Содержание к диссертации
Введение
II. ОБЗОР ЛИТЕРАРУРЫ
ГЛАВА I. Характеристика генома и биологические особенности ретровирусов 4 -30
а) Структура генома ретровирусов 4-5
б) Обратная транскрипция и образование кДНК. 5 3 7
в) Интеграция кДНК 7 - 10
г) Структура и функции ин .10 -16
д) Усиливающие транскрипцию последовательности в ти ретровирусов 16 -20
е) Структурные участки генома, необходимые для самосборки и репликации. 20 -22
ж) Биологические свойства ретровирусов 22-28
з) Регуляция экспрессии ретровирусов общекле точными механизмами 28 -30
и) Общие черты ретровирусов и мобильных генетических элементов 30-32
ГЛАВА II. Векторные молекулы, полученные на основе геномов ретро вирусов . 33-38
ГЛАВА III. Использование других моделей для получения векторов эукариот 39-40
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. , .41-49
1) Используемые вирусы и ферменты. 41
2) Выделение высокомолекулярной ДНК из клеток C-I 41-42
3) Получение 35 s РНК из препаратов 42
4) Получение и очистка кДНК RLV 43
5) Амплификация фагов 43-44
6) Конструирование библиотеки генов 44
7) Скрининг библиотеки генов 44
8) Реклонирование в плазмидные векторы. 45
9) Анализ ДНК методом электрофореза в геле и блоттинг-гибридизации по Саузерну 45-46
10) Выделение ЕсоЖ рестриктазы. . . 46
11) Ник-трансляция. . 46-47
12) Выделение плазмидной ДНК 47
13) Элюция ДНК из агарозного геля 47
14) Выделение ДНК из фагов по Блатнеру.. 47
15) иДот"-гибридизация фаговых клонов 47-48
16) Радиоиммунопреципитационный анализ белков 48
17) Определение нуклеотидной последовательности ДНК. ..48-49
РЕЗУЛЬТАТЫ 50 - 97
I) Получение на фаге Харон 4А библиотеки генов эритролейкозных клеток мышей линии AKR, за ражённых ELV 50 - 54
2) Скрининг библиотеки. 54-56
3) Рестрикционный анализ полученных клонов. 56 - 62
4) Анализ плазмидных клонов, содержащих про-вирусные последовательности . 62-70
5) Получение вектора-экспресси эукариот на
основе провируса из плазмиды 147.2 70 -74
6) Характеристика нровируса экзогенного происхождения на основ из генома клеток C-I 75-83
7) Создание вектора экспрессии на основе провируса из клона 107 .84-93
8) Определение нуклеотидной последовательности ДНК из клона 107.4 93-97
V ОБСУЖДЕНИЕ 98-112
1) Характеристика клонов, содержащих провирусн MuLV 98-103
2) Вектор экспрессии эукариот на основе эндогенного провируса из клона 147. 103 - 104
3) Характеристика провируса экзогенного происхождения 104 - 106
4) Прошторные функции LTR провируса из клона 107 106 - 107
5) Вектор экспрессии на основе провируса из клона 107
6) Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК из 3* части генома провируса клона 107.4 111 -112
VI. ВЫВОДЫ 113 - 114
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТИШ 115 - 135
- Структура генома ретровирусов
- Векторные молекулы, полученные на основе геномов ретро вирусов
- Используемые вирусы и ферменты.
