Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 Гепатит В 8
1.2. Вакцины против гепатита В 13
1.3. Вакцины на основе химерного HBcAg 17
1.4. Способы доставки антигенов HBV 27
2. Материалы и методы 38
2.2 Выделение плазмидных ДНК 40
2.3 Трансформация бактериальных клеток 41
2.4 Конструирование рекомбиантных ДНК 41
2.5 Выделение рекомбинантных белков 42
2.6 Электрофорез в акрилами дном геле и иммуноблоттинг белков 43
2.7 Электронная микроскопия 43
2.8 Иммунизация лабораторных животных 44
2.9 Иммуноферментыый анализ 44
2.10 Трансфекция 45
2.11 ELISPOT 45
2.12 Математические методы исследований 46
3. Результаты и обсуждения 47
3.1. Конструирование химерных HBcAg 48
3.1.1. Выбор иммуиогенных фрагментов поверхностного белка HBV 48
3.1.2. Конструирование плазмид, экспрессирующих химерные белки НВс, несущие эпитопы preS 1 и preS2
3.1.3. Анализ физико-химических параметров встроек в HBcAg 56
3.2. Исследование иммуногенности химерных частиц HBcAg 65
3.3. Способы доставки HBcAg 72
3.3.1. Доставка HBcAg с помощью аттенуированного штамма сальмонеллы S. enteridlUs Е-23 72
3.3.2. Конструирование и исследование иммуиогенных свойств ДНК вакцины на основе HBcAg
Заключение 86
Выводы 89
- Вакцины против гепатита В
- Способы доставки антигенов HBV
- Электрофорез в акрилами дном геле и иммуноблоттинг белков
- Исследование иммуногенности химерных частиц HBcAg
Введение к работе
По данным ВОЗ (Материалы ВОЗ, 2000, 2002) 30% населения мира, около 2 миллиардов человек, больны, инфицированы или перенесли заболевание вирусным гепатитом В. Ежегодно в мире от данной инфекции умирает около 750 тыс. человек. Опасность и широкая распространенность гепатита В также связаны с тем, что из общего числа первично инфицированных гепатитом В 2-Ю % заболевших становятся хроническими носителями HBV- инфекции. Всего в мире насчитывается примерно 350 миллионов хронически инфицированных человек.
Один из путей решения проблемы - применение вакцин, В настоящее время несколько зарубежных и отечественных фирм производят вакцины против гепатита В. основным компонентом которой является дрожжевой рекомбинантный HBsAg. Многочисленные клинические испытания подтвердили эффективность таких вакцин. Длительные наблюдения за массовой вакцинацией в эндемичных районах показали, что применение вакцин на основе HBsAg позволило снизить заболеваемость гепатитом В в несколько раз (Da Villa et al, 1998; Ni et ей, 2001).
Тем не менее, дрожжевая вакцина, применяемая сегодня, имеет ряд недостатков. Основной из них - низкая иммуногенность вакцины. В результате, для достижения длительного протективного ответа требуется трехкратная вакцинация. Кроме того, сугцествует категория людей, у которых вообще не развивается сероконверсия посяе стандартной схемы вакцинации (Carman et ей, 2000; Не et. а/, 2001).
Другим недостатком является то. что существующая инъекционная форма вакцины на основе HBsAg не стимулирует мукозальный иммунный ответ и ие обеспечивает резистентность во входных воротах инфекции. В то время как доля непарентерального пути' передачи вируса в последние годы драматично увеличивается (Mikhailov et al, 2002; Arima el ей, 2003). Более того, вакцина на основе HBsAg ие обеспечивает формирования полноценного клеточного иммунного ответа, который необходим для обеспечения более эффективной защиты организма от вируса. Клеточное звено иммунитета особенно важено для предотвращения хронизации вирусной инфекции. Как было показано (Lohr et al, 1993; Missale el al, 1993; Chisari, 2000), клеточный ответ иммунной системы при вирусной инфекции возникает в основном на коровый белок вируса (HBcAg) и его величина имеет существенное значение для исхода заболевания. Применение активной иммунизации HBcAg в терапевтических целях может уменьшить риск развития хронической инфекции и будет полезно при лечении хронических больных.
Таким образом, несмотря на эффективность дрожжевой вакцины необходимость в разработке новых вакцин против ГВ, превосходящих или дополняющих используемую в настоящее время, не вызывает сомнений.
Считается, что одно из направлений повышения иммуногениости дрожжевой вакцины - включение в состав HBsAg эпитопов из preSl и preS2, способных обеспечить протективный иммунный ответ к HBV инфекции (Neuratii et al, 1987; Neurath et al, 1989). Кроме того, для стимуляции клеточного звена иммунитета в вакцину необходимо включать HBcAg (Milich et al, 1987; Jung et al, 2002). Известно, что HBcAg является привлекательным носителем чужеродных антигенных детерминант для создания вакцин (Francis et al, 1990; Pumpens et al. 1995; Карпенко и dp, 2000). Таким образом, было бы перспективно объединение HBcAg - мощного стимулятора иммунной системы, и известного протекти вного антигена - области prcS поверхностного белка для создания более эффективной вакцины против гепатита В.
