Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Введение 12
1.2. Ультраструктура и мехаиизм сборки жгутиков и ресничек 13
1.2.1. Ультраструктура жгутиков и первичных ресничек 13
1.2.2. Процесс формирования ресничек в клетке 15
1.2.3. Молекулярные механизмы сборки ресничек 16
1.2.3.1. Открытие внутриреснитчатого транспорта 16
1.2.3.2. Моторные белки осуществляющие ВРТ 16
1.2.3.2. Белковый состав частиц ВРТ 17
1.2.3.4. Современная модель ВРТ 18
1.3. Первичные реснички и жгутики в патологии человека 19
1.3.1. Роль ресничек в эмбриогенезе 19
1.3.2. Сенсорная функция первичных ресничек 21
1.3.3. Роль ресничек в поликистозной болезни почки 21
1.3.3.1. Функции ресничек в почке 21
1.3.3.2. Молекулярный механизм сенсорной функции ресничек в почке 22
1.3.4. Роль первичных ресничек в эмбриональном развитии 23
1.4. Синдром Барде-Бидля 24
1.4.1. Описание синдрома Барде-Бидля 24
1.4.2. Мутации предопределяющие BBS ." 26
1.4.3. Механизм наследования синдрома Барде-Бидля 29
1.4.4. Связь BBS белков в первичными ресничками 30
1.4.5. Генетические модели синдрома Барде-Бидля у мышей 31
1.4.6. Функции BBS белков у рыб Danio rerio 33
1.4.7. Молекулярные механизмы BBS 34
1.4.7.1. Особенности первичной структуры BBS белков 34
1.4.7.2. Модель функции BBS белков у C.elegans 35
1.4.7.3. Роль BBS4 в транспорте центриольных спутников 36
1.4.7.4. Роль BBS белков в поляризации эпителия 37
1.4.7.5. Структурные особенности BBS6, BBS10 и BBS12 38
1.5. Заключение 39
Глава 2. Материалы и Методы 41
2.1. Материалы 41
2.1.1. Реактивы 41
2.1.2. Плазмиды 41
2.1.3. Малые интерферирующие РНК 41
2.1.4. Антитела 42
2.2. Основные методы 43
2.2.1. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 43
2.2.2. Электрофорез 44
2.2.3. Количественный иммуноблот (КИБ) 44
2.2.4. Клеточные культуры 44
2.2.5. Тандемная аффинная очистка белков 45
2.2.6. Фракционирование ББсомы в градиенте плотности сахарозы 45
2.2.7. Фракционирование клеточных мембран в градиенте плотности сахарозы 45
2.2.8. Гель-фильтрация лизатов семенников мыши и RPE клеток 46
2.2.8. Трансфекция 46
2.2.9. Количественная ОТ-ПЦР (кОТ-ПЦР) 46
2.2.10. Иммунопреципитация (ИП) 46
2.2.11. Иммунофлюоресцентная микроскопия (ИФМ) 47
2.2.12. Видеомикроскопия 47
2.2.13. Эксперименты с микротрубочками in vitro 48
2.2.14. Анализ вторичной и третичной структуры BBS5 48
2.2.15. Анализ пузырьков Купфера и транспорта меланосом у D.rerio 48
Глава 3. Результаты и обсуждение 49
3.1. Выделение и изучение функции комплекса BBS белков 49
3.1.1. Выделение и биохимическая характеризация комплекса BBS белков 49
3.1.1.1. Получение клеточной линии RPE-[JIAO]BBS4 49
3.1.1.2. Очистка и идентификация белков, ассоциированных с BBS4 51
3.1.1.3. Физико-химическая характеризация комплекса белков, ассоциированных с BBS4 53
3.1.2. Роль ББсомы и центриольных спутников в формировании ресничек 58
3.1.2.1. Роль РСМ-1 и ББсомы в формировании ЦС и ресничек 58
3.1.2.2. Связывание ББсомы с мембраной первичной реснички 60
3.1.2.3. Роль BBS5 в связывании ББсомы с мембраной реснички 62
3.1.3. Роль ГТФазы Rab8 в формировании ресничек 64
3.1.3.1. Изучение связывания ББсомы с белком Rabin8 64
3.1.3.2. Роль Rab8 в образовании мембран ресничек 66
3.2. Идентификация и исследование функций нового белка ВВІРЮ 70
3.2.1. Идентификация и характеризация нового белка в составе ББсомы 70
3.2.1.1. Обнаружение неизвестного белка в составе ББсомы 70
3.2.1.2. Характеризация взаимодействия ВВІРЮ с ББсомой 73
3.2.2. Роль ВВІРЮ в образовании и функции ресничек 74
3.2.2.1. Роль ВВІРЮ в образовании ресничек в RPE клетках 74
3.2.2.2. Изучение роли ВВІРЮ в функции ресничек у D.rerio 77
3.2.2.3. Корелляция экспрессии ВВІРЮ с BBS белками 77
3.2.3. Сравнительный анализ функций ВВІРЮ и BBS белков 78
3.2.4. Изучение роли ВВІРЮ в регуляции стабильности и ацетилировапия микротрубочек.. 84
3.2.4.1. Пост-трансляционные модификации тубулина 84
3.2.4.2. Исследование эффекта ингибирования ВВІРЮ на пост-трансляционные модификации тубулина 85
3.2.4.3. Исследование повышенной экспрессии ВВІРЮ 88
3.2.5. Изучение механизма регуляции ацетилирования МТ при помощи ВВІРЮ 91
3.2.5.1. Роль ВВІРЮ в динамике полимеризации МТ в клетках 91
3.2.5.2. Исследование взаимоотношения между формированием и ацетилированием МТ 92
3.2.5.3. Исследование взаимодействия между ВВІРЮ и HDAC6 94 ,
3.3. Заключение 97
Выводы 101
Список используемой литературы
- Ультраструктура жгутиков и первичных ресничек
- Роль первичных ресничек в эмбриональном развитии
- Экспрессия и очистка рекомбинантных белков
- Роль ББсомы и центриольных спутников в формировании ресничек
Введение к работе
Актуальность проблемы
Первичные реснички являются важной органеллой клетки и необходимы для жизнедеятельности многих многоклеточньїх организмов. У позвоночных ранние нарушения сборки первичных ресничек приводят к серьезным сбоям эмбрионального развития, вплоть до гибели эмбриона. В организме позвоночных функции первичных ресничек варьируют в зависимости от типа клеток и тканей, хотя чаще всего описывается их сенсорная функция. Значимость первичных ресничек, как сенсорных органелл клетки, подтверждается наличием многочисленных патологических синдромов человека, имеющих одинаковую этиологию - нарушение функции первичных ресничек (Badano J.L. et al, 2006).
