Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
2. CLASS Обзор литератур CLASS ы 12
2.1. Этиологическая структура и эпизоотологические особенности проявления смешанных инфекционных болезней свиноматок, вызывающих нарушение их воспроизводительной функции, в свиноводческих комплексах 12
2.2. Характеристика возбудителей, выделяемых у свиноматок с патологией органов воспроизводства, современные методы их диагностики и средства специфической профилактики 16
2.2.1. Парвовируса свиней 16
2.2.2. Стрептококки 25
2.2.3. Сальмонеллы 32
2.3. Основные принципы технологии изготовления ассоциированных инактивированных вакцин 37
3. Собственные исследования 41
3.1. Материалы и методы 41
3.1.1 Оборудование и используемые материалы 41
3.1.2. Методы выделения и изучения биологических свойств штаммов микроорганизмов 44
3.1.3. Лабораторный регламент технологии изготовления ассоциированных вакцин 47
3.1.4. Определение физических и иммунобиологических свойств опытных образцов вакцины 49
3.1.5. Статистическая обработка результатов исследований 51
3.2. Результаты собственных исследований 52
3.2.1. Мониторинг инфекционных болезней свиноматок с патологией органов воспроизводства в регионе Среднего Поволжья и Предуралья 52
3.2.2. Выделение и изучение биологических свойств этиологических агентов, вызывающих нарушения воспроизводительной функции у свиней 59
3.2.2.1. Изучение биологических свойств штамма «У-13» Parvovirus suis свиней 59
3.2.2.2. Выделение и изучение биологических свойств штамма «С- 05» Streptococcus suis 61
3.2.2.3. Выделение и изучение биологических свойств штамма «К- 03» Salmonella choleraesuis 65
3.2.3. Лабораторный регламент технологии изготовления гидроокисьалюминиевой и эмульгированной ассоциированных вакцин против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней 66
3.2.3.1. Накопление биомассы производственных вакцинных штаммов вируса и бактерий 66
3.2.3.2. Изготовление инактивированной ассоциированной вакцины. 69
3.2.3.3. Определение стерильности ассоциированной вакцины 70
3.2.3.4. Контроль остаточной вирулентности компонентов ассоциированной вакцины 71
3.2.3.5. Оценка безвредности ассоциированной вакцины 72
3.2.3.6. Физические свойства вакцины 72
3.2.4. Изучение антигенной и иммуногенной активности гидроокисьалюминиевой и масляной ассоциированных вакцин на лабораторных животных 73
3.2.4.1. Изучение антигенной активности моно- и ассоциированной гидроокисьалюминиевых вакцин на белых крысах и кроликах 73
3.2.4.2. Изучение иммуногенной активности гидроокисьалюминиевой и масляной ассоциированных вакцин на кроликах 78
3.2.4.3. Показатели уровня клеточного иммунитета кроликов, иммунизированных ассоциированной вакциной против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней 83
3.2.5. Изучение антигенной активности ассоциированной гидроокисьалюминиевой вакцины на свиноматках 87
3.2.6. Производственное испытание ассоциированной. инактивированной вакцины против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза 89
4. Обсуждение результатов исследований 94
5. Выводы 105
6. Практические предложения 107
7. Список литературы 108
8. Приложения 130
- Характеристика возбудителей, выделяемых у свиноматок с патологией органов воспроизводства, современные методы их диагностики и средства специфической профилактики
- Выделение и изучение биологических свойств этиологических агентов, вызывающих нарушения воспроизводительной функции у свиней
- Лабораторный регламент технологии изготовления гидроокисьалюминиевой и эмульгированной ассоциированных вакцин против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней
- Показатели уровня клеточного иммунитета кроликов, иммунизированных ассоциированной вакциной против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней
Введение к работе
Проблема сохранности приплода свиноматок и новорожденных поросят всегда была в центре внимания ученых и ветеринарных специалистов. В этом плане, хотя и немало сделано, все еще велик отход молодняка.