- Получение на фаге Харон 4А библиотеки генов эритролейкозных клеток мышей линии AKR, за ражённых ELV
- Характеристика клонов, содержащих провирусн MuLV
Структура генома ретровирусов
Геном ретровирусов представляет собой молекулу РНК. В вирионах содержится две, обычно одинаковые молекулы РНК от 5 до 9 т.п.н., то есть эти вирусы диплоидны, хотя значение этого явления не ясно. Все недефектные по репликации ретро вирусы, независимо от происхождения, содержат по три гена, продукты которых необходимы для репликации вируса. Ген gag кодирует внутренние белки вириона, ген рої кодирует вирус-ассоциированную РНК зависимую ДНК полимеразу (ревертазу ) , и ген ежт кодирует белки оболочки Г25І . Также имеются ретровирусы, вызывающие саркомы и острые лейкозы птиц и млекопитающих, которые содержат онкогены. Приобретение онкогена ретровирусами часто приводит к утрате части вирус-специфических последовательностей, поэтому большинство быстротрансфор-мирующих вирусов дефектно и может размножаться только в присутствии вируса-помощника. К таким вирусам относятся Мо-М SV , На-MuSV , SFFV ELV и т.д. [26,1573 Геномная РНК ретровирусов несёт на своих концах прямые повторяющиеся короткие последовательности (Е) 21-80 н. длиной P25j Вслед за ft последовательностью на 5 конце РНК расположена уникальная для геномной РІЖ последовательность, названная U 5, а на З конце уникальная для РНК последовательность, названнаяU 3. 5 конец несёт " кэп" структуру, а 3 - ПОЛИСА/ последовательность. Кроме этих двух молекул РНК в вирионе присутствует тРНК клетки-хозяина. Эти молекулы различны у разных вирусов. На расстоянии 100-150 н. от 5 конца вирионной РНК находится 15-23 н. последовательность, комплементарная З1 концевым нуклеотидам тРНК, которая в этом участке связана с вирусной РНК [?63J . б/ Обратная транскрипция и образование кДЖ.
Репликативный цикл ретровирусов включает в себя стадию синтеза на матрице вирионной РБК двухцепочечной кольцевой копии кДНК, которая впоследствии встраивается в геном клетки-хозяина [168J . Позже было показано, что синтез кДНК сопровождается удвоением концевых последовательностей вирионной РНК - U 5 и U3 с образованием структур 5- иЗ- Е - и5 -3, названных длинными концевыми повторами (loig teniimal repeats - MB) 69, 71, 1466. Схема обратной ташскрипции с образованием кольцевой двухцепочечной кДНК, несущей удвоенную последовательность LTE описана в работе Шилбоа с соавторами Г4б J . Авторы приводят также ряд экспериментальршх доказательств существования такого механизма) 46] . На рисунке представлена схема из статьи Жилбоа. Как видно из схемы, синтез а кДНК начинается с ( - ) цепи. Зат вком для синтеза служит молекула тРНК в случае iviO-ffiuLV с тРНКпР . Синтез начинается вблизи 5 конца молекулы РНК и синтезируются последовательности, комплементарные U 5 и Е ( на схеме Ъ и к 1. Затем происходит перескок син-тезированного фрармента ( - ) цепи (Sstroag Ос 5 на 3 конец РНК матрицы, так как на 3 конце также есть последовательность В . После такого перескока происходит элонгация ( - ) цепи кДНК до длины 8,2 т.н., причём синтезированная (-) цепь на своём 5 конце содержит молекулу тРНК. Затем начинается синтез (+) цепи ДНК. Инициация синтеза (+ ) цепи происходит вблизи 5 конца U3 области 8,2 т.н. (- ) цепи ДНК. Синтезируется strong stoppage пь кДНК, включающая U3, U5 и В области, а также участок, комплементарный З концу тРНК. Для синтеза этого участка в случае Mo-iSuLV ориентировочно 20 н. матрицей служит непосредственно тРНК. Это очень важное положение
Векторные молекулы, полученные на основе геномов ретро вирусов
Особенности биологии размножения ретро вирусов, описанные в первой части обзора, свидетельствуют о том, что этот вирус удовлетворяет практически всем требованиям, которые предъяляются векторным молекулам эукариот. Поэтому естественно стремление ряда авторов использовать их для получения таких векторов.