Синдром Барде-Бидля (также известного как Лоуренса-Муна-Барде-Бидля) является одним из самых плейотропных синдромов этого типа. Мутации в любом из 12-ти картированных BBS генов (Bardet-Biedl syndrome) вызывают развитие патологического синдрома с практически одинаковыми симптомами, которые включают ожирение, диабет, дистрофию сетчатки, врожденное слабоумие, многопалость, а также многочисленные вторичные симптомы. По структурной организации BBS белки существенно отличаются друг от друга, кроме того, их молекулярные функции или неизвестны, или являются гипотетическими. Однако, генетические исследования различных видов организмов позволили предположить, что BBS белки участвуют в функционировании ресничек клетки (Blacque О.Е. et al, 2006). Было предложено две модели функциональной активности BBS белков на клеточном уровне. Для нематод было показано, что BBS белки участвуют в координации внутри ресничкового транспорта (ВРТ), который необходим для построения ресничек (Ou G. et al, 2005). С другой стороны, на основе исследования клеток млекопитающих, было высказано аргументированное предположение о том, что белок BBS4 необходим для транспорта центриольных спутников (ЦС) к центросоме клетки, которая в\ свою очередь обеспечивает правильную сборку ресничек (Ansley S.J. et al, 2003). Однако, ни одна из этих двух активностей не позволяет в полной мере1 объяснить взаимосвязь между потерей функциональной активности любого из двенадцати BBS белков у человека и возникновением разнообразных патологических симптомов синдрома Барде-Бидля.
Связь клинических проявлений, характерных для синдрома Барде-Бидла, с }-молекулярной функцией 12-ти BBS белков представляет не только важную и интересную >
фундаментальную научную проблему, она также принципиально важна для понимания молекулярных механизмов развития некоторых тяжелых заболеваний человека. Это собственно сам синдром Барде-Бидла и, вне сомнения, сопутствующие ему диабет и ожирение. Сегодня, по данным ВОЗ, от диабета в различных странах мира страдает около 180 миллионов человек и приблизительно около 1,1 миллиона человек погибает ежегодно (). Ожирение и диабет тесно взаимосвязаны между собой, а статистические данные по ожирению не менее впечатляющие. Общее количество больных ожирением оценивается в 300 миллионов человек, а так или иначе страдает от ожирения до 30% взрослого населения и 10% детей проживающих в развитых странах. Поэтому исследование возможной взаимосвязи генетически обусловленных нарушений функций ресничек с развитием диабета и ожирения также актуально и принципиально важно для понимания генетических основ патогенеза всех этих заболеваний и поиска принципиально новых подходов для борьбы с этими тяжелыми заболеваниями человека.
Цель и задачи исследования
Основной целью настоящей работы являлось изучение молекулярной функции BBS белков в клетке и поиск модели функционально объеденяющей эти 12 белков на молекулярном уровне.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Создание клеточной линии человека, позволяющей эффективно выделять белки, ассоциированные in vivo с известными BBS белками. i
Выделение и биохимическая очистка BBS ассоциированых белков с их предварительной характеризацией.
Исследование возможной функциональной активности BBS белков, а также связанных с ними белков, с помощью биохимических и цитологических методов для уточнения их роли в функционировании ресничек и центросомы.
Структурно-функциональный анализ- BBS белков- и BBS ассоциированных белков.
Научная новизна и практическая ценность
В результате проделанной работы получена уникальная линия клеток человека, стабильно экспрессирующая белок 3B-BBS4. С использованием полученной клеточной линии, технологии тандемной аффинной очистки в комбинации с тандемной масс-спектроскопией впервые было показано, что семь самых консервативных из 12 BBS белков связываются друг с другом и образуют белковый комплекс, который был назван
ББсома. Биохимическая характеризация показала, что белки, составляющие ББсому (BBS1, 2, 4, 5, 7, 8 и 9), в условиях in vivo присутствуют исключительно в составе комплекса в стехиометрических количествах, причем комплекс слабо связывается с белком центриолярных спутников РСМ-1. Было показано, что ББсома внутри первичной реснички ассоциирована с мембраной реснички, тогда как в цитоплазме наблюдалась на центриолярных спутниках.