Для разработки вакцин, стимулирующих мукозальный иммунный ответ можно использовать такие подходы, как липосомные конструкции, содержащие антигены (Zho and Neutra, 2002), вирусные вектора, доставляющие гены патогенов (Crotty et al, 1999; Babiuk and Tikoo, 2000). Весьма интересным в этом плане представляется создание вакцин на основе живых аттенуированных штаммов сальмонелл, продуцирующих чужеродные антигены. Ослабленные, но способные к инвазии, рекомбинантные штаммы сальмонелл являются привлекательным средством представления гетерологичных антигенов слизистой и системной иммунной системе. Сальмонеллы обладают естественной способностью проникать через эпителий слизистой, преимущественно через М-клетки и размножаться как в локальных интерстипальыых лимфоидных образованиях, так и парентеральной лимфоидыой ткани. Таким образом, сальмонеллы дают возможность иепареитерального способа введения вакцин, индуцируют клеточный, гуморальный и секреторный звенья иммунитета, способствуя развитию резистентности во входных ворогах инфекции (Schodel and Curtiss R 3r, 1995; Stacker, 2000).
Так как клеточный иммунный ответ играет значительную роль в элиминации вируса из организма необходимо, чтобы вакцина против ГВ, обеспечивала усиление именно этого звена иммунитета. Одним из таких подходов может быть ДНК вакцинация. Работы последних лет показывают, что наиболее полного и адекватного иммунного ответа при вакцинации можно достичь, применяя схемы, включающие в себя несколько способов доставки, такие как рекомбинаитный белок и ДНК вакцина.
несущая ген того же белка ( Konishi et al, 2003; Coban et al, 2004; Xiao-wen et al, 2005).
Целью данной работы было получение и исследование иммуногенности химерных частиц HBcAg, несущих эпитопы районов preSl и preS2 поверхностного белка I-IBV; получение и исследование иммуногенных свойств аттенурованыого штамма сальмонелл, продуцирующего HBcAg и ДЫК вакцины, содержащей ген HBcAg.
Для этого было необходимо решить следующие задачи:
сконструировать химерные частицы HBcAg, несущие эпитопы районов preS 1 и preS2 поверхностного белка HBV
изучить иммуногениость полученных химерных частиц HBcAg
получить аттенуированный штамм сальмонеллы, продуцирующий HBcAg
изучить иммуногениость аттенуированного штамма сальмонеллы, продуцирующего HBcAg
сконструировать ДНК вакцину, несущую ген HBcAg
изучить иммуногениость ДНК вакцины, несущей гея HBcAg
Вакцины против гепатита В
Первый опыт активной иммунизации против гепатита В принадлежит американскому педиатру С. Кругман. В 1971 году было показано, что прокипяченная сыворотка носителей HBV иммуногенна, не приводит к заражению и, следовательно, может быть использована в качестве вакцины (Krugman et at, 1971). Впоследствии значительные усилия исследователей были направлены на очистку поверхностного антигена из сывороток пациентов и инактивацию остающегося в препаратах вируса. Было показано, что после различных способов инактивации (тепловое воздействие, ультрафиолет, обработка мочевиной и ферментами протеолиза) HBsAg в достаточной мере сохранял свои антигенные свойства (Karelin et al, 1980). Результатом этих работ стала разработка коммерческого продукта Heptavax В, содержащей очищенный поверхностный белок HBV, обработанный формалином. Вакцина прошла клинические испытания. Более 1000 молодых людей Нью-Йорка, гомосексуальной ориентации были вовлечены в исследования. У 95% вакцинированных были обнаружены антитела к HBsAg, при этом титр антител определялся в течение не менее 2 лет. За этот период среди вакцинированных лиц заболевших ГВ было выявлено 3,2 %, в то время как в контрольной группе оказалось 25.6 % заболевших (Szmuness et at, 1981). Положительные результаты вакцинации были получены и для других групп риска - пациентов нуждающихся в гемодиализе и медицинских работников (Szmuness et al, 1982). Таким образом, было доказано, что создание эффективной вакцины против ГВ возможно. Однако, инактивированные вакцины имели серьезные недостатки - очень высокая цена сырья - сыворотки крови и вероятность недостаточной инактивации HBV и других патогенов при производстве вакцины. Вакцины на основе рекомбинантного HBsAg Развитие генной инженерии сделало возможным синтез необходимых белков в прокариотических и эукариотических клетках. Попытка экспрессировать ген белка HBs Б прокариотической системе E.coli (Charnay et al, 1980) оказалась неудачной -рекомбинантный HBsAg не был гликозилирован и по антигенным характеристикам отличался от природного антигена.
