Введение к работе
Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, лептоспироз относится наиболее значимым болезням среди групп природноочаговых зоо-эзных инфекций.
Пуіпогтшіпаиио atrrunuuv ппиплпныу и ямтрппупгииргии» пиягпп ЭПТОСПИРОЭЯ Н5 Т9РИТ0Г*ИИ НЯЇІ'^И СТРЭНЫ " ОТМ9иЗ?^ЫЙ Р П0СЛР1НИ0
эды рост заболеваемости ладей иктергемморагическим лептоспиро-ом, отличающимся тяжестью клинического течения и высокой ле-альностыэ. вызывает необходимость совершенствования методов и пособов профилактики, диагностики и лечения лептоспирозов.
В Российской Федерации с цель» специфической профилактики рименяется поливалентная убитая корпускулярная вакцина, которая ызывает недостаточно напряженный иммунитет (Чернуха Ю. Г., Бары-ев П.М., 1978), что требует повышения ее протективных войств (Чернуха Ю. Г.. 1983).
Технология получения вакцины по BJC 42-144 ВС-88 не обеспе-ивает очистку вакцины от примесей кроличьего белка, что повыиа-т ее реактогенность и ограничивает применение, в частности, для ммунизации доноров с целью получения специфического лечебного ммуноглобулина взамен применяемого противолептоспнрозного і:ч>.іу-оглобулина из сыворотки волов.
На современном этапе создание иммунобиологических препарата необходимо проводить с учетом достижений биохимии, нммунохи-іии и биотехнологии.
В отношении многих, возбудителей на основе изучения их имму- ' юхииии и молекулярной биологии с применением новых технологи-іеских подходов получены или разрабатываются принципиально новые мсокоэффективные иммунобиологические препараты, в том числе и «кцины.
Лэптоспиры в этом плане изучены крайне недостаточно. Имеется і значительнее отставание от исследований, проводящихся за рубе-гам (Майскова Т. С., Анисимова Т. И.. 1993).
Таким образом, исследования по созданию новых иммунобиоло-ических препаратов для профилактики и лечения лептоспироза с 'четом биологических и иммунохимических свойств лептоспир с ис-
- і -
пользованием современных биотехнологических подходов является актуальной задачей и имеет важное народнохозяйственное значение..
Цель исследования. Целью работы явилось решение проблемы совершенствования лептоспирозной вакцины и оценка перспективы развития биотехнологий получения иммунобиологических лептоспи-розных прэпаратов на основе экспериментального изучения иммунохимии, биологии лептоспир и противолептоспирозного иммунитета.
Основные задачи исследования.
Выделить, изучить и отобрать для использования в качестве производственных новые природные штаммы патогенных лептоспир .
Уточнить особенности энергетического обмена у лептоспир и разработать оптимальные питательные среды для накопления биомассы лептоспир.
Выяснить иммунохимические особенности антигенного состава патогенного штамма лептоспир серогруппы Icterohaeaorrftaglae и сапрофитного штамма лептоспир.
Разработать новые технологии получения концентрированной и очищенной от кроличьего белка биомассы лептоспир.
Разработать технологию получения концентрированной очищенной вакцины против иктерогеморрагического лептоспироза и изучить ее иммуногенность, безвредность в опытах на экспериментальных животных и добровольцах.
Разработать подходы получения мембранных структур и очищенных антигенов лептоспир, изучить их иммунохимические» биологические свойства и определить возможности создания бесклеточных вакцин.
Исследовать и оценить перспективность молекулярно-биологичес-ких подходов для создания иммунобиологических препаратов для лечения и профилактики лептоспироза. і?
Научная новизна результатов:
-
Доказано, что возбудитель лептоспироза способен диссими-лировать углеводы по пути Эмбдена-Мейергофа с участием гексозо-монофосфатного шунта, но метаболизм углеводов у лептоспир происходит в 10 раз менее интенсивно, чем у кишечной палочки.