Впервые были получены убедительные доказательства того, что ББсома необходима для сборки первичных ресничек и, в частности, для построения мембраны реснички. Было показано, что BBS1 субъединица ББсомы связывается с фактором обмена гуанозин трифосфата (ГТФ) для маленькой Rab8 ГТФазы - Rabin8 - которая необходима для активации Rab8. Активация- белка Rab8 с помощью белка Rabin8 является необходимым этапом при слиянии мембранных везикул у основания реснички и построения мембраны реснички. Таким образом, нами впервые была предложена единая молекулярная модель развития BBS. Она предполагает, что мутация в любом из 7 составляющих ББсому BBS белков может существенно подавлять функцию всего комплекса в процессе сборки мембраны реснички при участии белка Rab8. Именно с этим может быть связан плейотропный фенотип заболевания.
При характеризации белков, ассоциированных с ББсомой, был обнаружен новый консервативный белок, который получил название ВВІРЮ. Было показано, что ВВІРЮ является стехиометрической субъединицей ББсомы. Он необходим для сборки реснички и сборки ББсомы, как белкового комплекса. Сравнение клеточных функций BBS белкові и ВВІРЮ позволило выявить функциональную роль ВВІРЮ. Она заключалась в регуляции стабильности микротрубочек (МТ) и ацетилировании тубулина, составляющего МТ. Было продемонстрировано, что цитоплазматическая фракция ВВІРЮ не связанна с ББсомой и необходима для поддержания стабильности МТ цитоскелета и их ацетилирования, причем эти активности- не зависят друг от друга. Возможным . механизмом контроля ацетилирования тубулина является ингибирование диацетилазы тубулина - HDAC6. Таким образом, можно предположить, что ББсома, осуществляет координацию между построением мембраны реснички за счет связывания с белком Rabin8»H ацетилированием-аксонемы реснички за счет ВВІРЮ субъединицы.
Расшифровка молекулярного механизма формирования ББсомы открывает принципиально новый подход к исследованию молекулярной основы патологии тяжелого генетического заболевания человека. Этот подход может быть полезен для поиска потенциальных мишеней для лекарственных препаратов. Полученные данные о
молекулярном механизме развития BBS могут быть в дальнейшем использованы для разработки методов лечения таких заболеваний, как ожирение и диабет.
Положения, выносимые на защиту:
Очистка и характеризация ББсомы, как олигомерного белкового комплекса состоящего из белков BBS1, 2, 4, 5, 7, 8 и 9, а также факультативной субъединицы РСМ-1.
Функциональная роль ББсомы в построении первичных ресничек.
Участие ББсомы и связаного с ней активатора Rabin8 в активации ГТФазы Rab8.
Участие белка Rab8 в построении мембран ресничек.
Обнаружение нового белка ВВІРЮ в составе ББсомы, данные по его биохимической и функциональной характеризации.
Участие ВВІРЮ в регуляции стабильности микротрубочек цитоскелета и их ацетилирования независимо от его функции в составе ББсомы.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены на следующих конференциях: The American Society for Cell Biology 46th Annual Meeting, San Diego, CA, США; FASEB Meeting «The Biology of cilia and flagella», Saxton's River, VT, США. По материалам диссертации опубликованы 3 полноразмерные статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом и в соавторстве с доктором М.В. Начури. Экперименты с использованием эмбрионов рыб D.rerio, а также анализ корелляции экспрессии BBS генов были выполнены докторами Ч. Зангь, С. Бек, Ч. Сирби, Т. Читз, Д. Слузарски, В. Шефилдом, в Университете Айовы, США. Анализ структуры белка BBS5 был проведен доктором Ф. Базан. Масс-спектроскопический анализ всех образцов был проведен доктором Б. Лэйн в Гарвардском Университете, США.
Объем и структура диссертации:
Диссертация- состоит из введения, обзора литературы, 20 глав исследований, заключения, выводов - и списка использованной литературы, включающего 2 отечественных и 148 зарубежных источников. Общий объем работы составляет 137 страниц текста, иллюстрированного 4 таблицами и 36 рисунками.
Благодарности:
Автор выражает глубокую признательность докторам П.К. Джексону и М.В. Начури, чьи идеи послужили основой настоящей работы, а также профессору А. А. Ильичеву. Автор приносит благодарность всем своим коллегам по лабораториям в ГНЦ ВБ «Вектор» и ООО «Генентех» за методическую, консультационную и другую неоценимую помощь в работе и обучении. Автор особенно благодарен профессору В.Б. Локтеву за помощь в подготовке диссертации.