Эта проблема была решена с помощью другой системы экспрессии -Saccharomyces cerevisiae, в которой белки гликозилируются. В работе (Valenzuela et al, 1982) впервые сообщалось о клонировании гена поверхностного белка в клетках дрожжей. В дальнейшем была показана антигенная и иммунологическая эквивалентность полученного белка и HBsAg, выделенного из сыворотки носителей HBV (Eminief al, 1986). В настоящее время несколько зарубежных и отечественных фирм производят препараты вакцин на основе дрожжевого рекомбинантного HBsAg. Многочисленные клинические испытания подтвердили эффективность вакцины для различных групп населения. Так в одной из первых работ показано, что после трехкратной иммунизации вакциной "Энджерикс-В" (СмитКлайн Бичем Биомед) молодых людей со средним возрастом 20 лет серокоыверсия происходит у 96% иммунизированных (Zuckerman, 1998). При применении данной вакцины для новорожденных достигается уровень сероконверсии 98,3-100% (Poovorawan et al, 1992). Были выявлены факторы, снижающие эффективность вакцинации - возраст старше 50 лет, избыточный вес и курение (Wood et al, 1993). Важным показателем является не только процент лиц, у которых была выявлена сероконверсия, но и титр антител к HBsAg. Еще в работах по вакцинации препаратами, приготовленными из сывороток крови носителей HBV, было показано, что протектйвным является титр антител порядка 10 mlU/ral (Jack, 1999). Надо отметить, что с течением времени после вакцинации титр антител неизбежно падает. И, если изначально он составлял 100 mlU/ml , то снижение титра антител в десять раз происходит в течение первого года после вакцинации, а через 4 года титр антител уменьшается в сто раз (Jilg et al, 1988). Клинические исследования, проводимые разными авторами, дают различающиеся средние результаты уровня титра антител, даже, если применялся препарат одной фирмы и по единой схеме иммунизации. (Treadwell a/, 1993). Были проведены исследования, в которых попытались максимально приблизить антиген к природному аналогу, добиваясь синтеза HBsAg в клетках млекопитающих. Однако, существенного преимущества перед HBsAg, продуцируемым в дрожжах, обнаружено не было (Diminsky et al, 1997 ). Длительные наблюдения за массовой вакцинацией в эндемичных районах показали, что применение вакцин на основе HBsAg позволяет снизить заболеваемость в 10 раз. Например, на Тайване до начала компании по вакцинации новорожденных количество носителей HBV достигало 15-20% населения (Ni et al, 2001). Через 15 лет были обследованы пятнадцатилетние подростки, получившие вакцину при рождении, и молодые люди 15-20 лет, которые родились раньше и не вошли в число привитых. Среди пятнадцатилетних у 0,7% обнаруживался HBsAg, в то время как во второй группе таких лиц оказалось 7%. Аналогичное исследование, проведенное до начала программы вакцинации, выявило 9,8% носителей HBsAg. Такой же успех был достигнут в северной части Италии (Da Villa et al, 1998). Заболеваемость острым гепатитом В уменьшилась с 63 случаев в год на 100.000 населения до 3 на 100.000, а количество носителей HBsAg уменьшилось с 6,8% до 0,7% за 15 лет. Тем не менее, дрожжевая вакцина, применяемая сегодня, имеет ряд недостатков: высокая стоимость препарата и необходимость трехкратного введения для достижения длительного протективного ответа.