Первые работы по конструированию 1 Titro рекомбинантных ретро-вирусов, способных переносить введённые в них гены, появились осенью 198I года. Это была работа Вей с соавторами П З и работа Іїіимотомо и Тёмина l5"f] . В обеих работах авторы присоединяли к различным ретро вирусным геномам ген ТК вируса герпеса. После трансформации ТК клеток из клонов, обладающих ТК+ фенотипом, с помощью вируса-помощника выделили псевдотипы исходных ретро вирусов, имеющих в составе генома ген ТК. Заражение ТК" клеток таким рекомбинантным ретро вирусом позволяло через неделю получать монослой ТК+ клеток JJ51J . Такте/і образом, ухе первые работы показали насколько удобнее использовать ретровирусы для введения в эука-риотические клетки чужеродного генетического материала по сравне-нию с методами Са преципитации или микроинъекции.
Для получения таких пакующихся в вирионы векторных молекул, несущих чужеродные гены, а также для дальнейшей экспрессии этих генов в составе вирусного генома необходимо соблюдение двух условий: чтобы в векторе содержались гюследователвности, необходимые для упаковки (Е участок ), а также, чтобы транскрипт имел на своих концах те же последовательности, что и геномная РНК ретровирусов. Для соблюдения второго условия желательно, чтобы транскрипция, начавшись на 5 В участке не останавливалась на встроенном гене, а захватила бы U3 область и З В участок. Необходимость этого была показана ещё в первой работе Шимотоно [151J. Чтобы это условие выполнялось, авторы удаляли у встроенного гена участок терминации транскрипции )lo7, 151 , 153]. Если этой процедуры не производили, то титр рекомбинантного вируса, был значительно ниже [107І либо же вообще не удавалось обнаружить вирусных частиц с рекомбинантными геномами l51,L В зависимости от используемого вируса-помощника рекомбинантный вирус хорошо заражал клетки из различных организмов \107j.
Встраивание в геном ретровирусов с-олс генов и их превращение в т-ожогены приводит к утрате ими интронных последовательностей. Естественно бало предположить, что этот процесс происходит прр сплайсинге вирусной РНК с последующей упаковкой сплайсированной РНК в вирион. Хорошим подтверждением этой модели стали работы по получению рекомбинантных ретровирусов, содержащих интрон иро-ванньте клеточные гены и последующий анализ геномной РШ в вирусной популяции. В работе Сорджи и Хагева (.155( авторы использовали в качестве вектора провирус A.SV , так как в геном этого вируса на место гена src МОЛІНО встраивать чужеродные гены и при этом вирус не будет терять жизнеспособность, то есть для его репликации не потребуется вирус-помощник. При: встраивании в этот вирус кДНК
Р( -хорионного гонадотропина человека (о( -ХГТ/ авторы полумили жизнеспособный вирус. Но попытка встроить в ASV ген о{ -ХГТ человека, содержащий два интрона в 3450 п.н. и 500 п.н., оказалась неудачной. Удаление промоторной области гена J -ХГТ, сайта поли-аденилирования, а также 1900 п.н. из большого интрона, также не привели к успеху, так как рекомбинантный геном был на 900 п.н. длиннее, чем провирус ASVдикого типа. Тогда авторы удалили ещё 1000 п.н. из большого интрона. После этого удалось получить ви - 35 русные частицы ASV с рекомбинантным геномом. Анализ РНК из этих частиц через ряд генераций вируса показал, что примерно половина, из них содержит безинтронные копиисЛ -ХГТ, тогда как другая половина совершенно не подверглась сплайсингу.
Используемые вирусы и ферменты
Вирусы. Препараты BLV, выделенного из культуралъной жидкости клеток JbS- 9, получены в виде 130-кратных концентратов из Национального института рака США ( Бетезда, Мэриленд) . Mo- ffiaLV, клонированный в плазмиде рВЕ 322, любезно предоставлен Гофф Д. Балтимор .