Ультраструктура жгутиков и первичных ресничек
Длина первичных ресничек в соматических клетках млекопитающих обычно составляет от 5 до 10 мкм, тогда как длина жгутиков сперматозоидов может достигать 50-мкм. Диаметр как ресничек так и жгутиков обычно порядка 50 нм. Удлинение аксонемы жгутика происходит путем добавления новых компонентов к ее дистальному концу (Rosenbaum J.L. et al, 1967), однако механизм доставки аксонемных белков к концу жгутика долгое время оставался не ясным. Исследование этого процесса привело к ; открытию механизма внутриресничкового транспорта (ВРТ). Первое доказательство существования ВРТ было получено в лаборатории Розенбаума в 1993 году на примере хламидомонад (Chlamidomonas), являющимися превосходным модельным организмом для изучения жгутиков. Авторами было замечено непрерывное движение микрочастиц внутри жгутиков, антероградное со скоростью -2,5 мкм/с и ретроградное со скоростью 4 мкм/с (Kozminski.K.G. et al, 1993b). Позднее наличие ВРТ было подтверждено в первичных ресничках червя C.elegans, а также для клеток млекопитающих (Follit J.A. et al, 2006; Orozco J.T. et al, 1999). С помощью электронной микроскопии было показано, что эти микрочастицы соединяются с микротрубочкой периферической пары и с мембранным чехлом жгутика (Kozminski K.G. et al, 1995).
Микротрубочки являются полярными,- поэтому моторные белки обеспечивают транспорт вдоль микротрубочки только в одном направлении, либо к ее плюс, либо к. минус концу. Плюс концы микротрубочек аксонемы находятся в дистальной части реснички, следовательно, для движения ВРТ частиц в обоих направлениях необходимо, как минимум, два различных моторных белка. У хламидомонады, исследование мутации
flalO, приводящей к отсутствию жгутика, позволило идентифицировать гетеротримерный кинезин-2, как антероградный моторный белок (Kozminski K.G. et al, 1995). У млекопитающих данный гетерокомплекс состоит из двух субъединиц KIF3A и KIF3B, а также дополнительного белка КАР (kinesin associated protein). Считается, что гетеротримерный кинезин-2 является основным белком, ответственным за антероградный ВРТ. Однако, существует дополнительный моторный белок KIF17, который выполняет и более специализированные функции (Jenkins P.M. et al, 2006).
Предполагается, что ретроградный ВРТ осуществляется цитоплазматическим белком динеин-2,.который состоит как минимум из четырех субъединиц (Rosenbaum J.L. et al, 2002). Прямое доказательство роли динеина-2 затрудняется тем, что не все полипептидные цепи этого моторного белка идентифицированы, а также тем, что некоторые субъединицы этого белка входят в состав других цитоплазматических динеинов. Важным доказательством участия динеина-2 в ретроградном ВРТ является то, что мутации в гене Dync2hl у хламидомонады и мыши приводят к развитию укороченных жгутиков и ресничек, заполненных частицами ВРТ (May S.R. et al, 2005; Pazour G.J. et al, 1999).
Частицы ВРТ были впервые выделены из жгутиков хламидомонады при помощи комплекса биохимическим методов. Оказалось, что ВРТ частица состоит из комплексов А и Б, которые диссоциируют при повышенной концентрации хлористого натрия, и при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы седиментируют с коэффициентом 16-17S. Комплекс А состоит из 6 полипептидов, а комплекс Б из 10 полипептидов (Cole D.G. et al, 1998). Индивидуальные белки ВРТ обычно обозначаются как IFT (Intra Flagellar Transport) белки. ВРТ белки были названы в зависимости от их молекулярного веса, который варьирует от 20 до 172 кДа, например, как ШТ20 или IFT172 белки, где цифра указывает молекулярную массу соответствующего полипептида (Cole D.G., 2003). Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей белков ВРТ демонстрирует наличие мотивов, которые обычно опосредуют белок-белковые взаимодействия. Это районы, которые образуют двойную спираль (coiled coil) или содержат TPR и WD40 повторы. Наличие таких мотивов,в белках ВРТ косвенно подтвердило гипотезу о том, что ВРТ частица связывается с белками аксонемы и доставляет их в дистальный конец реснички, где они используются для.сборкиреснички. Лучшим доказательством того, что ВРТ необходим для роста ресничек является, то, что потеря любого белка из комплеска Б (IFT20, IFT27, IFT46, IFT52, IFT57, IFT80, IFT81, IFT88, IFT172) приводит к полному отсутствию ресничек или к формированию очень коротких ресничек (Pedersen L.B. et al, 2008). Было также продемонстрировано, что белок IFT46 связывается непосредственно белками внешней динеиновой ручки и необходим для их доставки в ресничку (Hou Y. et al, 2007). В отличие от белков комплекса Б, дефекты, возникающие при удалении генов белков комплекса А, существенно варьируют для разных организмов (Pedersen L.B. et al, 2008).
Современная модель ВРТ
Современная общепринятая модель ВРТ (Рис. 3), включает в себя следующие основные положения (Pedersen L.B. et al, 2008): 1. ВРТ комплексы А и Б, кинезин-2, динеин-2 и компоненты аксонемы собираются в районе материнской центриоли. 2. Компоненты аксонемы, связанные с комплексом Б, транспортируются вдоль периферической микротрубочки к дистальному концу реснички вместе с неактивным динеином-2. Комплекс Б присоеденен к комплексу А, который в свою очередь связан с активным кинезином-2. 3. По достижению конца реснички комплекс распадается, высвобождая компоненты для построения реснички, причем кинезин-2 остается связанным микротрубочкой, но становится неактивным. 4. Цитоплазматический динеин-2 активируется, что сопровождается ассоциацией с комлексом А, который затем связывается с комплексом Б. Собраный таким образом ВРТ комплекс предположительно связывается с «отработанными» белками. 5. Цитоплазматический динеин-2 транспортирует ВРТ частицы из дистального конца реснички в цитоплазму клетки. Многие элементы приведенной модели еще не доказаны экспериментально, в частности процесс разборки и сборки комплексов на конце реснички.