Эти факторы мешают осуществлению масштабных программ профилактики особенно в развивающихся странах. Следует также отметить, что элиминацию вируса гепатит В нельзя осуществить в короткий срок массовой вакцинации, как это произошло с вирусом натуральной оспы, т.к. существует резервуар вируса - хронические больные гепатитом В, лечение которых на сегодняшний день является нерешенной проблемой. Таким образом, в случае гепатита В массовая вакцинация должна охватывать большой временной промежуток, не меньше продолжительности жизни носителей вируса. При массовой вакцинации выявилась еще одна проблема - мутации в геноме вируса, позволяющие патогену избежать элиминации из организма вакцинированных. Так в работе (Carman et al, 1990) описано 44 случая заболевания детей после вакцинации в больницах южной Италии. У 32 пациентов были обнаружены маркеры активной репликации вируса. Исследования вирусных геномов показали, что большинство изолятов вируса содержали мутации в районе основной антигенной детерминанты HBsAg - аминокислотные замены или делении. В другом регионе проведения вакцинации - в Китае из 176 здоровых иммунизированных взрослых людей через год после вакцинации у шести была обнаружена вирусная ДНК в сыворотке крови. В четырех изолятах вируса были отмечены мутации в главной антигенной детерминанте HBsAg (Не et al, 2001), Еще одна проблема применения современных вакцин - не 100% эффективность. Этот параметр не так важен для массовых вакцинаций населения, 5-10% лиц не внесут кардинальных изменений в эпидемиологическую ситуацию. Однако есть группы профессионального риска, в первую очередь медицинские работники, для которых важна гарантия защиты от заболевания гепатититом В. Одно из направлений улучшения вакцины на основе S антигена - включение в ее состав районов preSl и preS2 HBsAg. Испытания ваісцин, включающих в себя не только HBs, но и районы preS целиком или частично, показали, что такие препараты у 90-95% вакцинированных индуцируют синтез антител к preS районам (Miskovsky et al. 1991). Более того, такие препараты вызывали синтез антител к HBsAg у 65% пациентов, иммунная система которых раньше не отвечала на стандартную вакцину. Исходя из роли в иммунном ответе районов preS (см. гл. 1.2) можно ожидать, что вакцины, включающие preSl и. preS2, окажутся, в некоторых случаях, весьма полезными. Таким образом, несмотря на эффективность существующих препаратов есть необходимость продолжать исследования по разработке новых вакцин для профилактики гепатита В, превосходящих или дополняющих используемую в настоящее время вакцину.
Способы доставки антигенов HBV
Кроме введения в состав вакцины других белков патогена перспективно использование различных способов доставки антигенов в организм. Применение различных средств доставки антигенов может позволить существенно удешевить вакцинный препарат, использовать не инъекционный путь введения препарата, стимулировать не только системный иммунный ответ, но и иммунитет слизистых, уменьшая вероятность передачи вируса половым путем, а также корректировать иммунный ответ, усиливая стимуляцию клеточного звена иммунитета. ДНК-вакцины Новые перспективы в вакцинологии открылись в начале 90-х годов прошлого столетия, когда было показано, что простая инъекция плазмидной ДИК в мышцу приводит к поглощению этой ДНК клетками и экспрессии кодируемого плазмидой репортерного гена (Wolff et al, 1990), Сравнительно простой способ конструирования и возможность использования единого подхода ко многим патогенам позволили в короткие сроки создать ряд каидидатниых ДНК-вакцин против широкого спектра вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций, ДНК-вакцина представляет собой бактериальную плазмиду, содержащую геи одного или нескольких антигенов инфекционного агента под контролем эукариотического промотора. При использовании ДНК-вакцин синтез иммуногенов происходит непосредственно в клетках хозяина, что снимает проблему неправильного процессинга и выделения рекомбинантных белков. ДНК-вакцинация имитирует представление антигена клеткам иммунной системы при поражении вирусом, т.к. белок синтезируется непосредственно в цитоплазме, и эпитопы антигена экспонируются на поверхности клетки в комплексе с МНС І. В результате введения ДНК-вакцин Т-клеточное звено иммунного ответа стимулируется в большей степени. Таким образом, этот способ введения антигена наиболее эффективен при создании иммунитета против вирусных инфекций, В ряде работ (Davis et al, 1996 a; Bohm et al, 1996; Geissler et al, 1997) иммунизация мышей ДНК-вакциной, содержащей ген HBsAg, стимулировала формирование выраженного цитотоксического ответа и индукцию Т-хелперов. Цитотоксический ответ обнаруживался уже через неделю после иммунизации и наблюдался в течение нескольких месяцев (Geissler et al, 1997). Индуцировался и гуморальный иммунный ответ.
Титр антител увеличивался при введении бустерной дозы ДНК-вакцины или рекомбинантного HBsAg (Davis et al, 1996 b). Испытание ДНК-вакцины с геном S-ai-ітигена на шимпанзе показало, что двукратное введение 2 мг препарата индуцировало высокий уровень антител, до 1100 mUI/ml. Однако титр антител быстро снижался, и его удавалось сохранить на длительный срок только после двух дополнительных инъекций. Введение более низких доз (400 міст) не способствовало формированию устойчивого уровня антител в сыворотке крови, и титр антител не превышал 60 mlJI/ml (Davis et a.L 1996b). Трехкратная иммунизация новорожденных шимпанзе ДЫК-вакциыой не стимулировала гуморальный ответ, но оказалось достаточной для предотвращения инфекции после заражения животных, вероятно, за счет формирования клеточного ответа (Prince et al, 1997). Проводились и исследования ДНК-вакцин, содержащих гены белков ITBcAg и HBeAg. ДНК-вакцины, содержащие эти гены, индуцировали примерно равный иммунный ответ (Kuhrober et al, 1997). Поливалентная ДНК-вакцина, содержащая гены поверхностного и корового белков HBV, тоже стимулировала гуморальный и клеточный ответ у мышей разных линий к обоим белкам (Wild et al, 1998). Существенную роль в индукции иммунного ответа играет количество синтезированного антигена в клетках организма. Для оптимизации экспрессии гена были испробованы несколько эукариотических промоторов: промоторы ранних генов цитомегадовируса и вируса SV40, промотор гена белка десмина, активно транскрибирующегося в мышцах (Xiang et al, 1995- Kwissa et al, 2000; Cazeaux et al, 2002). При использовании всех перечисленных последовательностей инициации транскрипции эффективно индуцировался гуморальный ответ. Следует отметить, что время иммунизация животных ДНК-вакциной с промотором цитомегаловируса позволяла добиться более высокого гуморального ответа, чем при вакцинации конструкцией с промотором гена десмина (Cazeaux et al, 2002). Это, вероятно, обусловлено тем, что промотор цитомегаловируса обеспечивает эффективную транскрипцию целевого гена не только в специализированных клетках мышц. Другой способ увеличения продукции белка после введения ДНК-вакцины -оптимизация кодонов репортерного гена.