Б работе использовались следующие ферменты: рестриктазы Ват III - предоставлена Поповым Л.С./ИМГ ЛИ СССР, Москва/, В gill и Р vu И - предоставлены Ениколоповым Г .И. /ИМЕ АН СССР Москва/, Н iad Щ - предоставлен Поповым Л.С, а также Бендукидзе К.А. /ИББН АКСССР, Пущино/, st J. - предоставлена Зайцевым Й.З. / ВНІІДЗ AJvJ-I СССР, Москва/, Кр I -предоставлена Бендукидзе К.А. /ИБВН АН СССР, Пущино/.
Мигаза фага Т4 - предоставлена Патрушевым Л.Й. / УІJX АН СССР, Москва/.
Также использовались рестриктазы и лигаза, производимые в Вильниюсе / ВНИИПЭ /, Пущино/ ИБФМ / и Бердске/ СКТБ БАВ /.
Выделение высокомолекулярной ДНК из клеток С-І. Приблизительно 10 клеток суспензионной культуры С-І дважды промывали раствором Хэнкса, клетки суспендировали в 10 мл 0,15 М НаС1? 0,015 М цитрата натрия (Ix SSC7 0,25 мкг/мл проназы ( Calbioobem)
и добавляли SDS до 0,5 ». Полученный лизат клеток инкубировали 30 мин. при 37С. добавляли 10 мл фенола, насыщенного Ix SSC и вели депротеинизацию 10 мин. при комнатной температуре. К водной фазе добавляли равный объём смеси хлорофюрм-изоамиловый спирт ( 24/1 )и проводили реэкстракцию водной фазы до полного исчезновения интерфазы. ДНК осаждали двухкратньм объёмом этанола. ДНК растворяли Б 10 мл 0,1 xSSO . добавляли I мл IOxSSC и 0,5 мл раствора РНК-азы А (1 мг/мл ) и инкубировали 30 мин при 37С. Затем добавляли проназу 0,25 мг/мл и SDS до 0,5% и инкубировали 30 мин при 37С. ДНК экстрагировали I раз фенолом и два раза хлороформ-изоамиловым спиртом и осаждали двухкратным объёмом этанола, затем растворяли в 0,1 xSSC и хранили при -70С. Получение 55s РНК из препаратов ВЬУ RLV, очищенный в градиенте концентаций сахарозы, ресуспендирова-ли в 20 мМ Трис-HCI (рН 8,5) , 10 мМ ЭДТА, добавляли SDS до 0,5% и тРНК дрожжей до 5 мкг/мл. Лизис вели при комнатной температуре при встряхивании до полной прозрачности раствора. Вирусную РНК экстрагировали равным объёмом фенола. "Интерфз.зу также экстрагировали фенолом. Обе водные тазы объединяли и экстрагировали смесью фенол:хлороформ ( I:i) . К водной тазе добавляли IV10 ооъёма 2 IvI ацетата натрия ( рН 5,5 ) и 2 объёма этанола. Осадок растворяли в 10 мМ Три с -НС I ( рЫ 7,5) , 20 ш! KaCl , 0,05% SDS и наносили на 10-30% градиент понцентрации сахарозы, приготовленный на том же бутере. РНК центрифугировали 4,5 часа при 40 тыс. оо/мин. в роторе SW - --Л. . БысокомолекулярнуТо преципити-ровали 2 объёмами этанола. РНК осаждали центрифугированием при 25 тыс об/мин. в течении 30 мин., растворяли в том же буфере и инкубировали при 80С в течении 3 мин. для плавления пимер-ных структур. Затем РНК наносили на 10-30% градиент концентраций сахарозы и центрифугировали 2 часов при 40 тыс. об/мин. в роторе SW -41. Пик фракций 35S РНК преципитирова.ли 2 объёмами этанола, растворяли в 20 Mivi Трис-НСІ (рН7,5) , 20 мМ ІГаСІ и 1 мгл 5ДТА и хранили при -70С.