Роль первичных ресничек в эмбриональном развитии
Традиционно считается, что синдром Барде-Бидля наследуется как аутосомно-рецессивный признак, то есть для проявления заболевания необходимо наличие двух мутаций в одном локусе. В последние несколько лет появились данные, что наследование не всегда подчиняется законам Менделя. Были обнаружены 4 случая, из 164 исследованных пациентов, в которых были найдены гомозиготные мутации в BBS2 гене совместно с третьей мутацией в BBS6 гене. Так как встречаемость мутаций в BBS генах очень низкая, то вероятность одновременного нахождения четырех случаев с заболеванием с тремя мутантными алелями чрезвычайно низка. Было высказано предположение, что дополнительная мутация в BBS6 гене может быть также непосредственно связана с развитием заболевания (Katsanis N. et al, 2001). В нескольких последующих исследованиях было описано наследование для BBS1, BBS3, BBS4, BBS6, BBS7 и BBS 10 мутантных генов. Также были найдены пациенты с гетерозиготными мутациями во всех известных BBS генах, что предполагает наличие множественных и разнообразных мутаций, необходимых для проявления данного заболевания (Badano J.L. et al, 2003b; Beales P.L. et al, 2003; Fan Y. et al, 2004; Fauser S. et al, 2003; Hichri H. et al, 2005; Karmous-Benailly H. et al, 2005; Katsanis N. et al, 2001; Katsanis N. et al, 2002; Li J.B. et al, 2004; Slavotinek A.M. et al, 2002). Необходимо отметить, что в. одном из исследований были найдены здоровые люди с гомозиготными мутациями в известном BBS гене (Beales P.L. et al, 2003). Это может означать, что модель наследования может быть еще более сложной, чем полигенная. Например, в нескольних случаях мутация в третьем или четвертом аллеле напрямую коррелировали с началом проявления и тяжестью заболевания. Таким образом, мутации в одних BBS генах могут эпистатически воздействовать на другие BBS гены (Badano J.L. et al, 2003b; Fan Y. et al, 2004).
Гипотеза о полигенном наследовании синдрома Барде-Бидля остается спорной, так как две группы исследователей полигенного наследования не обнаружили (Mykytyn К. et al, 2003; Nakane Т. et al, 2005). Представляется весьма вероятным, что наследование может быть Менделевским или полигенным в зависимости от пораженного аллеля. Например, в случае с мутациями в гене BBS1 более 80% пациентов унаследовали гомозиготные мутации согласно Менделевским законам (Beales P.L. et al, 2003). С другой стороны, более 70% мутации в генах BBS2, BBS4, BBS6 наследованы полигенно (Katsanis N., 2004). Анализ обоих моделей наследования также осложняется тем, что до сих пор картированы еще не все гены, ассоциированные с развитием синдрома Барде-Бидля.
Совпадение основных клинических проявлений синдрома Барде-Бидля с фенотипическими проявлениями, возникающими вследствие нарушения функции белков, ответственных за построение первичных ресничек у нокаутных мышей orpk и kif3a (палочко-колбочковая дистрофия, многопалость), дало основание высказать предположение, что в основе патогенеза синдрома лежит нарушение функции первичных ресничек (Rosenbaum J.L. et al, 2002). Первые доказательства этой гипотезы были получены в 2003 году, когда было показано, что у мышей и человека белок BBS8 локализован в клетках мерцательного эпителия бронхов и перетяжке фоторецепторных нейронов сетчатки (Ansley S.J. et al, 2003). При экспрессии белка BBS8 с Мус эпитопом в различных клеточных линиях он был локализованым в базальные тельца при помощи иммунофлюоресцентной микроскопии. При исследовании гомологов BBS генов у нематод было обнаружено, что BBS1, BBS2, BBS7, BBS8 белки экспрессируются исключительно в клетках с ресничками (Ansley S.J. et al, 2003). Организм нематоды С.elegance состоит из приблизительно 1000 клеток, триста из которых являются нервными. Шестьдесят сенсорных нейронов являются единственными клетками паразита, которые имеют неподвижные ресничко-подобные структуры. Дистальные концы ресничек находятся в непосредственном контакте с окружающей средой и выполняют сенсорную функцию { (Perkins L.A. et al, 1986). Кроме того, регуляторные районы BBS генов С.elegance содержат консенсусные мотивы (Х-боксы) для связывания транскрипционного фактора DAF-19, являющегося хорошо охарактеризованным регулятором роста ресничек (Ansley { S.J. etal, 2003).