-
Сконструирована новая полусинтетическая среда, которая обеспечивает возможность накопления биомассы лептоспир без применения чужеродного кроличьего белка, определены параметры, необходимые для ее использования в производстве вакцин и получения
биомассы для биотехнологическнх г.еш-.
3. Показана высокая эффективность концентрирования и очистки биомассы лептоспир с использованием этапов культивирования лептослир на новой лолусинтетической среде и новых методов мембранной Фильтрации на полых полиамидных волокнах. Новая технология запатентована и находится в реестре патентов России (патент № 1480354).
i. 5uCHi«iiiu ссобс;:;:псг" ry!*?pan»»"nrn и клеточного звена иммунитета при ьакцііііаці:;і цг:гл.ітглртг»'^^ш ««штноии экашШШСИ-тальных животных и добровольцев. Показана более высокая эффективность очищенной концентрированной вакцины при низкой степени реактогенности.
5. Разработана методика выделения и очистки функционально
активных мембранных структур лептоспир из лнзоцииных сфероплас-
тов. Установлено, что образование сферопластоа у лептоспир про
исходит дискретно по всей поверхности клетки.
Выявлены особенности химического состава мембран патогенных и сапрофитных штаммов лептоспир.
Выделены и охарактеризованы группоспгцифические и общеродо-вые антигены из мембран патогенного штамма лептоспир.
Установлено, что протективными свойствами обладают оболочки только патогенных лептоспир.
6. Выявлено, что лептоспиры при культивировании выделяют в
среду культивирования специфические антигенные компоненты. Из
среды культивирования выделен и' охарактеризован специфический
антиген белково-полисахаридной природы.
Предложена универсальная схема выделения структурных компонентов и антигенов лептоспир для биотехнологических целей, позволяющая получать очищенные от чужеродного белка корпускулярные вакцины, а также иммунобиологические препараты на основе структурных компонентов клетки, антигенов и их комбинаций.
-
Установлена возможность клонирования генов лептоспир. отечественных за биосинтез антигеноз в Е По11 и создана для этих целей библиотека генов.
-
Показана возможность "иммунизации" антигенами лептослир лимфоидных тканей человека в культурах клеток и конструирования
- 8 - '
на этой основе гибридом смешанного происхождения, (мышь-человек), продуцирующих специфические к лептоспирам ноноклональные антитела человека. Получена и эадепонирована гибридомная линия мышь-человек, продуцирующая ноноклональные антитела чаловека к мембранам лептоспир.
Практическая ценность работы:
Из числа выделенных и изученных природных вирулентных штаммов лептоспир штамм серовара Copenhagen! отобран для производства вакцины. Штамм задепонирован и на него получено положительное решение на патент Российской Федерации.
Разработана новая технология получения концентрированной очищенной вакцины в моно-, би- и поливалентном исполнении. Технология получения вакцины была запатентована и находится в реестре патентов России (патент U0 1480354). На концентрированную очищенную вакцину против иктерогеиоррагнческого лептоспироза составлена документация (Инструкция по изготовлению и контролю Экспериментально-производственный регламент и проект Временной фармакопейной статьи).
Вакцина прошла испытания в опытах на экспериментальных животных, ограниченной группа добровольцев и решением Комитета па иммунобиологическим препаратам признано целесообразным проведение Государственных испытаний новой ьикцины (решение N"1 от 2а, 02. 94 г.).
Сконструированная библиотека генов лептоспир может быть использована для дальнейших исследований по получению новых генно-инженерных продуцентов антигенов лептоспир.
Полученный штамм гибридомы С—II, продуцирующий человеческие
моноклональные антитела против мембран лептоспир был задепониро
ван в Российской коллекции клеточных культур (N ВСКЛ/П/6176)
инсттута цитологии Академии наук России и может быть использо
ван в биотехонологических целях.
Основные положения, выносимые на защиту: -
1. Лептоспиры способны диссимилировать углеводы по пуп Змбдена-Мейергофа с участием гексозомонофосфатного шунта.