В настоящее время инфекционные болезни среди маточного поголовья свиней, сопровождающиеся нарушением функций воспроизводства и проявляющиеся рождением нежизнеспособных поросят, гибелью эмбрионов, плодов и абортами распространены как в крупных свиноводческих комплексах, так и небольших свиноводческих хозяйствах. На сегодняшний день проблема смешанных инфекций, вызываемых возбудителями парвовирусной болезни свиней, репродуктивно-респираторного синдрома, хламидиоза, стрептококкоза, сальмонеллеза и болезни Ауески в различных сочетаниях, является одной из актуальных. На их долю приходится около 50% всей патологии маточного поголовья свиней, проявляющейся поражением органов воспроизводства (Х.З. Гаффаров и др., 2003). Распространенность смешанных инфекций объясняется ветеринарно-санитарным состоянием свинокомплексов, условиями кормления и содержания животных, так на ограниченной территории создана беспрецедентная концентрация поголовья (В.М. А п ате н ко, 1982).
Парвовирусная болезнь свиней (ПВБС) широко распространена в странах с развитым свиноводством, в том числе и на территории Российской Федерации. Эпизоотологический мониторинг затруднен тем, что это стационарная инфекция, которая протекает бессимптомно. ПВБС наносит значительный экономический ущерб свиноводческим хозяйствам нашей страны и за рубежом (Т.З. Байбиков и др., 2005). Почти повсеместное распространение ПВБС в странах с интенсивно развитым свиноводством делает борьбу с ней одним из основных условий, необходимых для обеспечения нормального процесса воспроизводства свинопоголовья (Б.Г. Орлянкин и др., 1989).
Микробный пейзаж репродуктивных органов свиноматок представлен различными ассоциациями аэробных и анаэробных микроорганизмов. В состав нормальной микрофлоры влагалища у 64,3% свиноматок входят грамположительные кокки рода Streptococcus, в т.ч. 44,4% Streptococcus группы D. У 42,8% исследуемых животных высеваются стафилококки. Грамотрицательная микрофлора представлена энтеробактериями родов: Esherichia, Proteus, Enterobacter и Serratia. (М.В. Бирюков, 2002г)
Частота выделения патогенных стрептококков различных серологических групп от маститных свиноматок из вагинального секрета и абортированных плодов составляет в среднем 51,6 %, 51,5 % и 15,9 % случаев соответственно. (Е.В. Малик, 2000г).
Большое значение в профилактике смешанных форм инфекционных болезней у свиноматок играет вакцинопрофилактика. Поскольку при иммунизации животных моновалентными вакцинными препаратами сложно охватить весь спектр микроорганизмов, участвующих в данной патологии свиноматок. В связи с этим наибольшее значение приобретают разработка и применение ассоциированных (комплексных) вакцин (Х.З. Гаффаров и др., 2003).
Анализ результатов исследований по применению ассоциированных вакцин свидетельствуют о том, что использование их позволяет значительно сократить время на создание защиты одновременно к нескольким болезням, уменьшить степень аллергизации животных, избежать неблагоприятного воздействия стресс-факторов, сократить затраты на профилактические мероприятия и значительно облегчить труд специалистов (А.П. Михайлюк и др., 1982).
В этой связи представляется весьма актуальной разработка ассоциированной вакцины против парвовирусной болезни,
стрептококкоза и сальмонеллеза свиней, которая бы одновременно обеспечивала защиту животных от этих инфекционных заболеваний.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилась разработка лабораторного регламента технологии изготовления и оценка эффективности применения ассоциированной инактивированной вакцины против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
- изучить этиологическую структуру наблюдаемых нарушений
воспроизводительной функции свиноматок в хозяйствах зоны Среднего Поволжья и
Предуралья;
- выделить возбудителей парвовирусной болезни, сальмонеллеза и
стрептококкоза, вызывающих поражения репродуктивной системы свиноматок
и изучить основные биологические свойства выделенных микроорганизмов;
- отобрать наиболее перспективные штаммы для изготовления вакцины,
отличающиеся высокой иммуногенной активностью;
- изготовить и изучить антигенные свойства ассоциированных
сорбированной и эмульгированной вакцин против парвовируса, стрептококкоза
и сальмонеллеза в лабораторных и производственных условиях;
- испытать профилактическую эффективность изготовленной вакцины
против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней;
- разработать нормативно-техническую документацию на
ассоциированную вакцину против парвовирусной болезни, стрептококкоза и
сальмонеллеза свиней.
Научная новизна. Впервые на основе результатов клинико-эпизоотологичского мониторинга и лабораторных исследований при инфекционных заболеваниях свиноматок, вызывающих нарушения воспроизводительной функции в ряде свиноводческих комплексов регионов Среднего Поволжья и Предуралья показаны преимущественное распространение и циркуляция среди поголовья свиней возбудителей
парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза, проявляющиеся как моноинфекции, так и в ассоциации.