Определение последовательности геномов для нескольких различных видов организмов дало возможность сравнительного анализа целых геномов. В частности, было обнаружено, что у растений отсутствуют гены ресничек. В тоже время структура и функции жгутиков хламидомонады и ресничек человека является весьма сходной. Это позволило предположить, что набор генов, гомологичных между хламидомонадой и человеком, но отсутствующий у растений, может, с большой степенью вероятности, включать гены белков необходимых для сборки и функционирования ресничек. Такой перечень белков (центросомно-ресничковый протеом) был получен Ли с коллегами и он включал в себя 688 белков (Li J.B. et al, 2004). Высокая достоверность этого списка подтвердилась тем, что в нем присутствовало 90% белков необходимых для сборки и функционирования ресничек. С использованием этой информации был успешно идентифицирован ген BBS5. Экспресия и локализация гена BBS5 у мышей и нематод была схожа с геном BBS8. Необходимо отметить, что с использованием антител (AT)
было обнаружено небольшое количество эндогенного BBS5 белка внутри ресничек, а не только в центриолях, как в случае с BBS8 белком. Подавление экспрессии гена BBS5 у хламидомонад привело к полному или частичному отсутствию жгутиков, что свидельствует о принципиально важной роли гена BBS5 в процессе сборки жгутиков и ресничек (Li J.B. et al, 2004).
Большую роль в понимании механизмов патологии синдрома Барде-Бидля сыграло получение линий мышей с делетированными генами BBS. К настоящему времени получены и охарактеризованы мыши с нулевыми аллелями генов BBS1, BBS2, BBS4, BBS6, а также с геном BBS1 с мутацией M390R (модели синдрома Барде-Бидля). Фенотипические проявления у мышей всех этих генотипов практически идентичны и похожи на проявление синдрома у человека. У них наблюдается ожирение, палочко-колбочковая дистрофия, почечная патология, нейросенсорные нарушения и отклонения в поведении (Davis R.E. et al, 2007; Fath M.A. et al, 2005; Kulaga H.M. et al, 2004; Mykytyn K. et al, 2004; Nishimura D.Y. et al, 2004). Несмотря на полное отсутствие экспрессии BBS генов у нокаутных мышей присутствовали реснички и они, как правило, имели нормальное 9+2 строение, за исключением сперматозоидов. Более детальное исследование ресничек клеток мерцательного эпителия бронхов с помощью электронной микроскопии показало, что часть ресничек имеет утолщения, которые заполнены везикулами. Частота мерцания ресничек эпителия была умеренно замедлена, тем не менее, основные показатели функции бронхов оставались нормальными (Shah A.S. et al, 2008). Исключение составили жгутики сперматозоидов, которые полностью отсутствовали у самцов всех описанных выше линий мышей. Иммуногистохимические исследования семявыводящих путей мышей разного возраста подтвердили, что жгутики отсутствуют на всех этапах сперматогенеза (Mykytyn К. et al, 2004; Nishimura D.Y. et al, 2004; Shah A.S. et al, 2008).
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков
Белки, разделенные электрофорезом в полиакриламидном геле, как описано выше, переносили на PVDF мембрану (Millipore, США). Перенос проводили в течение 1 часа на аппарате Criterion (Bio-Rad, США) при напряжении 50 V в 25 мМ трис-HCl буфере, содержащем 0,192 М глицина (рН 8,3) и 20% метанола. Мембраны помещали в буфер PBST, содержащий 1% бычий сывороточный альбумин на 1 час при комнатной температуре. Обработанные таким образом мембраны инкубировали в течение 1 часа со специфичными AT. От избытка белка и AT избавлялись трехкратным промыванием мембран в буфере PBST. Далее мембраны обрабатывали антивидовыми AT, мечеными флюорофорами ГО.680 или IR800 (Lycor, США), выдерживали 30 минут при комнатной температуре. Мембраны промывали 3 раза в буфере PBST и сканировали на инфракрасном сканере Odyssey (Licor, США). Анализ результатов проводился при помощи программы Odyssey версии 3.1.
Культура эпителия сетчатки глаза человека RPE hTERT, а также клетки НЕК293 были получены из коллекции культур клеток АТСС, США. Клетки культивировали на среде MEM в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей увеличенные количества аргинина до 200 мг/л, фолиевой кислоты до 12 мг/л, аспарагина до 36 мг/л, а также в среде DMEM/F12 с добавлением 20 мМ HEPES (Invitrogen, США) и 10% фетальной бычей сыворотки. Клетки линии U-205, экспрессирующие химерный белок красный флюоресцентный белок - а-тубулин, были получены от фирмы Marinpharm (Германия) и культивировались согласно рекомендациям производителя.
Клеточная линия RPE-[JIAO-BBS4] была получена путем инфецирования RPE клеток ретровирусом pBabe-JIAO-BBS4 с последующей селекцией при помощи пуромицина (10 мкг/мл) в течение 10 дней. Выжившие клетки, экспрессирующие ЗФБ, были клонированы на лазерном проточном цитофлюориметре FACSAria (BD Biosciences, США) в 96-ти луночные планшеты по 1 клетке в лунку. Полученные клеточные линии были проанализированы на наличие экспрессии белка BBS4 с помощью ИФМ и ИБ.
Тандемная аффинная очистка белков, ассоциированных с JIAO-BBS4, проводилась по методу, описанному ранее (Cheeseman I.M. et al, 2005; Nachury M.V., 2008).