:. Новая технология получения концентрированной и очищенноР от кроличьего белка убитой клеточной вакцины против лептоспирозг для лодей включает в качестве основных этапов культивирование лептоспир на новой полусинтетической среде м новые методы менб-"
т ? -
пакной фильтпаши на полых полиамидных воіюкнах.
"тгуїггуг " '-'-^^^"'сто'3 паптлгпмр патогенного и сапрофитного Ь. лсптоспиры в процессе кулЬ'ГиБпкиасі.і.і.; u ;;;ия;і.х сродчх
«imaTuntw п crtpnv ЯНТИГР.НІі.
Ч I'nuu ЛагіТГЇГ riUll ГІТИКТ1, і иепПОС ОСІ Ul».uiii ,".CU -^ТІІГС::",
возможно клонировать в штаммы Е coll.
-
В условиях "In vivo" лервнчко-трипсннизированные лимфо-идкые клетки человека могут отвечать антительным ответом на антигены лептоспир и использоваться для конструирования гибриден смешанного происхождения (мышь-человек), которые стабильно продуцируют специфические к лептоспирам иеноклональные антитела.
-
Принципы создания вакцин для людей против лептсспироза и перспектива дальнейших работ в этом направлении.
Аіі;:о5й!;ил рабе ты. Материалы диссертации доложень;:
;;а I Всесоюзной конференции по иммунологии (Сочи \^Ут:
иг, \'!1 i'enr-yнародной Европейской м IX Всесоюзне:": ні-и'л^'ґ'-і-. '.-*-, /'Оглосгирпэу (Москва, 1991).
- ка Реждународаоц конференция "Перспективы иммуксп';-;;\.'іг.'-<:* '.' '
!ис'*нкч з.^болРпачгЯ" (Берлин, 1'>0К
на Лездунзродном конгрессе по зоонояа» (Словакия 1<Ш)
- На юбі1ЛЄЙН0Г{ КОНфереНЦИИ, ПОГВЯЩеННОИ 70-ЛЄТгЧй Оопгм-пй.С,.
оур^ского ин.;,H'fv'Ta то. Г.. "естерп
- к'.ч соом'.стне,:-: засоданн.ч Ростовского отлелэннд otr.r-,--:,;. ,^.^---.--.-
логов и Ростовского отделения общества микробиолога;,, jn.ui^v.-.:^-
л.то8 и паразитологов.
Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета иксти-";-; - и'.ройиологни и паразитологии. Протокол Г?2 от і г. ог* "5 ~
Пуоликаці'М. По материалам диссертации опублииог-о- : і', г,-1-.'.:.--т.~ о заоубеянчя '. центральных изданиях, а также в соерникая тру-/ж- конференции. Утверждено 5 нормативно-технических яоь-уи?н'-.і~ ций, программ и отчетов об испытаниях вакцин, получен і па^га.т Российской Федерации и одно положительное решение на патент.
-.8 -
Структура и объем диссертации.
Диссертация написана в монографическом стиле и включает введение, 5 глав результатов собственных исследований и их обсуждение, общее заключение по работе и выводы. Список литературы содержит 229 наименований. Работа йзлонена на 240 страницах машинописного текста и иллюстрирована таблицами, рисунками и фотографиями. Основные результаты, приведенные в диссертации, получены лично автором. Исследования по отдельным разделам проводились совместно с сотрудниками лаборатории особо опасных инфекций института под руководством автора и его личном участии. Раздел по изучению метаболизма лептоспир выполнены совместно с младшим научным сотрудником 0. В. Фрунзе. Раздел по иммунохимии лептоспир выполнен совместно со стараим научным сотрудником Б.Ф.Вачаевым Исследования по использованию гибридомных технологий проводились в комплексе с лабораторией гибридом Ростовского противочумного института (руководитель - докт. биол. наук Л.П.Алексеева).