Выделены и отобраны штаммы сальмонелл и стрептококков по степени патогенности для восприимчивых лабораторных животных, морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам, а парвовируса «У-13» - по способности репродуцироваться в культуре клеток с характерными цитопатическими изменениями и антигенной идентичности его с референтными штаммами. Отобранные штаммы соответствуют основным требованиям, предъявляемым к штаммам микроорганизмов, пригодных для изготовления биопрепаратов.
На лабораторных и естественно восприимчивых животных установлены оптимальные концентрации и соотношение инактивированных антигенов микроорганизмов каждого штамма в вакцинном препарате, определена прививная доза для свиноматок.
Получены экспериментальные данные, указывающие на высокую антигенную и иммуногенную активность ассоциированной вакцины.
Испытание разработанной вакцины как в лабораторных, так и в производственных условиях показали ее эффективность.
Практическое значение. На основе проведенных исследований разработана и предложена для внедрения в ветеринарную практику «Ассоциированная инактивированная гидроокисьалюминиевая вакцина против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней». Подготовлены нормативно-технические документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение данного биопрепарата, в частности:
- выделены, отобраны и депонированы в лаборатории по хранению и изучению штаммов возбудителей особо опасных болезней ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» штаммы «У-13» Parvovirus suis, «С-05» Streptococcus suis, «К-03» Salmonella choleraesuis, соответствующие основным требованиям, предъявляемым к производственным штаммам (24.01.2006 г.);
«Временная инструкция по изготовлению и контролю ассоциированной инактивированной вакцины против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней» (утверждена ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 24.01.2006 г.);
«Технические условия на ассоциированную инактивированную вакцину против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней» (утверждены ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 15.02.2006 г.);
- «Временная инструкция по применению ассоциированной
инактивированной вакцины против парвовирусной болезни, стрептококкоза и
сальмонеллеза свиней (в порядке производственного опыта)» (утверждена ФГУ
«ФЦТРБ-ВНИВИ» 15.02.2006 г.).
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:
Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 45-летию ФГНУ ВНИВИ «Проблемы экотоксикологического, радиационного и эпизоотологического мониторинга» (Казань, 2005),
Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» Часть ІЦКазань, 2005),
Международной научно-производственной конференции, КГАВМ (Казань, 2006),
Конференции молодых ученых и специалистов КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе в «Ученых записках КГАВМ» (в списке изданий ВАК). На защиту выносятся:
- этиологическая структура инфекционных заболеваний свиноматок с
патологией органов репродуктивной системы в свинокомплексах регионов
Среднего Поволжья и Предуралья;
научное обоснование целесообразности создания ассоциированной вакцины против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней;
лабораторный регламент технологии изготовления, контроля и применения ассоциированной вакцины;
- установление антигенной и иммуногенной активности ассоциированной
вакцины на лабораторных животных и свиноматках;
- показатели профилактической эффективности ассоциированной
вакцины в производственных условиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложения. Список литературы содержит 200 источников, в том числе 92 иностранных. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 3 рисунками.
Приложения к диссертации включают в себя копии актов производственных испытаний, временной инструкции по изготовлению и контролю, технических условий и временной инструкции по применению ассоциированной вакцины против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней.
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Характеристика возбудителей, выделяемых у свиноматок с патологией органов воспроизводства, современные методы их диагностики и средства специфической профилактики
Парвовирусная болезнь свиней (ПВБС) - контагиозная вирусная болезнь, проявляющаяся клинически только у супоросных свиноматок, характеризующаяся гибелью эмбрионов и плодов, рождением мумифицированных плодов, мертвых и слабых поросят, уменьшением числа поросят в помете и реже абортами.
Парвовирус впервые выделил Мауг в 1966г. из плода абортировавшей свиноматки в Германии (А. Мауг et al., 1968), однако связь этого вируса с нарушением воспроизводительной функции свиноматок установили в Великобритании лишь в 1967г (S. Cartwright et al., 1967). Экспериментально болезнь удалось воспроизвести только через 10 лет, заражение супоросных свиноматок выделенными штаммами ПВС приводило к гибели и мумификации плодов (W.L. Mengeling et al., 1975).
