понсо, отмывали и блокировали растворами 3% бычьего сывороточного альбумина, или 5% обезжиренного сухого молока, 0,1% желатина из кожи холодноводных рыб (Sigma, США), или фирменным раствором для блокирования мембраны при выявлении фосфотреонина (Zymed). После блокирования мембрану инкубировали в растворе первых антител 1 час при комнатной температуре или ночь в холодильнике, промывали, инкубировали со вторичными антителами 1 час при комнатной температуре, промывали и проявляли фермент, конъюгированный со вторичными антителами. Вторичные антитела были конъюгированы с пероксидазой хрена (Jackson Immunoresearch, США) или с щелочной фосфатазой (KPL, США). Для проявки использовали раствор 3,3 -диаминобензидина/Н202 или стабилизированный раствор 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфата и нитросинего тетразолия (BCIP/NBT) (KPL), соответственно.
Состав используемых буферов и растворов: Буфер для образцов для белкового электрофореза (SB) 4-кратный : 200 мМ Трис рН 6.8, 40% глицерол, 400мМ Р - меркаптоэтанол, 0,01% бромфеноловый синий. Буфер для электрофореза в полиакриламидном геле (электродный буфер): глицин 6 мМ, Трис 38 мМ рН8.3, SDS 0,4 %. Концентрирующий 4% полиакриламидный гель: 13 % АА:БИС 30:0,8, 125 мМ Трис рН 6.8, 0,1 % SDS, 0,133 % PSA, 0,05 % TEMED. Разделяющий полиакриламидный гель: АА:БИС 30:0,8, 375 мМ Трис рН 8.8, 0,1 % SDS, 0,065 % PSA, 0,001 % TEMED. Раствор для окрашивания белков в полиакриламидном геле: 0,05 % Кумасси R250 (Sigena), 12,5% трихлоруксусной кислоты. Раствор для отмывки гелей при окрашивании Кумасси: 7 % уксусная кислота (Реахим). Буферные системы для полусухого переноса: Буфер А: 0.3 М Трис, 20% С2Н5ОН; Буфер В: 25 мМ Трис, 20% С2Н5ОН; Буфер С: 25 мМ Трис, 40 мМ аминокапроновой кислоты, 20% С2Н5ОН. Буфер TBS: 75 мМ NaCl, ЮмМ Трис рН 7.2-7.4. Буфер для отмывки нитроцеллюлозной мембраны: 0,05% Tween, TBS. Буферы для блокировки нитроцеллюлозной мембраны: 3% бычьего сывороточного альбумина (Панэко), или 5% обезжиренного сухого молока (Nestle) или 0,1% желатина на 0,05 % Tween/TBS Понсо: 0,5 % Понсо С (Диа-М), 1 % ледяной уксусной кислоты. Субстрат для пероксидазной реакции: 0,5 мкг/мл DAB, 50 мМ Трис рН 7.5, 0,3 % перекись водорода (Нижфарм). Экспрессия в бактериях и аффинная очистка белка.
Для работы с векторами pGEX использовали штамм E.coli BL21-3DE. 20 мл ночной культуры трансформированных бактерий растворяли віл среды LB и растили 2 часа при 37С, индукцию проводили ОДмМ изопропилтиогалактозида (1PTG) 4 часа при комнатной температуре. Бактерии осаждали при 3500 об/мин (JA-14, Beckman). Осадки (приблизительно 1,3 г из 1 л культуры) замораживали и хранили при -70С. Осадки ресуспендировали во 20 мл буфера А. Добавляли 10 мг лизоцима и инкубировали 30 мин на ротаторе при 4С, после чего добавляли 1 мг ДНКазы, 2 мМ MgCb и Тритон Х-100 до конечной концентрации 1% и инкубировали на ротаторе еще 30 мин. Затем бактериальную суспензию обрабатывали ультразвуком на приборе Sonic Dismembranator 550 (Fisher Scientific, США) при постоянном охлаждении и максимальной мощности в режиме: 15 сек озвучивания, 30 сек паузы, общее время озвучивания 4 мин. После чего центрифугировали суспензию при 15000 об/мин (JA-20, Beckman) 30 мин при 4С. К супернатанту добавляли глутатион-агарозу (Sigma) и инкубировали на ротаторе 1 час при 4С. Предварительно 30 мг глутатион-агарозы инкубировали в воде 1 час на ротаторе при 4С, затем промывали 3 раза по 10 мин буфером В. Смолу осаждали при 500 об/мин в клеточной центрифуге Т62.1 и промывали последовательно три раза по 10 мин буфером А и три раза буфером В. Элюцию проводили восстановленным глутатионом в течение 30 мин. Очищенные белки диализовали при 4С в соответствующем буфере в течение ночи с двукратной сменой раствора.
Сборка микротрубочек на центросомах in vitro
Радиальная организация микротрубочек на центросоме зависит от присутствия белков, участвующих в нуклеации и заякоривании микротрубочек, и от их функциональной активности. Центросомная локализация регулируется на уровне экспрессии белков и их транспорта, а функциональная активность этих белков может регулироваться обратимым фосфорилированием. В последнее время были обнаружены протеинкиназы, участвующие как в нуклеации, так и в удержании микротрубочек на центросоме. Так протеинкиназа Nek7 регулирует взаимодействие нуклеирующих комплексов гамма-тубулина с центросомой в интерфазе (Kim et al.., 2007) и в митозе (Abe et al, 2006). GSK-3P контролирует динеин-зависимую доставку найнеина - центросомного белка, участвующего в заякоривании микротрубочек (Fumoto et al, 2006). А работа протеинкиназы Aurora А обеспечивает заякоривание микротрубочек на центросоме во время митоза (Barros et al, 2005).