Последние данные показывают, что кодоны вирусного генома не являются оптимальными для синтеза вирусных белков в клетках человека Было показано, что замена кодонов нативных генов gpl20 и gag HIV на кодоны высоко э репрессируемых генов человека приводит к значительному увеличению экспрессии модифицированных генов, а также титров антител и активности CTL у иммунизированных животных (Andre et al, 1999; zur Megede et al, 2000). Кроме того, представление вирусных антигенов иммунной системе после введения ДНК-вакцины происходит совместно с молекулами МНС I класса. При этом вирусные антигены распознаются специфическими Т-лимфоцитами яе как полноразмерные белки, а как короткие пептиды (8-12 а.о.), ассоциированные со специфическими молекулами МНС I класса. Эти короткие антигенные эпитопы появляются из вирусных цитоплазматических белков в результате протеасом-опосредуемого процессинга. Поэтому для увеличения иммуногенности полн-CTL-эпитопных вакцин необходимо стремиться к созданию конструкций, обеспечивающих их эффективный процессинг и освобождение детерминант-Действительно, было показано, что увеличенная деградация белков повышает продукцию, презентацию и иммуиогенность антигенных пептидов (Livingston et al., 2001). Возможно повышение эффективности ДНК-вакцин путем введения в их состав генов цитокиыов. Иммунизация мышей ДНК-вакцинами, содержащими гены разных цитокинов показала, что введение генов цитокинов Ил2, Ил 12, ИФН у (Chow el al, 1998; Niethammer et al, 2001; Du el al, 2003) усиливает цнтотоксический ответ, при этом секретируготся антитела преимущественно lgG2a субтипа. Введение в состав вакцины гена Йл4, наоборот, увеличивает синтез иммуноглобулинов субтипа IgGl и ведеч- к снижению цитотоксического ответа (Chow et al, 19.98). Таким образом, исследования на животных убедительно показывают возможность вакцинации против ГВ ДНК-вакцинами. При вакцинации людей ДНК-вакциной, содержащей ген поверхностного белка HBV, была использована низкая доза плазмидной ДНК - 0,25 мг. Введенный в кожу двукратно сорбированный на золоте препарат ДНК-вакцины вызвал высокий титр антител только у одного из вакцинируемых (Tackel et al, 1999). Использование большей дозы препарата (4 мг) в последующем эксперименте позволило достичь индукции гуморального ответа у всех 12 испытуемых, титр антител составлял пе менее 10 mill/ml. Среди индуцированных Т-хелперных клеток преобладали Txl. Вакцинация стимулировала развитие цитотоксического ответа, и ирепараї ДНК-вакцины хорошо переносился испытуемыми.