Возбудитель ПВБС - ДНК-содержащий вирус семейства Parvoviridae, рода Parvovirus. Зрелый вирион имеет кубическую симметрию, включает 32 капсомера (Б.Г. Орлянкин, 1986; W.L. Mengeling, 1992) и состоит из 3 капсидных белков с молекулярной массой 79000, 62000 и 55000, соответственно, не содержит суперкапсидной оболочки и липидов (B.F. Johnson, 1984). Диаметр вириона 18-27 нм (S. Dea et al., 1985; T.W. Molitor et al., 1983), молекулярная масса составляет 5,5-6,2 МД (Н. Yausuhara et al., 1989). Вирусный геном представлен 1 нитевой ДНК с мол.м. 1,4 МД, т.е. около 26,5% массы полного вириона. Плавучая плотность в хлористом цезии полного инфекционного вируса, неполного ("пустого") вириона и экстрагированной вирионной ДНК составляет 1,38-1,395, 1,30-1,315 и 1,724 г/смЗ соответственно (W.L. Mengeling, 1992). Коэффициент седиментации - 110 S (G. Siegle, 1984).
Парвовирус свиней (ПВС) устойчив к физико-химическому воздействию внешней среды. При рН 3-9, температуре 37С вирус сохраняет свою инфекционность в течение 90 мин и полностью инактивируется за 120 мин. При 56С вирус стабилен в течении двух суток, при 70С - 2 часа, при 80С - 5 мин. Парвовирус устойчив к обработке хлороформом, эфиром, фреоном, этанолом. Вирус устойчив к трипсину, папаину, пепсину и к действию ультразвука. Он сохраняется длительное время во внешней среде: в помещениях свинарников до 4-6 месяцев. Парвовирус свиней инактивируется ультрафиолетовыми лучами, формалином, производными этиленимина (Т.Т. Brown, 1981).
Антигенная структура парвовируса мало изучена. Основным белком у ПВ млекопитающих является полипептид VP3, который составляет около 80% общего количества белка. ПВС имеет в своей структуре еще два структурных белка VP1 и VP2 (G. Siegl et al., 1985; F.B. Johnson, 1984). Вирус хорошо репродуцируется в первичных культурах клеток почек, щитовидной железы и тестикул поросят, а также в некоторых перевиваемых культурах клеток свиней (ППК, РК-15, ST, ППЭС). Оптимальное размножение вируса происходит только при инфицировании клеток, проявляющих митотическую активность (Л.П. Дьяконова и др., 2000). Размножение ПВС в культуре клеток сопровождается развитием цитопатического эффекта, характеризующегося диффузной зернистостью и округлением клеток, отделением их от стекла и частичным или полным разрушением монослоя. В естественных и экспериментальных условиях к ПВС чувствительны только свиньи. У небеременных животных, включая поросят-гнотобионтов, ПВС интенсивно репродуцируется в различных органах и тканях, выделяется во внешнюю среду, однако клинические признаки болезни не развиваются. При заражении свиноматок ПВС проникает через плаценту у 73-78% животных независимо от срока супоросности. Установлено, что трансплацентарное инфицирование плодов происходит через 10-15 дней после естественного заражения свиноматок. При заражении супоросных свиноматок патогенное действие ПВС проявляется только в том случае, если вирус проникает в плоды до развития у них иммунокомпетентности (примерно до 70 дня развития). Источник возбудителя инфекции - больные и переболевшие свиноматки, выделяющие вирус с фекалиями, мочой, плацентой, абортированными и мертворожденными плодами. В помещениях парвовирус сохраняет свою инфекционность до 135-140 суток (В.Н. Сюрин и др., 1998). В естественных условиях заражение животных происходит пероральным и аэрогенным путями, а также при случке и искусственном осеменении инфицированной спермой. К ПВБС восприимчивы свиньи всех половозрастных групп и родственные им животные, такие как дикие кабаны (J.T. Saliki et al., 1998) и бородавочники (G.R. Thomson et al., 1980). При возникновении заболевания в ранее благополучных хозяйствах рождение живых поросят на свиноматку в год снижается на 50-60%, в стационарно неблагополучных хозяйствах на 10-20%. (Бекетова А.Ю. и др., 1988) Болезнь протекает энзоотически (C.N. Huysman et al., 1992). Для многих свиноводческих хозяйств ПВБС в течение длительного периода времени является стационарной инфекцией, не причиняя значительного ущерба. Она вызывает особенно большой ущерб при введении в племенное поголовье ремонтного молодняка (Т.А. Феокистова и др., 1985). ПВС, вызывая заболевания у свиноматок, часто протекает одновременно с сальмонеллами, эшерихиями, кокками и другими микроорганизмами (А.