Для фракционирования ББсомы и ассоциированных белков, JIAO-BBS, иммобилизованный на смоле с AT к ЗФБ, подвергался обработке TEV протеазой в течение 12 часов при 4С. Полученный таким образом элюат наносился на 10-40% линейный градиент сахарозы (50 мМ HEPES рН 7,4, 150 мМ КС1, 1 мМ EGTA, 1 мМ MgCl2, 0.05% NP-40). Пробирки центрифугировали при 200000 g в течение 18 часов. Фракции объемом по 500 мкл были собраны сверху градиента и белки были сконцентрированы путем осаждения метанолом и хлороформом согласно (Wessel D. et al, 1984).
Клетки RPE-[JIAO-BBS4] были гомогенизированы с помощью шарикового гомогенизатора (Isobiotec, Германия) с просветом 18 мкм в лизирующем буфере следующего состава: 25 мМ HEPES, рН 7,0, 150 мМ КО Ас, 2 мМ MgOAc с 7% сахарозы. Супернатант, полученый после центрифугирования лизата при 1000 g, был затем центрифугирован в роторе TLA 100.3 ультрацентрифуги Beckman TL-100 в течение 1 часа при 100000 g. Осадок был ресуспендирован в 800 мкл лизирующего буфера с концентрации сахарозы увеличенной до 60% в гомогенизаторе Даунса. На суспензию было аккуратно наслоено 900 мкл буфера с 50% сахарозой, а затем 600 мкл буфера с 7% сахарозой, после чего пробирки были центрифугированы в роторе TLS-55 при 170000 g в течение 18 часов. Фракции, по 250 мкл каждая, были собраны сверху градиента и белки были сконцентрированы путем осаждения метанолом и хлороформом согласно (Wessel D. е/я/, 1984).
Семенники мыши или клетки RPE были гомогенизированы с помощью гомогенизатора Даунса в буфере 50 мМ Hepes рН 7,4, 150 мМ КС1, 1 мМ EGTA, 1 мМ MgCb, 0,3% NP-40. Лизаты были осветлены центрифугированием в роторе в TLA 100.3 ультрацентрифуги Beckman TL-100 в течение 1 часа при 100000 g. Далее лизаты были подвергнуты хроматографии на колонке Superose-6 10/300GL, уравновешенной лизирующим буфером без детергента NP-40, на системе АКТА Explorer (GE Healthcare, США). Фракции, по 500 мкл каждая, были сконцентрированы путем осаждения метанолом и хлороформом согласно (Wessel D. et al, 1984).
Трансфекция клеток плазмидами осуществлялась с использованием реагента Fugene 6 (Roche, США), согласно рекомендациям производителя. На 70000 клеток в одной лунке 6-ти луночного планшета добавлялось 1 мкг плазмидной ДНК и 3 мкл Fugene 6 в 100 мкл среды ОРТІ-MEM (Invitrogen, США). Анализ трансфецированных клеток проводили через 48 часов.
Трансфекция клеток миРНК осуществлялась с использованием реагента Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, США), следуя рекомендациям производителя. Конечная концентрация миРНК в среде составляла 50 нМ. Как правило, анализ трансфецированных клеток проводили через 72 часа. В экспериментах по оценке формирования ресничек в RPE клетках, через 24 часа после трансфекции среда заменялась : на среду с 0,2% ФБС и клетки фиксировались через 48 часов.
Роль ББсомы и центриольных спутников в формировании ресничек
Субъединицей микротрубочек является гетеродимер тубулина, состоящий из а и Р изоформ. Тубулин микротрубочек, а также органелл, основанных на МТ (центросома и ресничка), подвергается многочисленным пост-трансляционным модификациям (ПТМ), таким как ацетилирование, полиглютаминирование, детирозинирование (Westermann S. et al, 2003). В отличие от остальных ПТМ, где модифицируется и а и р тубулин, ацетилированию подвергается только К40 ос-тубулина (L Heraault S.W. et al, 1985). AT, специфичные к ацетилированному эпитопу а-тубулина, традиционно используются в качестве маркера ресничек, так как МТ аксонемы реснички ацетилированы в значительной степени (Westermann S. et al, 2003). Тубулин цитоплазматических МТ также ацетилируется. Предполагается, что ацетилирование происходит после полимеризации тубулина в МТ (Maruta Н. et al, 1986; Piperno G. et al, 1987). При этом ацетилирование цитоплазматических МТ кореллирует с продолжительностью их существования в клетке, , то есть ацетилированные МТ являются самыми стабильными и долгоживущими (Webster D.R. et al, 1989). Тем не менее, непосредственная роль ацетилирования в регуляции стабильности МТ остается спорной (Palazzo A. et al, 2003). Несмотря на то, что ацетилирование а-тубулина было описано более 20 лет назад, фермент, катализирующий эту реакцию, до сих пор не идентифицирован. Описано два фермента, катализирующих обратную реакцию, - SER.T2 и HDAC6 (Hubbert С. et al, 2002; North B.J. et al, 2003). Последние данные литературы позволяют сделать вывод, что HDAC6 является основной деацетилазой тубулина in vivo (Zhang Y. et al, 2008). Кроме того, показано, что HDAC6 участвует в регуляции, разборки ресничек в клетках (Pugacheva E.N. et al, 2007).