Электрофорез в акрилами дном геле и иммуноблоттинг белков
Электрофоретическое разделение белков проводили в 15%-ном поли акри л амидном геле по Лэмли (Laemmly, 1970). Клетки осаждали из 1 мл культуры. К осадку добавляли 40 мкл лизиругащего буфера (1М трис-HCl рИ 8,8, 5% ДСН, 20% глицерин, 10% меркаптоэтанол, 0,02% бромфеноловый синий) и выдерживали на кипящей водяной бане 5 мин. Электрофоретическое разделение белков проводили в полиакриламидном геле в присутствии 0Д% ДСН. Этот же раствор использовали для последующей отмывки фильтров и для инкубации с конъгогатом антител козы к IgG (кролика или мыши) со щелочной фосфатазой. Последнюю промывку проводили буфером 0,05М трис-HCl, рН 9,2, MgCl2 0,005М, 0Д5М NaCl. В качестве субстратов для щелочной фосфатазы при выявлении иммунных комплексов использовали 5-бром-4-хлор-З-индолил фосфат и нитротетразолевый синий. В случае использования метода дот-блота бактериальные культуры лизировали в растворе 0,1 М трис-HCl, 1% ДСН, 10% меркаптоэтанол. Лизаты наносили на нитроцеллюлозный фильтр и далее проводили иммуноблоттинг как описано выше. Электронная микроскопия Для электронной микроскопии HBcAg и HBcAg-HBsAg частицы адсорбировали на сеточках с формваровой подложкой в течение 1-2 мин. Электронная микроскопия коровых частиц была проведена Зайцевым Б.Н. (ГНЦ ВБ "Вектор") Был применен метод негативного контрастирования образцов 1% -ным раствором уранилацетата. Исследование проводили с использованием электронного микроскопа JEM100C (.Япония). Иммуноэлектронная микроскопия была проведена Колесниковой Л.В. (ГНЦ ВБ "Вектор") Для иммуиоэлектронной микроскопии образцы после адсорбции помещали на 20 мин в 1 %-ный бычий сывороточный альбумин, приготовленный на 0,01 М фосфатном буфере (PS) рН 7,4. Моноклональные антитела против HBsAg (производство АО "Вектор-Бест", Кольцово) разводили в соотношении 1:1000 PS и инкубировали с образцами 45 мин при 37С.
После этого образцы промывали 3 раза по 5 мин в PS с 0,01% iween 20. Козьи антитела против IgG мыши, меченные золотом (5 нм), разводили в 70 раз PS и инкубировали с образцами 30 мин при 37С. После инкубации образцы промывали 3 раза по 5 мин в PS с 0,01% Iween 20, затем промывали 5 мин в ФБ, затем 5 мин в дистиллированной воде и окрашивали 1%-ыым раствором ураиилацетата (Hayat, 1981). Исследование проводили с использованием электронного микроскопа JEM100C. Иммунизация лабораторных животных Для иммунизации были использованы мыши линии BALB/c, весом 15-17 грамм, полученные из питомника лабораторных животных ГЫЦ ВБ "Вектор". Животные содержались на стандартном рационе. Все процедуры с животными проводили в соответствии с протоколом, утвержденным Биоэтическим комитетом ГНЦ ВБ "Вектор". Иммунизацию проводили внутримышечно белками в физиологическом растворе в объеме 50 мкл. Гидроокись алюминия вводили в дозе 0,3 мг или адъювант Фрейнда (полный или неполный) - в объеме, равном объему раствора белка. Забор крови проводили из орбитального синуса. Забой животных осуществлялся цервикальной дислокацией. На каждую точку эксперимента брали 5 животных. Иммунизацию суспензией клеток аттенуированных штаммов сальмонелл проводили ректально в объеме 100 мкл, дозой 10 клеток сальмонелл Суспензия клеток подготавливалась разведением нужного количества бактериальных клеток в PBS. Иммуноферментный анализ Титр образующихся антител в сыворотках мышей анализировали с помощью иммупоферментного анализа (ИФА). Для выявления антител против химерных белков использовали очищенные рекомбинантные белки HBcAg-preS, HBc-preS2, HBc-HBs. Рекомбинантный белок (10 нг на лунку в объеме 100 мкл) сорбировали на планшеты в течение ночи в карбонатном буфере (15mM ЫагСОз. 35 гаМ NaHC03, рН 9,2) при 8С. Для разведения сывороток использовали буфер TBS (147mM NaCl, ЗтМ КС1. ЮтМ трис-НСІ, рЫ 7,2) с добавлением 0,1% раствора казеина. Инкубацию с сыворотками мышей проводили в течение часа при 37С. Для промывки планшетов использовали буфер TBS с добавлением 0,.05% tween-20. Для выявления антител использовали антивидовой конъюгат антител со щелочной фосфатазой и краситель SIGMA FAST p-nitrophenyl phosphat. Результаты оценивали на спектрофотометре UBIO-RAD-608" при длине волны 405 нм. Титр определяли как разведение сыворотки, при котором оптическая плотность двукратно превышает фоновое значение.