Г. Шахов и др., 1999). Заболевание клинически проявляется только у супоросных свиноматок и характеризуется гибелью эмбрионов и плодов, рождением мумифицированных плодов, мертвых и слабых поросят, уменьшением числа поросят в помете и реже абортами. У животных других половозрастных групп, включая поросят-гнотобионтов и хряков-производителей, болезнь протекает в латентной форме. Как правило, иммунные свиноматки становятся не восприимчивыми к ПВБС (C.N. Huysman et al., 1992; С. Lehnert et al., 1987; Б.Г. Орлянкин, С.А. Гайтамамонова, 1989). Распространение вируса в матке происходит медленно, он передается от одного плода к другому, при этом могут поражаться не все эмбрионы, поэтому в помете инфицированной свиноматки могут встречаться мумифицированные, мертвые, слабые и совершенно здоровые плоды (J.R. Walton, 1987). Имеются сообщения о том, что ПВС выделяли из фекалий поросят 2-3 недельного возраста с синдромом диареи, а также из органов и тканей поросят с некротическими и везикулярными поражениями ротовой полости и языка (S. Dea et al., 1985; Н. Ysuhara et al., 1989). При ПВБС у инфицированных свиноматок видимые патологоанатомические изменения не обнаруживаются (G.W. Horner et al., 1977). Макроскопически у плодов, инфицированных до периода иммунокомпетентности, обнаруживают различные уровни задержки роста, рельефность кровеносных сосудов в результате переполнения кровью, отёк, геморрагии, скопление серозно-кровянистой жидкости в полостях и дегидратацию (мумификацию). У плодов, заражённых после наступления иммунокомпетентности, обнаруживают только
микроскопические изменения (инфильтрацию мононуклеарными клетками), свидетельствующие об иммунном ответе на заражение вирусом. У мертворожденных поросят и живых плодов, полученных на поздних стадиях супоросности, отмечали менингоэнцефалиты (В.Н. Сюрин, 1998).
Выделение и изучение биологических свойств этиологических агентов, вызывающих нарушения воспроизводительной функции у свиней
В нашей работе был использован штамм «У-13» ПВС, выделенный в 1997 году сотрудниками лаборатории контроля и индикации возбудителей болезней молодняка сельскохозяйственных животных в ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань).
Культивирование штамма «У-13» ПВС проводили в перевиваемой культуре клеток почки поросенка «казанская» (ППК) на питательной среде, содержащей 80% среды MEM, 10% среды 199 и 10% эмбриональной телячьей сыворотки - среда ПСП, приготовленной по стандартной прописи. Двадцати четырех часовую культуру клеток ППК выращенную в матрацах заражали ПВС и инкубировали при 37С. В качестве контроля оставляли не зараженным 1 матрац с культурой клеток ППК. Развитие цитопатических изменений характеризовалось диффузной зернистостью, округлением клеток, отделением их от стекла и частичным или полным разрушением монослоя на 3-4 сутки после заражения. Матрацы с вирусной суспензией трижды замораживали и оттаивали. Далее отбирали пробы для определения гемагглютинирующей способности и инфекционного титра штамма «У-13» парвовируса.
Для определения гемагглютинирующей способности изучаемого штамма парвовируса использовали реакцию гемагглютинации (РГА), которую ставили согласно «Методическим указаниям по диагностике парвовирусной болезни свиней», утвержденным ГУВ Государственного агропромышленного комитета СССР 24.12.1989 г. За титр вируса принимали наибольшее его разведение, вызывавшее полную агглютинацию эритроцитов, которое варьировало в пределах от 1:256 до 1:512. Определение инфекционного титра штамма «У-13» парвовируса проводили путем титрования его на перевиваемой культуре клеток ППК. Сущность титрования основана на учете ЦПД вируса, то есть способности вируса вызвать деструкцию клеток монослоя. Для титрования парвовируса использовали суточный монослой культуры клеток ППК. Вначале готовили 10-кратные разведения (от 10 до 10"9) вируссодержащего материала на соответствующей питательной среде. Каждое разведение вируса готовили отдельной стерильной пипеткой и вносили по 0,1 мл в 4 флакона с культурой клеток. Предварительно из флаконов сливали ростовую среду. После 1 часа контакта вируса с культурой клеток добавляли 0,9 мл питательной среды. Флаконы помещали в термостат для инкубирования при температуре 37±1С. Одновременно ставили контроль с незараженной культурой клеток. Каждые сутки флаконы просматривали под малым увеличением микроскопа и отмечали ЦПД вируса (условно в крестах). Окончательный учет результатов проводили на 5-е сутки после заражения перевиваемой культуры клеток ППК. Резулыаты титрования считали достоверными при сохранении монослоя в контроле.