Получение на фаге Харон 4А библиотеки генов эритролейкозных клеток мышей линии AKR, за ражённых ELV
Для получения библиотеки использовали недорестрицированную по EcoRI ДНК из клеток C-I. Для получения наиболее представительной библиотеки использовали смесь недорестриктов по ЕсоЭДв геномной ДНК, которые получали варьируя время рестрикции и соотношение ДНК: фермент. Впоследствии все эти фракции, а также фракцию, содержащую полностью рестрицированную по ЕсоЩ геномную ДНК, объединяли. Из-за малого количества материала для получения данной библиотеки смесь недорестрицированной ДНК не фракционировали по размерам в градиенте концентраций сахарозы. Как показал опыт, эффективность упаковки в фаговые частицы такой нефракционированной ДНК лишь в 1,5-2 раза ниже, чем фракционированной. Однако наличие низкомолекулярных фрагментов среди ДНК, предназначенной для лигирования, должно вносить ряд аномалий при получении рекомбинантных фаговых клонов. Подробнее об этом будет сказано в обсуждении.
Фаг Харон 4А перед препаративным выделением для создания библис теки был высеян на чашку с агаром, содержащим 5-бром-4 - хлор-3-ан-долил -g- Д-галактозид /Х- gal/. Для дальнейших процедур была взята синяя бляшка.
Для препаративного выделения фаг Харон 4-А высевали на фотографические кюветы /размер 30x40 cm / с 1,5% агаром, содержащим 20 мМ М gCIg. Агар был накрыт целофановой пленкой, стерилизованной кипячением. Культура клеток-хозяев /LE 392/ наращивалась до плотности I 0D при 560 нм. Рост клеток происходил в ЬВ с 20 мМ М gCI2 и 0,4-% мальтозы. Фаг растили 18 часов при 37С. С двух кювет удавалось получать 1-1,5 мг ДНК фага Харон М.
Для получения "плечей" 400-500 МЕГ ДНК фага Харон 4А лигировалі в присутствии 50 мМ И аС1 2-3 часа при комнатной температуре. Концентрация ДНК при лигировании была 80U-J.000 мкг/мл. Лигированную по собственным липким концам ДНК фага рестрицировали ЕсоРІ рестрикта-зой в условиях, позволяющих получить максимально полную рестрикцию. Такую лигированную и рестрицированную ДНК фракционировали в 10-40% _ градиенте концентраций сахарозы как описано в разделе "материалы и методы". Градиент раскапывали со дна фракциями по 0,5 мл. Наличие ДНК во фракциях тестировалось электрофоретически. На рис. з Д&н распределение фрагментов ДНК фага Харон4А после фракционирования в градиенте концентраций сахарозы. Для дальнейшей работы использовались фракции с минимальным содержанием "внутренних" ЕсоЩ фрагментої ДНК фага Харон4А.