Все измерения титров антител были проведены трехкратно. Используя данные титров сывороток мышей одной группы, вычисляли среднее арифметическое и стандартное отклонение (доверительный интервал рассчитан для 9э% уровня значимости). Для выявления антител, специфичных к эпитопам preSl (27-37 а.о.) и preS2 (131-145 а.о.) использовали биотинилированные синтетические пептиды с аминокислотной последовательностью эпитопа preSl (27-37 DHQLDPAFRAN) и preS2 (131-145 LQDPRVRGLYFPAGGSR). Стрептавидин (10 нг на лунку в объеме 100 шел) сорбировали на планшеты в течение ночи в карбонатном растворе при 8С. Для сорбции биотинилироваииых пептидов и разведения сывороток использовали буфер TBS с 0,1% казеином. Пептиды сорбировали в течение часа при 37С (100 нг на лунку ь- объеме 100 мкл). Для промывки планшетов использовали TBSween 20. Инкубацию с сыворотками мышей проводили в течение часа при 37С. Для выявления антител использовали антивидовой конъюгат антител со щелочной фосфатазой. Используя данные сывороток мышей одной группы, вычисляли среднее арифметическое, стандартное отклонение и доверительный интервал (доверительный интервал рассчитан для 95% уровня значимости). Для выявления антител к встроенным в HBcAg последовательностям эпитопов preSl и preS2 также использовали иммуно ферментный анализ сывороток, предварительно истощенных HBcAg (в концентрации 1 мкг/мл) или соответствующими синтетическими пептидами (в концентрации 1 мкг/мл). Сыворотки перед нанесением на планшеты инкубировали с антигенами в течение 1 часа при 37С. Остальная схема эксперимента была аналогична выше приведенной методике иммунноферментного анализа с использованием рекомбинантиых белков. Наличие антител класса IgA анализировали в смывах тонкого кишечника мышей. Извлекали фрагмент кишечника, удаляли содержимое и тщательно промывали 200 мкл PBS. Иммуноферментный анализ проводили аналогично описанному выше с использованием антивидового конъюгата к IgA. Траисфекция Трансфекция клеток COS-7 была проведена совместно с Мечетиной Л.В (ИЦиГ СО РАН) по стандартной методике (Aruffo and Seed, 1987). EL1SPOT Исследование количества клеток селезенки, продуцирующих ИФНу, Ил2. Ил4, проводилось с использованием наборов фирмы "BD" для ИФНу и " Mabtech " для Ил2 и Ил4. На 96 луночные плашки с нитроцеллюлозой наносили раствор антител к ИФНу (или Ил 2 или Ил 4) по 100 мкл, с концентрацией 5 мкг/мл инкубировали в течение ночи при 4 С. Затем плашки промывали раствором PBS с 0,25% tween-20 и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре с раствором P.BS, содержащим 10% фетальную сыворотку КРС. Селезенки иммунизированных мышей растирали в 2 мл среды "RPMI-1640. Клетки промывали два раза той же средой по 2 мл, затем ресуспендировали в 500 мкл RPMI-1640 с 10% фетальной сывороткой КРС. Концентрация клеток определялась в камере Гаряева.
Исследование иммуногенности химерных частиц HBcAg
Для оценки гуморального иммунного ответа при иммунизации лабораторных животных химерными коровыми частицами проводили иммунизацию мышей линии BALB/c очищенными индивидуальными белками HBc-preSl и HBc-preS2, без адьгованта или трехкратно с адьювантом Фрейнда (схемы иммунизации на рис.13). Сыворотки животных забирали на 28 день после иммунизации и анализировали в ИФА. В качестве антигенов на планшеты сорбировали химерные белки HBc-preSl, HBc-preS2, HBcAg. Результаты анализа представлены на рис.14 А. Из представленных результатов видно, что гуморальный иммунный ответ к химерным белкам HBc-preSl и HBc-preS2 у мышей при однократной иммунизации остается близким к ответу, стимулированному исходным белком HBcAg. При этом, иммунный ответ на сам носитель - HBcAg в составе химерных белков значительно ниже, чем на химерный белок. Таким образом, эиитопы, встроенные в основную антигенную детерминанту el HBcAg частиц, уменьшают высокую антигенность белка-носителя HBcAg и стимулируют синтез антител к встроенным последовательностям. Полученные данные согласуются с результатами, описанными в ряде работ других исследователей, показавших, что встройки в основную детерминанту HBcAg не только стимулируют иммунный ответ сильнее, чем встройки, осуществленные в С- или N- конец молекулы HBcAg, но и позволяют уменьшить ответ на белок-носитель (Shodel et at, 1995; Lachmann et al, 1999). Аналогичные результаты были получены при исследовании иммуногенности белка HBc-HBs (Карпенко и др., 2000). При трехкратной иммунизации белками HBc-preSl или HBc-preS2 с использованием адъюванта Фрейнда, абсолютная величина титров специфических антител была выше, чем при однократной иммунизации (рис. 14 Б). Однако разница между иммунным ответом к химерному белку и к HBcAg (носителю) не только сохраняла тенденцию, но и увеличивалась. Для оценки иммунного ответа непосредственно на внедренные в HBcAg последовательности из района preS, сыворотки иммунизированных мышей анализировали с использованием синтетических пептидов с последовательностями встроенных эпитонов (рис. 15). Из рис.15 видно, что иммунизация гибридными белками HBc-preSl и HBc-preS2 стимулирует синтез антител, специфичных соответствующим пептидам. Антитела к пептиду preSl появляются уже при однократной иммунизации химерным белком HBc-preSl. При иммунизации мышей с адыовантом Фрейнда обратный титр антител, специфично узнающих пептид preSl, увеличивается.