Инфекционный титр вируса вычисляли по методу Рида и Менча, который составил 107 0-107 6ТЦД5о/мл Сравнительное изучение антигенных свойств штамма «У-13» Parvovirus suis проводили в РТГА по отношению к антигену производственного штамма ПВС, входящему в состав «Набора для диагностики парвовирусной болезни свиней в РТГА», изготовленный НПО «Нарвак». Для изучения антигенных свойств использовали положительную и отрицательную сыворотки крови свиней, входящие в набор, а также моноспецифические сыворотки крови крыс. Последние получали путем однократной иммунизации животных ГОА-моновакциной против ПВБС, в дозе 0,5 мл, изготовленной нами на основе штамма «У-13» Parvovirus suis. Сыворотки крови получали путем тотального обескровливания их на 14 день. Результаты исследований представлены в таблице №5.
Как видно из таблицы, специфические иммунные сыворотки крови свиней и крыс, полученные соответственно к различным штаммам ПВС взаимодействовали с антигенами обоих вирусов до одинакового титра. Полученные данные свидетельствуют о том, что установлено выраженное родство по антигенной структуре изучаемого штамма «У-13» ПВС и производственного, входящего в диагностический набор.
В результате проведенного серомониторинга было установлено, что 97% исследованных хозяйств оказалось в числе неблагополучных по ПВБС. Поэтому к концу 2004 года вакцинацией против ПВБС было охвачено 100% неблагополучных хозяйств. В некоторых крупных свиноводческих хозяйствах применение вакцин против ПВБС не улучшило существенно эпизоотическую ситуацию по абортам свиноматок. Так, например, в свиноводческом комплексе ГУСП «Совхоз Рощинский», рассчитанном на 54 тыс. голов свиней, несмотря на иммунизацию ассоциированной вакциной против ПВБС и РРСС, в последние 5 лет наблюдались аборты в отдельные месяцы, достигавшие 10-12% у супоросных свиноматок. В связи с этим для установления этиологии болезни были проведены дополнительные исследования.
С этой целью были проведены бактериологические исследования 43 абортированных плодов свиней, 31 мертворожденного поросенка и 3 околоплодных оболочек с применением различных питательных сред: МПА, МПБ, среда Эндо, висмут-сульфитный агар, среда Китта-Тароцци, МПА с1%-ным содержанием глюкозы и 10% дефибринированной крови барана, МПБ с1%-ным содержанием глюкозы и 10% сыворотки крупного рогатого скота. При бактериологическом исследовании из паренхиматозных органов (печень, селезенка, легкие, почки), кишечника и околоплодных оболочек были выделены гемолитические бактерии.
Лабораторный регламент технологии изготовления гидроокисьалюминиевой и эмульгированной ассоциированных вакцин против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней
Результаты проведенного анализа эпизоотической ситуации, лабораторных исследований 35 хозяйств в регионах среднего Поволжья и Предуралья по инфекционным заболеваниям свиноматок с патологией органов воспроизводства свидетельствовали о циркуляции возбудителей парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней в различных сочетаниях. В связи с этим перед нами была поставлена задача, создать средство специфической профилактики против этих заболеваний свиноматок на основе антигенов ПВС, стрептококка и сальмонелл.
Успех производства вакцин во многом обусловлен качеством исходных специфических антигенов. Поэтому культивирование возбудителей болезни является одним из определяющих этапов в технологии производства биопрепаратов.
Наработку биомассы штамма «У-13» ПВС проводили в культуре клеток ППК. В матрацы с суточной культурой клеток ППК вносили парвовирусную суспензию с инфекционным титром 107 ТЦД5о/мл в объеме 2-2,5 мл, и инкубировали в термостате при 37±1С в течение 48-72 часа. В период максимального проявления ЦПД вируса культуру клеток трижды замораживали-оттаивали, объединяли их в бутыли. С целью инактивации в полученную вирусную суспензию штамма «У-13» ПВС, с гемагглютинирующей активностью 512 ГАЕ, добавляли формалин в конечной концентрации 0,5%, перемешивали и оставляли на 24-36 часов при 37 С. Контроль полноты инактивации вирусной суспензии проверяли в культуре клеток ППК путем проведения трехкратных слепых пассажей. Вируссодержащую суспензию считали инактивированной, если в третьем пассаже не обнаруживается ЦПД и культуральная суспензия не обладает гемагглютинирующей активностью.