Данные о функциональной значимости ацетилирования тубулина являются противоречивыми. С одной стороны, замена гена а-тубулина на вариант, который не может быть ацетилирован, у тетрахимены и хламидомонады, показала, что ацетилирование не является необходимым дле выживания и образования жгутиков (Gaertig J. et al, 1995; Kozminski K.G. et al, 1993a). С другой стороны, было показано, что моторный белок кинезин-1 предпочтительно использует ацетилированные МТ для движения (Reed N.A. et al, 2006).
Детирозинирование тубулина, так же как и ацетилирование, кореллирует со стабильностью МТ (Webster D.R. et al, 1987). Данная модификация заключается в отщеплении остатка тирозина с карбоксильного конца а или р тубулина, катализируемом тирозин-тубулин карбоксипептидазой (Argarana СЕ. et al, 1978). Так как образовавщийся в результате тубулин имеет на карбоксильного конце глютаминовую кислоту вместо удаленного тирозина его принято называть глю-тубулин.
Полиглютаминирование тубулина представляет собой присоединение нескольких звеньев глютаминовой кислоты к одному из остатков глютаминовой кислоты вблизи карбоксильного конца а или Р тубулина (Westermann S. et al, 2003). В отличии от ацетилирования и дитирозинирования, считается, что только МТ, составляющие центросомы и аксонемы ресничек, подвергаются полиглютаминированию. Ранее было показано, что полиглютаминирование необходимо для подвижности жгутиков и стабильности центросом (Bobinnec Y. et al, 1998; Gagnon С. et al, 1996).
Модель «тубулинового кода», сходная с моделью «гистонового кода», постулирует, что ПТМ тубулина регулируют связывание с белками, ассоциированными с МТ. Таким образом может обеспечиваться дифференциальная активность белков ассоциированных с МТ, а также моторных белков, вдоль различно модифицированных МТ (Bonnet С. et al, 2001; Reed N.A. et al, 2006; Verhey K.J. et al, 2007).
Исследование эффекта ингибирования ВВІРЮ на пост-трансляционные модификации тубулина
Как было описано выше, подавление экспрессии ВВІРЮ в RPE клетках приводит к значительному снижению ацетилирования цитоплазматических МТ и расхождению центриолей. Более детальный анализ данного фенотипа представлен на рисунке ЗОА. Кроме того, при использовании метода фиксирования клеток, который позволяет сохранить неполимеризованный тубулин, оказалось, что в клетках, трансфецированных миРНК к ВВІРЮ, количество МТ .уменьшено, а количество неполимеризованного тубулина увеличено (Рис. ЗОБ). Таким образом, ВВІРЮ не только необходим для ацетилирования МТ, но и для стабильности МТ в клетках.
Представляется возможным, что воздействие ВВІРЮ на ацетилирование МТ может быть обусловлен снижением общего количества МТ. В таком случае другие маркеры стабильных МТ, например глю-тубулин, должны также исчезать. Напротив, было показано, что количество глю-тубулина при подавлении экспрессии ВВІРЮ остается неизменным (Рис. ЗОВ).
Приведенные результаты, полученные с помощью ИФМ, были подтверждены биохимическими методами. Для этого клетки, трансфецированные миРНК к ВВІРЮ, были фракционированы с помощью метода, позволяющего разделить полимеризованный и неполимеризованный тубулин (Minotti A.M. et al, 1991). Затем, осадки (О), содержащие МТ, и супернатанты (С), содержащие неполимеризованный тубулин, были проанализированы с помощью количественного иммуноблота (КИБ), представленного на рисунке ЗОГ. В качестве дополнительного контроля специфичности была использована миРНК к BBS1, так как BBS1 необходим для образования ресничек, и является субъединицей ББсомы, как и ВВІРЮ. Полученные результаты согласуются с данными ИМФ, так как процент тубулина в МТ клеток, трансфецированных ВВІРЮ миРНК, меньше, чем в контрольных клетках. Ацетилированный тубулин практически отсутствует как в осадке, так и в супернатанте, тогда как содержание глю- и полиглю- тубулина остается неизменным.
Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что ВВІРЮ участвует в регуляции ацетилирования тубулина независимо от других ПТМ. Кроме того, ВВІРЮ также необходим для поддержания стабильности цитоплазматических МТ. Учитывая последний результат, была исследована возможность того, что ВВІРЮ непосредственно связывается с МТ и таким образом регулирует их стабильность. Взаимодействие между МТ и очищенным рекомбинантным ВВІРЮ было изучено с помощью метода совместной седиментации. Результаты этого эксперимента, представленные на рисунке ЗОД, позволяют заключить, что ВВІРЮ способен связываться с МТ in vitro.
Мы предположили, что если ВВІР 10 стимулирует полимеризацию тубулина в МТ, то при смешивании этих двух белков должно наблюдаться формирование МТ., Действительно, при инкубации очищенного тубулина, меченого родамином, с концентрацией 10 мкМ, с рекомбинантным ВВІРЮ, с концентрацией 1,5 мкМ, наблюдалась полимеризация МТ (Рис. ЗОЕ). Необходимо отметить, что при концентрации тубулина 10 мкМ спонтанной полимеризации не наблюдалось, как и в случае добавления контрольного белка - гистона Н2В (Рис. ЗОЕ). Концентрация ВВІРЮ, стимулирующая формирование МТ, не отличалась от концентраций, описанных в литературе для других белков (Schatz С.А. et al, 2003).
