Введение к работе
Актуальность проблемы. Цитокины - это родовое название специализированных растворимых белков и пептидов, которые, действуя как гуморальные иммуномодуляторы на отдельные клетки или ткани, принимают участие в регуляции таких важных биологических процессов как гемопоэз, иммунный ответ, тканеспецифическая клеточная пролиферация, апоптоз. В настоящее время, во многих научно-исследовательских центрах мира проводятся интенсивные работы по изучению возможности использования цитокинов для диагностики и лечения различного рода патологий иммунной системы [Егорова и др., 1998; Martino et al., 2000], вирусных инфекций [Tovey et al., 1999; Журкин и др., 2000; Carreno et. al., 2000; Pien et al., 2000; Тимченко и др., 2001] а также в комплексной терапии широкого спектра онкологических заболеваний [Tagawa 2000; Bukowski 2001; Straten et al., 2001]. Объектами подобных исследований являются, в частности, делеционная форма интерлейкина-4 человека - hIL-482 [Arinobu et al, 1999; Glare et al., 2001; Sea et al., 2001] а также - нейротрофин глиального происхождения человека GDNF [Lapchak et al., 1997, Espejo et al., 2001; Zurn et al., 2001].
Изучение экспрессии гена интерлейкина-4 человека (hil-4) показало, что в Т-лимфоцитах периферической крови человека и тимоцитах вместе с мРНК hil-4 экспрессируется и ее делеционный вариант, у которого в процессе специфического (альтернативного) сплайсинга происходит элиминация участка нуклеотидной последовательности, соответствующей экзону 2, а участки, соответствующие экзонам 1,3 и 4, образуют непрерывную рамку считывания для природной делеционной изоформы интерлейкина-4 - hIL-452 [Sorg et al., 1993]. Эксперименты in vitro с рекомбинантным hIL-482 показали, что этот белок является природным антагонистом hIL-4. В частности, hIL4-82 ингибирует как костимулирующее действие hIL-4 на активированные Т-лимфоциты периферической крови человека, так и активацию hIL-4 синтеза IgE и экспрессию CD23 в В-лимфоцитах [Atamas et al., 1996; Arinobu et al., 1999]. В моноцитах hIL-482, напротив, блокирует ингибирующее действие hlL-4 на LPS-индуцируемый синтез циклооксигеназы-2 и последующую секрецию простагландина Е2 [Arinobu et al., 1999]. Результаты исследований позволяют говорить о значительном терапевтическом потенциале hIL-452 как природного антагониста интерлейкина-4.
Другой представитель семейства цитокинов - GDNF-(Glial Cell Derived Neurotrophic Factor), был впервые очищен и исследован в 1993 году. Оказалось, что данный белок способствует выживанию эмбриональных допаминергических нейронов среднего мозга, дегенерирующих при болезни Паркинсона. [Lin et al., 1993], и является ростовым фактором для спинномозговых моторных нейронов [Henderson et al., 1994]. Было показано, что GDNF способствует регенерации сенсорных аксонов при травмах позвоночника [Ramer et al., 2000], участвует в процессах сперматогенеза [Meng et al 2000] и морфогенеза почек [Pichel et al., 1996]. GDNF обладает большим терапевтическим потенциалом и может быть использован для лечения
многих нейропатологий, включая болезнь....,, Партатоопа; -"> боковой
БИБЛИОТЕКА СПе
X 09 M^7«g3J7J
амиотрофический склероз и др. [Lin et al., 1993; Lin et al., 1994, Himot et al., 1996; Bohn 1999; Ozawa et al., 2000].
Одной из основных проблем, возникающих при разработке лекарственных препаратов или диагностических систем на основе цитокинов и подобных им белков, является невозможность выделения этих биомолекул из их природных источников в количествах, достаточных для организации масштабного фармакологического производства. В этой связи, чрезвычайно актуальной становится задача разработки способов получения биологически-активных рекомбинантных аналогов природных белков, в частности, путем оптимизации гетерологичной экспрессии соответствующих генов в бактериальных клетках Escherichia coli.
Цели и задачи работы. Целью представляемой работы было создание на основе клеток E.coli высокоэффективных штаммов-продуцентов рекомбинантных hIL-482 и GDNF. В процессе работы решались следующие задачи:
Конструирование синтетических генов, соответствующих процессированным формам белков hIL-452 и GDNF, с оптимизированной для трансляции в клетках Е. coli нуклеотидной последовательностью.
Конструирование плазмидных векторов, обеспечивающих эффективную экспрессию в клетках E.coli рекомбинантных генов hil-482 и gdnf.
Разработка лабораторной процедуры ренатурации рекомбинантного hIL-482.
Исследование биологической активности препарата рекомбинантного hIL-462.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые в клетках Escherichia coli осуществлена высокоэффективная экспрессия генов MI-4S2, а также gdnf и сконструированы штаммы-продуценты соответствующих рекомбинантных цитокинов. Для достижения максимальной продукции целевых белков учитывался целый ряд факторов, влияющих на эффективность процессов транскрипции и трансляции гетерологичных генов в Е. coli. В частности, проведен комплексный анализ первичной и потенциальной вторичной структур нативной мРНК gdnf, на основании которого разработана схема конструирования трансляционных модулей, состоящих из искусственного участка связывания рибосом (RBS) и синтетического рекомбинантного гена gdnf с оптимизированным для трансляции в Е. coli кодоновым составом. При выборе основных параметров экспрессионных векторов (копийность и стабильность репликона, «сила» и «строгость» регуляции промотора, эффективность RBS) были учтены как токсичное действие обоих гетерологичных белков на бактериальные клетки, так и влияние относительной скорости клеточного биосинтеза целевых белков на процесс формирования структуры образуемых ими телец включения.
Исходя из особенностей формирования третичной структуры
делеционной формы интерлейкина-4, разработана лабораторная методика его
ренатурации и очистки из нерастворимой клеточной фракции «телец
включения». Исследована биологическая активность рекомбинантного hlL-
452. Показано, что in vitro ренатурированный hIL-4<2 ингибирует
костимулирующее действие hIL-4 на активированные тимоциты
периферической крови человека и установлено, что данный эффект усиливается в присутствии циклоспорина А. Данные по биологической активности ренатурированного hIL-4(S2 согласуются с результатами, полученными в аналогичных экспериментах с белком, продуцируемым в растворимой форме в клетках Pichia pastoris [Atamas et al., 1996].
Штамм-продуцент hIL-452 и препарат белка переданы в Институт инженерной иммунологии, а также в Институт Цитологии Новосибирского отделения РАМН для дальнейших структурно-функциональных исследований рекомбинантного делеционного варианта интерлейкина-4.
Штамм-продуцент рекомбинантного GDNF передан в лабораторию НПЦ «Фосфосорб», для дальнейших исследований по изучению возможности создания на его основе эффективных лекарственных биопрепаратов
Структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и Методов, Результатов и Обсуждения, Заключения, Выводов и Списка литературы; иллюстрирована 5 таблицами и 20 рисунками. Библиография содержит 200 наименований.
Похожие диссертации на Эффективная экспрессия в клетках Escherichia coli рекомбинантных генов цитокинов человека: делеционного варианта интерлейкина-4 (hil-4 d2) и нейротрофина глиального происхождения (gdnf)