Для выращивания штамма «С-05» Streptococcus suis использовали МПА с содержанием 1% глюкозы и 5-10% дефибринированной крови барана. К расплавленному стерильному МПА в объеме 200 мл, имеющему температуру не выше 45С, вносили 5 мл 40% стерильного раствора глюкозы и 10-20 мл свежевзятой стерильной дефибринированной крови с соблюдением условий асептики. С целю контроля стерильности изготовленного глюкозо-кровяного агара матрацы выдерживали 18-20 часов в термостате при 37С. При этом среды оставались стерильными. Для получения маточной культуры штамма «С-05» стрептококка лиофильно высушенные бактерии в ампулах суспензировали физиологическим раствором и засевали их на глюкозо-кровяной МПА в чашках Петри. Культивировали посевы при 37С в течение 18 часов. Культуру бактерий смывали физиологическим раствором, проверяли однородность популяции микроорганизмов микроскопией мазков, устанавливали концентрацию 100 млн.м.к. в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича и засевали штамм на глюкозо-кровяной МПА в матрацах. На каждые 200 мл среды вносили по 4 мл маточной культуры и инкубировали 18 часов при температуре 37С. Выросшие колонии смывали 0,85%-ным стерильным раствором хлорида натрия, собирали бактериальную массу в бутыли и проверяли «чистоту» популяции бактерий путем микроскопии мазков. В дальнейшем определяли содержание микробных клеток в 1 мл биомассы, для этого из нее готовили 10-кратные разведения от 10"1 до 10"9 в объеме 0,5 мл. Из двух последних разведений бактериальной массы производили посев по 0,1 мл на глюкозо-кровяной агар из расчета по две чашки Петри на одно разведение и инкубировали при 37С в течение 24 часов. Проводили подсчет выросших колоний и определяли концентрацию бактериальной суспензии по методу Коха (Герхардт Ф., 1983). Для приготовления вакцины использовали бактериальную массу штамма «С-05» стрептококка концентрацией 10 млрд.м.к. в 1 мл. Инактивацию бактериальной взвеси проводили формалином. Для этого на 100 мл бактериальной суспензии добавляли его в количестве 0,5 мл, закрывали резиновыми пробками, перемешивали и оставляли при 37С на 20-24 часа. Контроль полноты инактивации осуществляли путем посева инактивированной бактериальной взвеси на глюкозо-кровяной МПА, МПА, МПБ, МППБ и среду Сабура. Посевы со средами выдерживали в термостате при 37С, по истечению 10 суток питательные среды оставались стерильными.
Для получения бактериальной массы штамм «К-03» Salmonella choleraesuis культивировали в тонком слое МПА. Среду разливали в матрацы по 200 мл и стерилизовали при 0,5 атмосфер - 110 С в течение 30 минут. С целью контроля стерильности матрацы с МПА выдерживали 18-20 часов в термостате, среды оставались стерильными. Проверенный и подготовленный штамм «К-03» сальмонелл для получения маточной культуры высевали на пробирки со скошенным агаром. После 18-20 часов выращивания при температуре 37С и проверки на однородность популяции бактерий (путем микроскопии мазков) производили смыв физиологическим раствором (10-15 мл на одну пробирку) и делали пересев на МПА в матрацах (смыв с одной пробирки на 2-3 матраца). Через 24 часа выросшие колонии смывали 0,85%-ным стерильным раствором хлорида натрия, проверяли «чистоту» роста культуры микроскопией препарата-мазка, морфологическую и серологическую типичность и устанавливали концентрацию 10 млрд. м. к. в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. С целью инактивации сальмонелл добавляли к бактериальной массе формалин из расчета 0,5 мл на 100 мл. После перемешивания, суспензии ставили в термостат на трое суток при 37С. Затем брали пробу для контроля на полноту инактивации, которую проводили путем посева инактивированных бактериальных взвесей на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабура. В течение 10 суток при температуре 37С на питательных средах роста культуры не обнаруживали.