Перед получением библиотеки как рестрикт геномной ДНК, так и "плечи" ДНК фага проверялись на способность лигироваться сами на себя. Для "плечей" марером на лигирование служили примеси "внутренних" ЕсоЩ фрагментов, присутствующие в препарате /рис. за /
Лигирование "плечей" и геномной ДНК производилось в условиях, описанных в работе Маниатиса с соавторами [101J # Упаковочная смесь готовилась по методике, описанной в работе Коллинза с соавторами \2fj . Эффективность упаковки была 1-5 10 БОЕ/мкг ДНК фага. Клетки LE392 для титрования и ампжфикации фагов из библис теки выращивали в присутствии 0,4% мальтозы. Амлификация проводиласі вхВ с 20 мМ MgCL . Упаковочную смесь перед адсорбцией фагов на клетках разводили в 20 раз, чтобы избежать токсичного действия сме- си на клетки Е.со li. Количество рекомбинантных фаговых частиц оцени вали высевом библиотеки на чашки с агаром, содержащим Х- 6а1 . Коли-чество сивих бляшек не превышало 2-3%. Всего получено 5 10 рекомбинантных фаговых частиц. Если принять, что средняя величина вставки
Характеристика клонов, содержащих провирусн MuLV
В геноме мышей различных линий обнаружены повторяющиеся последовательности ДНК, имеющие гомологию с геномом мышиных лейкозных вирусов (ицідг ) [23І Э и последовательности могут иметь двоякое происхождение: они могут быть производными провирусов экотропных или ксенотропных эндогенных MuLV . Лонусы эндогенных экотропных и инду-цибельных ксенотропных MuLV были охарактеризованы генетическими методами L81!82! » однако, они составляют только небольшую часть из 15-30 копий ffiabv - специфических последовательностей, обнаруженных в мышиной ДНК р723Д . Основная часть последовательностей эндогенных MubV пренадлежит к классу ксенотропных вирусов. Среди множества копий провирусов этого класса, обнаруженных методом молекулярной гибридизации, только один кодирует инфекционный вирус (_823 . Различия между результатами биологических экспериментов, в которых был обнаружен только один локус инфекционного ксенотропного MuEV , и гибридизационными экспериментами, в которых было обнаружено множестве копий интегрированного генома этого вируса, объясняются тем, что большинство провирусов MuLV этого типа дефектно, Большая часть клонированных и охарактеризованных последовательностей, являющихся прои водными ксенотропных эндогенных MuLV, по рестриктной карте отличаются от провирусов инфекционных MuLV и содержат делеции центральных областей провирусаГ22,79#93,гіЗ,159] #
В работе исследовались структура и происхождение интегрированных провирусов в эритролейкозных клетках С-І. Эта клонированная культура суспензионных клеток была получена из лейкозных селезенок мышей линии АКР, инфицированных ELV . Клетки С-І являются лейкозными эри-тробластами и продуцируют дефектные вирусные частицы С-типа ]3 J Таким образом, в геношклеток C-I могут присутствовать ретровирусные последовательности как эндогенного, так и экзогенного происхождения. Для получения провирусных последовательностей была сконструирована библиотека генов клеток C-I.
Сконструированная библиотека генов, представленная 500 000 клонов, позволяет с 9$?о вероятностью выделить уникальные последовательности, входящие в состав фрагментов Eco RI рестрицированной ДНК длиной меньше 20 тыс. пар нуклеотидов. Для скрининга библиотеки генов была использована меченная кДНК ELV . Синтезированная кДНК позволяет выявлять клоны, содержащие последовательности KaXV различных классов, поскольку геном BLV имеет 80-90% гомологии с РНК экот-ропных эндогенных вирусов и примерно 50% - с РНК ксенотропных эндогенных MuLV L"I6,17J . Кроме того, в препаратах неклонированных экзогенных вирусов обычно имеются примеси ксенотропных вирусов и вирусов группы MCF, что повышает эффективность гибридизации кДНК, синтезированной на матрице 60-70$ РНК из препаратов BbV" с провирусами эндогенного происхождения, особенно с последовательностями ксенотропных Маїлг # Контаминацией препаратов HLV вирусами, содержащими после довательности эндогенных MubV t можно также объяснить феномен более эффективной гибридизации ДНК клонов, содержащих последовательности MabV эндогенного происхождения, с кДНК BLV % по сравнению с клонированной ДНК M-MaLV#
Все исследованные клоны содержат BtabV - специфические последовательности, т.к.: I) ДНК из этих клонов гибридизуется с кДНК 1Ь?# 2) Часть клонированных ДНК имеет типичную для провирусов симметричную структуру, то есть отграничена от клеточных последовательностей прямыми повторами С ЫЕ ), для которых характерно сочетание сайтов узнавания рестриктазами Sad и Sma I. 3) Часть клонов содержит последовательности, кодирующие структурные виручные белки.