В сыворотках мышей, иммунизированных белком HBc-preS2, обратный титр антител к пептиду preS2 был ниже. Эти данные также были подтверждены с помощью ИФА, в котором сыворотки предварительно инкубировали с HBcAg или с HBcAg и соответствующим пептидом, а затем проводили анализ на планшетах с сорбированным химерным белком (рис.16). Результаты анализа сывороток мышей одной группы были аналогичны, поэтому приводятся данные анализа отдельных сывороток. Было показано, что связывание антител сывороток животных, иммунизированных HBc-preSl с данным белком эффективно ингибируется пептидом и HBcAg, в тоже время добавление только HBcAg слабо влияет на взаимодействие антител сыворотки с химерным белком HBc-preSl. Сыворотки мышей иммунизированных HBc-preS2 напротив, эффективно ингибируются добавлением HBcAg, но слабо реагируют на добавление пептида с последовательностью из района preS2. Таким образом, в сыворотке иммунизированных мышей антител к последовательности из района preS 1 регистрируется значительно больше, чем антител к последовательности из района preS2. Возможно, этот факт может быть следствием различной иммуиогениости эпитопов preSl и preS2 или разной аффинностью антител, индуцированных иммунизацией этими белками. Вероятна и различная степень экспонирования встроенных эпитопов на поверхности белков HBc-preSl и HBc-preS2. Кроме того, возможна и различная чувствительность системы детекции (например, различная стабильность конформации синтетических пептидов, используемых в ИФА). Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют, о том, что химерные белки HBcAg, несущие эпитопы поверхностного белка HBV, способны индуцировать иммунный ответ как ко встроенным пептидам, так и к белку-носителю (HBcAg). Изменения, вносимые в последовательность HBcAg при встройках чужеродных эпитопов, кроме уменьшения собственной аитигепности белка, могут повлиять и на другие параметры иммунного ответа, стимулируемого HBcAg. Так, было показано отрицательное влияние встроек на способность HBcAg стимулировать Т-независимый гуморальный иммунный ответ (Fransis etal, 1990; Fehr et ей, 1998). Следует отметить, что HBcAg является сильным индуктором Т-клеточного звена иммунитета, и данное качество может быть очень полезно для использования HBcAg или его химерных аналогов в качестве кандидата для терапевтических ГВ вакцин.
По этой причине, было необходимо выяснить, повлияло ли внедрения чужеродных эпитопов в структуру HBcAg на способность этого иммуногена стимулировать клеточный иммунный ответ. Клеточный ответ оценивали по выявлению Ил 2 - продуцирующих лимфоцитов в реакции ELISPOT. В качестве отрицательного контроля был использован рекомоинантный белок TBI (Карпенко и др., 2002), Полученные результаты показали (Рис. 17), что при индукции спленоцитов химерными белками, количество лимфоцитов, продуцирующих Ил 2 увеличивается незначительно. Однако, индукция белком HBcAg лимфоцитов, мышей, иммунизированных химерными белками, увеличивает количество Ил2 синтезирующих клеток также эффективно, как и в группе мышей, иммунизированных HBcAg. Таким образом, все исследованные вакцинные конструкции способны индуцировать специфический клеточный ответ у иммунизированных животных также эффективно, как и нативиый HBcAg. Следовательно, внедрение встроек в основную антигенную детерминанту значительно не повлияло на способность химерных HBcAg стимулировать клеточный иммунный ответ. Таким образом, сконструированные химерные белки HBc-preSl, HBc-preS2 стимулируют синтез антител к встроенным эпитопам. Встройки эпитопов в химерных белках HBc-preSl, HBc preS2 и НВс-НВз существенно не повлияли на способность белков стимулировать клеточный иммунный ответ. Полученные результаты дают основание полагать, что сконструированные химерные белки HBcAg с эпитопами поверхностного белка могут быть использованы в качестве компонентов вакцины против гепатита В. 3.3. Способы доставки HBcAg 3.3.1. Доставка HBcAg с помощью аттенуированного штамма сальмонеллы S.enteriditis Е-23 Известно, что вирус гепатита В проникает в организм хозяина двумя путями: парентеральным и через поврежденную слизистую ротовой полости, гениталий или толстого кишечника. Соответственно, эффективные вакцины против ГВ должны стимулировать как общий, так и секреторный иммунитет. Было предложено несколько подходов к созданию вакцин, стимулирующих, мукозальный иммунный ответ, такие как лииосомиые конструкции, содержащие антигены (Zho and Neutra, 2002), вирусные вектора, доставляющие гены патогенов (Crotty et ah, 1999; Babiuk and Tikoo, 2000), Весьма перспективным в этом плане представляется создание вакцин на основе живых аттенуированных штаммов сальмонелл, продуцирующих чужеродные антигены.