Одной из киназ, участвующих в организации микротрубочек, является ассоциированная с микротрубочками Ser/Thr протеинкиназа LOSK (LOng Ste20-like Kinase), называемая в ряде работ SLK (Sterile-Like Kinase). Ранее в нашей лаборатории было показано, что ингибирование LOSK вызывает нарушение радиальной организации микротрубочек. Данные были получены при экспрессии доминантно-негативного мутанта киназы (Бураков и др., 2005), а в настоящей работе мы подтвердили наблюдаемый эффект методом РНК-интерференции, позволяющим практически полностью элиминировать изучаемый белок.
РНК-интерференцию проводили с помощью коротких шпилечных РНК на основе вектора pG-Shin2, любезно предоставленного Dr. Kojima. pG-Shin2 содержит человеческий HI промотор для РНК-полимеразы III, транскрибирующей короткие РНК, а также ген GFP, что позволяет идентифицировать трансфицированные вектором клетки по флуоресценции GFP. Встройку конструировали согласно рекомендациям Dr. Kojima (Kojima et al, 2004). Для этого в последовательности мРНК LOSK из базы данных NCBI (NM_017420) выбирали участок длиной 19 нт, отстоящий от точек инициации и терминации трансляции приблизительно на 100 нт и фланкированный двумя А с 5 -конца и ТТ (или TN) - с З -конца. После выбора 19-нт последовательности мы проверяли ее на комплементарность другим мРНК в клетке с помощью программы NCBI BLAST. Для дальнейшей работы выбирали только те последовательности, которые имели не более 70% гомологии с другими клеточными мРНК. Затем конструировали два олигонуклеотида длиной 64 нт следующей структуры: Прямой:
Полученные пары олигонуклеотидов при отжиге образовывали дуплекс с «липкими» концами, имитирующими разрез рестриктазами Hindlll и Bglll. Такой дуплекс клонировали в вектор pG-Shin2 по соответствующим сайтам.
Таким образом, при транскрипции встройки синтезировалась короткая РНК, несущая две взаимно комплементарные последовательности, которые формировали шпилечную структуру, узнающуюся клеточными ферментами РНК-интерференции (Рис. 12).
После трансфекции клеток конструктом №4.1 на 8-9 день происходило падение количества LOSK в клетках, наблюдаемое по иммунофлуоресцентному окрашиванию антителами poI3D2, т.е. нокдаун этой киназы (Рис. 13, А). Трансфицированные клетки можно было определить по свечению GFP, экспрессию которого обеспечивал вектор. Клетки, трансфицированные вторым конструктом (№ 2.1) не отличались от клеток, несущих пустой вектор pG-Shin2, или от нетрансфицированных клеток (наблюдения проводили в течение 14 дней после трансфекции).
Элиминация LOSK при РНК-интерференции была подтверждена Вестерн-блотгингом. При пересеве клеток, неизбежном при ожидани результатов трансфекции в течение 8 дней, значительная часть трансфицированых клеток утрачивалась. Для проведения Вестерн-блсттинга клетки на 8 день после трансфекции конструктом 4.1 отбирали на цитосортере по флуоресценции GFP (Рис. 13, Б). Содержание протеинкиназы LOSK в лизатах отобранных клеток анализировали Вестерн-блоттингом. Оказалось, что на восьмой день количество киназы падает более чем на 90%. Такое уменьшение количества киназы позволило нам наблюдать последствия элиминации киназы для системы микротрубочек и для поддержания жизнеспособности клеток в целом.
На следующий день после драматического падения количества киназы клетки погибали, что свидетельствует о важности LOSK для поддержания жизнеспособности клеток. Рис. 14. Нарушение радиальной системы мнкротрубочек при РНК-ннтерференцни LOSK. А - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к альфа-тубулину клеток с РНК-интерференцией LOSK (pG-Shin2-4.1). Б - измерение интенсивности флуоресцентного окрашивания микротрубочек вдоль линий, проведенных на фотографии А. Контроль - нетрансфицированные клетки Vera. В - Количество клеток (%) с радиальной системой микротрубочек в контроле (п=56) (в клетках, трансфицированных pG-Shin2), при экспрессии доминантно-негативного мутанта LOSK (n=150) (Kimut) и при РНК-интерференции LOSK (п=46) (4.1). Масштабная линейка 20 мкм.
В клетках Vera с деплецией LOSK наблюдалось разрушение радиальной звезды микротрубочек (Рис. 14): как и при ингибировании киназы доминантно-негативным конструктом, радиальность системы микротрубочек сохранялась лишь в 20% клеток. При этом нуклеирующая активность центросомы сохранялась. Это было подтверждено опытами по восстановлению микротрубочек после их разборки нокодазолом: в первые минуты после отмывки нокодазола вокруг центросомы формировалась звезда микротрубочек, однако уже через 15 минут микротрубочки становились хаотичными, в то время как в контрольных клетках они сохраняли радиальность.
Поскольку при РНК-интерференции LOSK происходило нарушение заякоривания микротрубочек на центросоме, мы решили проверить, не изменяется ли при этом содержание центросомных белков, отвечающих за этот процесс. Для этого мы провели окрашивание клеток антителами к различным белкам центросомы и измерили интенсивность флуоресценции последней.