Показатели уровня клеточного иммунитета кроликов, иммунизированных ассоциированной вакциной против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней
Клетки участвующие в иммунном ответе, как иммунокомпетентные, так и выполняющие вспомогательные функции, морфологически и функционально гетерогенны. Как известно иммунокомпетентные клетки представлены двумя основными популяциями - тимусзависимыми (Т) и тимуснезависимыми (бурсозависимыми - В) лимфоцитами, которые в свою очередь подразделяются на субпопуляции, четко различающиеся по поверхностным маркерам (рецепторам) и функциональным свойствам. Среди Т-лимфоцитов, помимо эффекторов, опосредующих клеточные иммунные реакции, существуют также Т-помощники (хелперы) и Т-супрессоры, а среди В-лимфоцитов, кроме предшественников антителопродуцентов, которые включаются в антителогенез тимуснезависимыми (В)) и тимусзависимыми (В2) лимфоцитами, выявлены также клетки с антигенпредставляющей, супрессорной и хелперной функциями. Несколько типов клеток - макрофаги, моноциты, ретикулоциты -играют вспомогательную роль при инициации иммунного ответа. Следовательно, при иммунологических исследованиях существенное значение имеет определение количества Т- и В-лимфоцитов в крови (Пастер Е.У. и др., 1989; Новиков Б.В. и др., 1993).
Изучение особенностей клеточного иммунитета проводилось на девяти кроликах после иммунизации двумя вариантами инактивированной ассоциированной вакцинами. Кроликов первой опытной группы иммунизировали вакцинным препаратом, изготовленным на основе МА в дозе 2 мл. Кроликов второй опытной группы иммунизировали вакцинной, депонированной на ГОА в дозе 3 мл. Кроликов третьей контрольной группы не иммунизировали.
Вакцинные препараты вводили двукратно с интервалом 14 дней внутримышечно, в равных объемах для первой и второй прививки. Взятие крови для исследований осуществляли из ушной вены до иммунизации и чере 14 дней после каждой вакцинации.
Выделение лимфоцитов из крови кроликов проводили на градиенте плотности методом центрифугирования. Идентификацию и процентное соотношение Т- и В-лимфоцитов проводили в одном препарате методом Е- РОК и ЗСз-РОК. Результаты исследований количественных характеристик Т- и В-лимфоцитов в периферической крови кроликов до вакцинации, через 14 дней после первой и второй вакцинации представлены в таблице 10.
Данные, приведенные в таблице 10, показывают что, процент Т-лимфоцитов составил (М±т) до вакцинации в первой группе 52,9±1,8; во второй группе - 52,7±1,6; в третьей группе - 52,1 ±0,2; после первой вакцинации в первой группе - 55,7±2,0; во второй группе - 55,2±1,5; в третьей группе -52,3±0,1; после второй вакцинации в первой группе - 57,4±1,3; во второй группе - 58,2±0,9; в третьей группе - 52,6±0,4.
Процент В-лимфоцитов составил (М±т) до вакцинации в первой группе 16,9±0,2; во второй группе 16,4±0,4; в третьей группе 16,5±0,4; после первой вакцинации в первой группе 19,9±0,1; во второй группе 19,2±0,2; в третьей группе 16,7±0,2; после второй вакцинации в первой группе 22,9±1,4; во второй группе 23,5±0,5; в третьей группе 16,7±0,2.
Следовательно, уровень Т-лимфоцитов в крови кроликов статистически достоверно повышался у животных первой и второй групп после второй вакцинации (Р 0,01). Статистически достоверное увеличение В-лимфоцитов у животных первой и второй групп, отмечалось после первой и второй вакцинации (Р 0,001) по отношению к контрольной группе. Разность между результатами первой и второй опытных групп статистически недостоверна (Р 0,05).
В ходе эксперимента за животными велось ежедневное клиническое наблюдение, в результате которого было установлено, что двукратное применение вакцин не вызывало осложнений и не оказывало отрицательного влияния на общее состояние организма. На месте введения биопрепаратов наблюдали незначительную припухлость, которая исчезала через 10-14 дней у животных привитых вакциной, депонированной на ГОА и через 4-5 недели у животных привитых масляной вакциной. По окончанию опыта было проведено вскрытие подопытных кроликов с экспериментальной целью. При вскрытии кроликов иммунизированных, соответственно, эмульсионной и сорбированной ассоциированными вакцинами, патологоанатомических изменений в органах и тканях обнаружено не было.
Таким образом, результаты проведенных исследований по изучению ассоциированной инактивированной вакцины против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней на кроликах показали, что оба варианта биопрепаратов после двукратного введения лабораторным животным индуцируют синтез специфических антител в организме, обеспечивая формирование напряженного иммунитета.
